Thiết lập quy trình giám định hồ sơ dna short tandem repeats (str)

TP.HCM HÀ THẾ BÌNH THIẾT LẬP Y Ì M ỊNH HỒ SƠ DNA SHORT TANDEM REPEATS (STR) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 60 42 80 LUẬ VĂ SĨ Tp Hồ Chí Minh - Năm 2016 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM Cán hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Cán chấm nhận xét 1: PGS.TS.Nguyễn Tiến Thắng Cán chấm nhận xét : TS.Võ Đình Lệ Tâm Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 20 tháng 06 năm 2016 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Chủ tịch: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng Phản biện : PGS.TS.Nguyễn Tiến Thắng Phản biện : TS Võ Đình Lệ Tâm Ủy Viên : TS Hoàng Anh Hoàng Thư ký : TS Huỳnh Ngọc Anh Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA CN HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Hà Thế Bình MSHV: 12310722 Ngày, tháng, năm sinh: 10/11/1980 Nơi sinh: Tiền Giang Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60 42 80 I TÊN ĐỀ TÀI: Thiết lập quy trình giám định hồ sơ DNA Short Tandem Repeats (STR) II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:  Nhiệm vụ : Thiết lập quy trình giám định hồ sơ DNA Short Tandem Repeats  Nội dung : Sử dụng kỹ thuật PCR điện di mao quản để khảo sát kiểu hình STR Lập hồ sơ DNA người Lập bảng tần suất DNA Khảo sát ban đầu dạng STR cho người Việt Nam Thăm dị quy trình kỹ thuật xét nghiệm hồ sơ DNA III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 06/07/2015 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Tp HCM, ngày tháng năm 2016 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO Luận văn Thạc sĩ LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Thầy Cô dạy dỗ em từ thuở ấu thơ ngày hơm Trong đó, em xin cảm ơn Thầy Cô môn Công Nghệ Sinh Học, khoa Cơng nghệ Hóa học trường Đại học Bách Khoa Tp HCM quan tâm, dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho em năm học cao học Em cảm ơn cô Lê Thị Thủy Tiên dạy dỗ, truyền đạt kiến thức kỹ suốt thời gian em làm thí nghiệm trường Bách Khoa Hơn hết, em kính gửi lịng tri ân sâu sắc đến Cô Nguyễn Thúy Hương, khơng tận tình dạy dỗ, hướng dẫn em thực đề tài khoá luận tốt nghiệp mà cịn ln quan tâm, động viên theo suốt chặng đường từ lúc em học đại học đến cao học, cô trang bị cho em kiến thức lẫn tự tin chuyên môn Cảm ơn anh Đặng Mai Anh Tuấn Trung Tâm Pháp Y TPHCM, người bạn, người đồng nghiệp, người thầy, tận tình dạy tạo điều kiện cho em hồn thành tốt khoá luận tốt nghiệp Cuối cùng, xin trân trọng gửi lời biết ơn chân thành đến Cha Mẹ người cho em sống này, vượt qua bao gian khó nhọc nhằn để ni nấng dạy dỗ em nên người Cảm ơn gia đình nhỏ động lực chỗ dựa quan trọng để tơi cố gắn đến ngày hơm Tp Hồ Chí Minh, ngày 12 tháng 06 năm 2016 Hà Thế Bình Trang i Luận văn Thạc sĩ TĨM LƢỢC Trong xã hội phát triển, việc nhận dạng xác cá nhân cụ thể điều cần thiết Ngày ngành Sinh học phân tử giúp việc giám định trở nên dễ dàng xác mức độ DNA – STR STR “dấu vân tay DNA” bất biến cá thể Trong phạm vi đề tài này, chúng tơi dùng AmpFℓSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit để thiết lập liệu kiểu hình STR 16 locus: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1P0, Amelogenin, D5S818, FGA, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539 