Đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase của Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.)

người ta đã chiết được các triterpen glycosid và các polysaccharid có tác dụng lên hệ miễn dịch giúp điều trị ung nhọt, cải thiện trí nhớ. Ở Việt Nam, chi Codonopsis có 3- 4 loài, tro[r]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC

NGÔ HÀ LINH TRANG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA

HỒNG ĐẢNG SÂM

(Codonopsis javanica (Blume) Hook f.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC

NGÔ HÀ LINH TRANG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA

HỒNG ĐẢNG SÂM

(Codonopsis javanica (Blume) Hook f.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA: QH2015.Y

Người hướng dẫn 1: PGS.TS BÙI THANH TÙNG Người hướng dẫn 2: ThS ĐẶNG KIM THU

LỜI CẢM ƠN

Trong q trình nghiên cứu, hồn thành khóa luận với đề tài “Đánh giá khả chống oxy hóa ức chế enzym α-glucosidase Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook f.)”, nhận giúp đỡ, hướng dẫn nhiệt tình PGS.TS Bùi Thanh Tùng ThS Đặng Kim Thu Bên cạnh giảng dạy tâm huyết thầy cô giáo Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội khích lệ, cổ vũ gia đình bên cạnh động viên, tạo điều kiện thuận lợi để tơi học tập, nghiên cứu cho việc hồn thành khóa luận

Với tình cảm chân thành, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gửi lời cảm ơn trân trọng tới thầy cô hướng dẫn tơi khóa luận PGS.TS Bùi Thanh Tùng ThS Đặng Kim Thu – Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng Khoa Y Dược, người khơng tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành đề tài mà cịn định hướng cho đường nghiệp tới

Nhân dịp này, chân thành cảm ơn Khoa Y Dược trang bị cho sở vật chất cho phép sử dụng dụng cụ, phịng thí nghiệm để hồn thành khóa luận Trong q trình thực tơi nhận giúp đỡ tận tình thầy mơn Dược lý – Dược lâm sàng, Bào chế, Dược liệu – Dược cổ truyền Hóa dược – Kiểm nghiệm

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh động viên, khích lệ tơi lúc khó khăn q trình thực khóa luận

Mặc dù thân nỗ lực, cố gắng song khó tránh khỏi hạn chế, thiếu sót Kính mong q thầy, giáo đóng góp thêm ý kiến để khóa luận hồn thiện

Tơi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng năm 2020 Tác giả khóa luận

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC BẢNG

MỞ ĐẦU

Chương TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan bệnh tiểu đường

1.1.1 Khái niệm

1.1.2 Phân loại đái tháo đường

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh đái tháo đường tuýp

1.1.4 Dịch tễ học

1.1.5 Các biến chứng

1.1.6 Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường

1.2 Enzym α-glucosidase chất ức chế enzym α-glucosidase

1.2.1 Tổng quan enzym chất ức chế enzym

1.2.2 Enzym α-glucosidase

1.2.3 Các chất ức chế enzym α-glucosidase

1.3 Q trình oxy hóa thể chất chống oxy hóa

1.3.1 Khái niệm

1.3.2 Các chất chống oxy hóa

1.4 Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase tác dụng chống oxy hóa in vitro 11

1.4.1 Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro 11

1.4.2 Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro 12

1.5 Tổng quan Hồng đảng sâm 13

1.5.1 Nguồn gốc, phân loại 13

1.5.2 Đặc điểm thực vật 14

1.5.3 Bộ phận dùng 15

1.5.4 Thành phần hóa học 15

Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 18

2.1.3 Hóa chất, dung mơi 18

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp chiết xuất 19

2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa cao rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH 20

2.3.3 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao rễ Hồng đảng sâm 21

2.4 Phương pháp xử lí số liệu 22

Chương KẾT QUẢ 24

3.1 Quy trình chiết xuất phân đoạn dịch chiết cao rễ Hồng đảng sâm 24

3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH 25

3.3 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm 27

Chương BÀN LUẬN 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DMSO Dimethyl sulfoxid

DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

ĐTĐ Đái tháo đường

EtOAc Ethyl acetat

EtOH Ethanol

FDA Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ

(Food and Drug Administration)