D2S1338 198 người Việt Nam, từ lập hồ sơ DNA tính tần suất alen để ứng dụng vào giám định quan hệ huyết thống, nhận dạng cá thể hay xác định thủ phạm Cũng qua nghiên cứu này, ghi nhận thống với khảo cứu khác giới: alen 9.1 11.1 locus D7S820, alen 11.1 locus D13S317và alen 14.3 locus D13S317 nét đặc trưng người châu Á có người Việt Nam Trang ii Luận văn Thạc sĩ ABSTRACT In developmental procession of society, it‟s really necessary to identify an individual exactly and fastly Today we can approach this easily by using a robust molecular biological application – STR profile STR profile is a unchangeable fingerprinting of certain individual In our research, we use AmpFℓSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit for establishing STR profile with 16 loci D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1P0, Amelogenin, D5S818, FGA, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539 D2S1338 from 198 Vietnamese and calculate frequency of each allele as a basic background of paternity testing, identifying individual or certain suspects Like other international research, in other view of this research we also confirm that in Vietnamese population also have some specific allele: 9.1 and 11.1 of D7S820, 11.1 of D13S317 Trang iii Luận văn Thạc sĩ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, số liệu kết nghiên cứu nêu luận văn trung thực, có sai sót tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Tp Hồ Chí Minh, ngày 12 tháng 06 năm 2016 Hà Thế Bình Trang iv Luận văn Thạc sĩ Mục lục  Lời cảm ơn .i  Tóm tắc ii  Abstract iii  Lời cam đoan …………………………………………………………… …iv  Mục lục…………………………………………………….….………… …v  Danh mục chữ viết tắt ………………………………………………… ….ix  Danh mục bảng sơ đồ………………………………………………… …x  Danh mục hình…………………………………………………………….…xi  TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI  MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU  NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc DNA 1.2 Dấu vân tay DNA 1.2.1 Tiểu vệ tinh (Minisatellites) 1.2.2 Vi vệ tinh (Microsatellites) 1.3 Phương pháp STR-PCR 1.3.1 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR 1.3.2 Enzym Amplitaq Gold DNA Polymerase 10 1.3.3 Multiplex PCR 11 Trang v Luận văn Thạc sĩ 1.3.4 Những thuận lợi bất lợi ứng dụng kỹ thuật PCR giám định mẫu pháp y 12 1.4 Một số STR thường dùng 12 1.4.1 Những đặc tính mong muốn STR dùng pháp y 13 1.4.2 Thang alen dùng số kit STR thương mại 14 1.4.3 Những Kit STR thương mại hóa 15 1.4.4 Trang web liệu STRbase 16 1.5 Các kỹ thuật sử dụng việc tạo hồ sơ DNA 16 1.5.1 Đặc điểm 16 locus STR khảo sát 16 1.5.2 Kỹ thuật multiplex PCR 18 1.5.3 Kỹ thuật điện di mao quản tự động 19 1.5.4 Kỹ thuật phân tích hồ sơ DNA 19 1.6 Tình hình nghiên cứu STR Việt nam 23 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Thiết kế nghiên cứu 26 2.2 Địa điểm thời gian 26 2.3 Vật liệu 26 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.3.2 Vật liệu cho tách chiết DNA 27 2.3.3 Vật liệu kiểm tra nồng độ DNA 27 2.3.4 Vật liệu thực kỹ thuật PCR STR 27 2.3.5 Vật liệu giải trình tự STR 28 2.4 Lưu đồ thí nghiệm 29 Trang vi Luận văn Thạc sĩ 2.5 Các phương pháp khảo sát 29 2.5.1 Cách lấy mẫu : 30 2.5.2 Phương pháp ly trích màng silica 30 2.5.3 Phương pháp khảo sát nồng độ DNA 30 2.5.4 Phương pháp nhân 16 locus STR (PCR STR) 31 2.5.5 Phương pháp điện di mao quản phân tích đoạn 34 2.5.6 Phương pháp phân tích kết 35 2.5.7 Phương pháp tính tần suất alen 36 CHƢƠNG KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 37 3.1 Kết ly trích mẫu 37 3.2 Kết thực điện di mao quản, phân tích lập hồ sơ DNA 39 3.3 Kết tính tần suất alen 16 locus STR 45 3.3.1 Khảo sát dạng STR đặc trưng cho người Việt Nam 48 3.4 Tóm tắc quy trình giám định hồ sơ DNA STR 51 CHƢƠNG KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 54 4.1 Kết luận 54 4.2 Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Phụ lục 1: Hồ sơ DNA 60 Phụ lục :Tần suất alen 81 Phụ lục : Kết liệu điện di đồ mẫu chứa alen có khả đặc trưng cho người Việt Nam 94 Trang vii Luận văn Thạc sĩ Trang 98 Luận văn Thạc sĩ Trang 99 Luận văn Thạc sĩ Trang 100 Luận văn Thạc sĩ Trang 101 Luận văn Thạc sĩ Trang 102 Luận văn Thạc sĩ Trang 103 Luận văn Thạc sĩ Trang 104 Luận văn Thạc sĩ Trang 105 Luận văn Thạc sĩ Phụ lục 4: Các bƣớc ly trích DNA QIAamp DNA Investigator kit hãng QIAGEN Chúng dùng QIAamp DNA Investigator kit để ly trích DNA gen người [34] Bộ kit sử dụng màng silica với nồng độ muối cao độ pH định để hấp thu acid nucleic khỏi hỗn hợp thành phần khác tế bào bị ly giải Quá trình gồm số bước quy trình ly trích DNA dùng silica khác như: ly giải, gắn màng, rửa, thoi thực cách chuyển cột có gắn màng silica nên DNA đích thu tube khơng chứa chất ức chế dịch DNA ly trích Điều tạo điều kiện thuận lợi cho bước nhân DNA theo sau  Thành phần QIAamp DNA Investigator Kit :  50 cột QIAamp MinElute®  200Tube thu nhận ml  Đệm ATL 50 ml  Đệm Buffer AL 33 ml  Đệm AW1 19 ml (đậm đặc)  Đệm AW2 13 ml(đậm đặc)  Buffer ATE 12 ml  Chất mang RNA 310 µg  Proteinase K 1.25 ml  Sổ tay hướng dẫn  Các bƣớc chuẩn bị Máy ủ nhiệt kèm lắc rung (thermal cycle), máy ly tâm, máy vortex, máy hút chân không tủ hút micropipette, tube 1,5ml, tube 2ml Chuẩn bị hóa chất:  Pha Buffer AW1: cho 25 ml ethanol (96-100%) vào lọ có chứa sẵn 19 ml Buffer AW1, trộn đều, đánh dấu lên nhãn lọ thêm ethanol Trang 106 Luận văn Thạc sĩ  Pha Buffer AW2: cho 30 ml ethanol (96-100%) vào lọ có chứa sẵn 13 ml Buffer AW2, trộn đều, đánh dấu lên nhãn lọ thêm Ethanol Lưu ý:Tất hóa chất giử nhiệt độ phịng, ghi ngày sử dụng lên nhãn lọ sử dụng lần a Các bƣớc ly trích DNA từ mẫu máu toàn phần Hút 1-100 ml máu toàn phần vào tube ly tâm1,5 ml Thêm thể tích đệm ATL cho thể tích mẫu ALT 100ml Thêm 10 ml proteinase K Thêm 100 ml đệm AL, đóng nắp, trộn máy vortex 15s Lưu ý: Nếu thể tích mẫu nhỏ 10 ml, cho thêm 1ml chất mang RNA(1µg/1ml, dung mơi hịa tan ALT) Ủ lắc rung 900rpm 55oC 10 phút Ly tâm ngắn để làm rơi giọt dính nắp xuống tube Thêm 150µl ethanol (96-100%), đóng nắp, vortex 15 giây, ủ phút nhiệt độ phòng Ly tâm ngắn để làm rơi giọt dính nắp xuống tube Hút chuyển tồn dịch ly giải từ bước 16 sang cột QIAamp MiniElute column (trong tube thu hồi dịch 2ml) không làm ướt miệng cột 10 Đóng nắp, ly tâm phút /8000 rpm Đặt cột QIAamp MiniElute column vào tube thu hồi dịch 2ml mới, bỏ tube chứa dịch chảy qua 11 Mở nắp cột thêm vào 500µl Buffer AW1, Đóng nắp, ly tâm phút /8000 rpm Đặt cột QIAamp MiniElute column vào tube thu hồi dịch 2ml mới, bỏ tube chứa dịch chảy qua 12 Mở nắp cột thêm vào 700µl Buffer AW2, khơng làm ướt miệng cột Đóng nắp, ly tâm phút /8000 rpm Đặt cột QIAamp MiniElute column vào tube thu hồi dịch 2ml mới, bỏ tube chứa dịch chảy qua 13 Mở nắp cột thêm vào 700µl ethanol (96-100%) Đóng nắp, ly tâm phút /8000 rpm Đặt cột QIAamp MiniElute column vào tube thu hồi dịch 2ml mới, bỏ tube chứa dịch chảy qua Trang 107 Luận văn Thạc sĩ 14 Ly tâm phút /13000 rpm để làm khơ màng hồn tồn 15 Đặt cột QIAamp MiniElute column vào tube 1,5ml sạch, bỏ tube chứa dịch chảy qua Cẩn thận mở nắp cột ủ nhiệt độ phòng /10 phút 560C/3 phút 16 Thêm vào 20-50 µl đệm ATE nước cất 17 Chú ý: Đảm bảo Buffer ATE nước cất nhiệt độ (15-25°C) Cho ATE nước cất vào màng để đảm bảo thoi hết DNA gắn màng 18 Đóng nắp ủ nhiệt độ phịng (15-25°C) phút Ly tâm 14.000 rpm/1 phút Ủ cột MinElute QIAamp phút nhiệt độ phòng trước ly tâm thường làm tăng khả thoi, thu lượng DNA nhiều 19 Sau bỏ cột MinElute QIAamp, ta thu dịch gốc DNA tube thu b Các bƣớc ly trích DNA từ mẫu niêm mạc má Đặt đầu tâm thấm mẫu vào tube 0.2ml Thêm 400 µl đệm ATL, 20 µl proteinase K Sau đó, đóng nắp trộn 10s Đặt tube 2ml thermomixer ủ 56°C/900 rpm /1giờ Ly tâm nhanh để làm rơi giọt dính nắp xuống tube Thêm 400 ml đệm AL, đóng nắp, trộn máy vortex 15 s Đặt tube 2ml thermomixer ủ 70°C/900 rpm /10giờ Ly tâm nhanh để làm rơi giọt dính nắp xuống tube Thêm 200µl ethanol (96-100%), đóng nắp, vortex 15 giây Ly tâm nhanh để làm rơi giọt dính nắp xuống tube 10 Hút chuyển toàn dịch ly giải sang cột QIAamp MiniElute column (trong tube thu hồi dịch 2ml) 11 Đóng nắp, ly tâm phút /8000 rpm Đặt cột QIAamp MiniElute column vào tube thu hồi dịch 2ml mới, bỏ tube chứa dịch chảy qua Trang 108 Luận văn Thạc sĩ 12 Mở nắp cột thêm vào 500µl Buffer AW1 Đóng nắp, ly tâm phút /8000 rpm Đặt cột QIAamp MiniElute column vào tube thu hồi dịch 2ml mới, bỏ tube chứa dịch chảy qua 13 Mở nắp cột thêm vào 700µl Buffer AW2 Đóng nắp, ly tâm phút /8000 rpm Đặt cột QIAamp MiniElute column vào tube thu hồi dịch 2ml mới, bỏ tube chứa dịch chảy qua 14 Mở nắp cột thêm vào 700µl ethanol (96-100%) Đóng nắp, ly tâm phút /8000 rpm Đặt cột QIAamp MiniElute column vào tube thu hồi dịch 2ml mới, bỏ tube chứa dịch chảy qua 15 Ly tâm phút /13000 rpm để làm khơ màng hồn tồn 16 Đặt cột QIAamp MiniElute column vào tube 1,5ml sạch, bỏ tube chứa dịch chảy qua Cẩn thận mở nắp cột ủ nhiệt độ phòng /10 phút 56oC/3 phút 17 Thêm vào 20-50 µl đệm ATE nước cất 18 Chú ý: Đảm bảo Buffer ATE nước cất nhiệt độ (15-25°C) Cho ATE nước cất vào màng để đảm bảo thoi hết DNA gắn màng 19 Đóng nắp ủ nhiệt độ phịng (15-25°C) phút Ly tâm 14.000 rpm/1 phút Ủ cột MinElute QIAamp phút nhiệt độ phòng trước ly tâm thường làm tăng khả thoi, thu lượng DNA nhiều hơn.Sau bỏ cột MinElute QIAamp, ta thu dịch gốc DNA tube thu Trang 109 Luận văn Thạc sĩ Phụ lục : Các bƣớc PCR STR DNA AmpFℓSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit Khởi động Thiết bị luân nhiệt GeneAmp® PCR System 9700 Kiểm tra chương trình phản ứng PCR cài đặt sắn thiết bị  Chương trình cài đặt phản ứng PCR STR Bƣớc ủ 95 °C/11 phút 29 chu kỳ Biến tính Kéo dài Kết thúc kéo dài 94 °C/20 giây 59 °C/ phút 60 °C/10 phút Kết thúc °C 24 Chuẩn bị thành phần phản ứng PCR - AmpFlSTR® Identifiler® Plus Mix - AmpFlSTR® Identifiler® Plus Primer Dùng Micropipette hút thể tích thành phần phản ứng vào tube PCR 0.2 ml vô trùng Các thao tác thực tủ an toàn sinh học  Thành phn phn ng - AmpFlSTRđ Identifilerđ Plus Mix : 10àl - AmpFlSTRđ Identifilerđ Plus Primer : 5àl - Trn hn hợp phản ứng máy vortex giây ly tâm nhanh Chuẩn bị mẫu - DNA mẫu : 10µl( nồng độ 1ng/µl) (pha lỗng nước cất khử ion) - Mẫu chứng âm : 10µl nước cất khử ion - Mẫu chứng dương : 10µl ( nồng độ 0.1ng/µl nước cất khử ion) Dùng Micropipette hút thể tích mẫu vào tube PCR 0.2 có sẳn dung dịch phản ứng Tổng thể tích phản ứng : 25 µl Trộn hỗn hợp phản ứng máy vortex giây ly tâm 3000 vịng/20 giây để tránh bọt khí Đặt tube PCR phản ứng vào thiết bị, cải đặt chương trình khởi động trình luân nhiệt Trang 110 Luận văn Thạc sĩ Phụ lục : Các bƣớc thực điện di mao thiết bị điện di mao quản 3130 Genetic Analyzer Khởi động Thiết bị điện di mao quản 3130 Genetic Analyzer Chuẩn bị thành phần điện di - GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard - Hi-Di ™ Formamide - Mẫu thang chuẩn(allelic ladder)  Thành phần chạy điện di mao quản: Thành phần phản ứng Thể tích phản ứng (μL) GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard 0.3 Hi-Di ™ Formamide 8.7 Mẫu thang chuẩn(allelic ladder) Tổng thể tích 10 Dùng Micropipette hút thể tích GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard Hi-Di ™ Formamide vào plate 0.2 ml vô trùng Các thao tác thực tủ an toàn sinh học - Trộn hỗn hợp phản ứng máy vortex giây ly tâm nhanh Chuẩn bị mẫu - DNA mẫu : 1µl - Allelic ladder: 1µl Trộn hỗn hợp hỗn hợp phản ứng Micropipettevà ly tâm nhanh để tránh bọt khí Biến tính: - Gia nhiệt plate mẫu lên nhiệt độ lên 95oC phút - Đặt plate mẫu vào đá lạnh phút Đặt plate mẫu vào khay mẫu thiết bị, cải đặt chương trình, đặt tên khởi động trình điện di Thu kết thô Trang 111 Luận văn Thạc sĩ PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG - Họ tên: HÀ THẾ BÌNH - Ngày, tháng, năm sinh: 10/11/1980 - Địa liên lạc: B20/10 Xã Hưng Long, Huyện Bình Chánh,TPHCM Nơi sinh: Tiền Giang QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO - 04/2004- 10/2010 : Học đại học ngành Cơng Nghệ Hóa Hữu Cơ - ĐH Bách Khoa – TP HCM - 08/2012 đến : Học cao học ngành Công Sinh Học - ĐH Bách Khoa – TP HCM Q TRÌNH CƠNG TÁC 2005-2011: Công ty TNHH Nam Khoa - Q7 TP HCM 2012-2013: Phòng Sinh Học Phân Tử - Trung tâm Pháp Y TP HCM 2014 đến nay: Trung tâm Kiểm Chuẩn Xét Nghiệm TPHCM Trang 112 ... I TÊN ĐỀ TÀI: Thiết lập quy trình giám định hồ sơ DNA Short Tandem Repeats (STR) II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:  Nhiệm vụ : Thiết lập quy trình giám định hồ sơ DNA Short Tandem Repeats  Nội dung... trích Khảo sát nồng độ DNA Phản ứng PCR STR Điện di giải trình tự STR Khơng lập hồ sơ DNA Xử lý kết chương trình tin sinh học Lập hồ sơ DNA STR Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bƣớc lập hồ sơ DNA STR 2.5 Các phƣơng... Trang 24 Luận văn Thạc sĩ ? ?Thiết lập quy trình giám định hồ sơ DNA STR ” Đề tài tạo cở sở liệu tần suất alen ID người mà cịn tạo quy trình chuẩn phân tích hồ sơ DNA chủ yếu từ mẫu máu mẫu quệt