IC50 Nồng độ ức chế 50%

(Inhibitory Concentration 50%) iNOS Nitric oxide synthase cảm ứng

(Inducible nitric oxide synthase) IU Đơn vị quốc tế (International Unit)

n-BuOH n-buthanol

pNP p-nitrophenol

pNPG p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid

RNS Nitrogen hoạt tính

ROS Oxy hoạt tính

RSS Sulfur hoạt tính

SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình Tên Trang

1.1 Cơ chế hoạt động enzym α-glucosidase

1.2 Nguyên tắckhảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 12

1.3 Hình ảnh Hồng đảng sâm 12

1.4 Một số hợp chất phân lập từ rễ Hồng đảng sâm 16

2.1 Mẫu dược liệu Hồng đảng sâm 18

2.2 Sơ đồ chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm 20

3.1 Sơ đồ sản phẩm chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm 24

3.2

Đồ thị biểu diễn khả chống oxy hóa cao chiết toàn phần phân đoạn cao rễ Hồng đảng sâm nồng độ khác

26

3.3 Đồ thị biểu diễn khả chống oxy hóa ascorbic in vitro acid 27

3.4

Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro

của cao toàn phần phân đoạn rễ Hồng đảng sâm nồng độ khác

28

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên Trang

1.1 Nguyên nhân ĐTĐ nguyên phát

1.2 Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase

1.3 Các chất chống oxy hóa nội sinh

1.4 Cấu trúc hóa học, ứng dụng số chất chống oxy hóa tổng hợp 10

3.1

Khả chống oxy hóa in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết cao rễ Hồng đảng sâm chất đối chứng nồng độ khác

25

3.2

Khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao toàn phần, phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm chất đối chứng nồng độ khác

1 MỞ ĐẦU

Trên toàn giới, đái tháo đường ngày tăng tỷ lệ, mức độ ảnh hưởng lên vấn đề sức khỏe khác, nguyên nhân gây tử vong hàng đầu, gây nhiều biến chứng trầm trọng ảnh hưởng lớn đến chất lượng sống Số lượng người mắc đái tháo đường tăng gấp đơi vịng thập kỉ gần Bên cạnh đó, với việc tăng sử dụng thực phẩm khơng thích hợp, khơng hoạt động thể lực trẻ em, bệnh ĐTĐ tuýp có xu hướng tăng trẻ em, trở thành vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng Bệnh ĐTĐ gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận, cắt cụt chi [6]

Mặc dù có nhiều tiến điều trị bệnh tiểu đường thuốc tân dược đường uống, việc nghiên cứu phát triển thuốc tiếp tục chi phí cao tác dụng phụ gây cho người bệnh Tại Việt Nam, khuynh hướng quay với thiên nhiên, tìm tịi, phát triển thuốc Đơng y thuốc Y học cổ truyền ngày trọng nhiều kết hợp với tiến khoa học kỹ thuật y học Với lãnh thổ trải dài từ Bắc tới Nam, thuộc khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, nước ta có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đa dạng Việc sử dụng thảo dược y học có nhiều mục đích sở cho công nghiệp xanh công dụng thảo dược nhắm đến nhiều đích, hỗ trợ điều trị nhiều bệnh Các nhà khoa học tiến hành nhiều nghiên cứu chứng minh loại thảo dược có tác dụng hạ glucose máu, mang lại nhiều kết khả quan, đưa vào sử dụng lâm sàng Những lồi thảo dược có đặc điểm chứa lượng lớn hợp chất tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym α-glucosidase Đây hai đích thường sử dụng nghiên cứu tác dụng thảo dược hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường

Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica) vị thuốc cổ truyền sử dụng phổ biến nhiều nước châu Á Trung Quốc, Nhật Bản,… [45] Từ nhiều loài thuộc chi Codonopsis C.lanceolata, C.pilosula, C.ussuriesis, C subglobosa

người ta chiết triterpen glycosid polysaccharid có tác dụng lên hệ miễn dịch giúp điều trị ung nhọt, cải thiện trí nhớ Ở Việt Nam, chi Codonopsis có 3-4 lồi, loại Hồng đảng sâm Việt Nam Codonopsis javanica sử dụng từ lâu dân gian với nhiều cơng dụng q điều hịa huyết áp, tăng cường sinh lực Các nghiên cứu phân lập thành phần hóa học rễ Hồng đảng sâm cho kết có nhiều nhóm chất quý từ tự nhiên axit phenolic, flavonoid, alcaloid,

2

1 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro theo phương pháp DPPH phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook f.)

3

Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh tiểu đường

1.1.1.Khái niệm

Bệnh đái tháo đường bệnh rối loạn chuyển hóa khơng đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết khiếm khuyết tiết insulin, tác động insulin, hai Tăng glucose mạn tính thời gian dài gây nên rối loạn chuyển hóa carbohydrate, protide, lipide, gây tổn thương nhiều quan khác nhau, đặc biệt tim mạch máu, thận, mắt, thần kinh [6]

1.1.2.Phân loại đái tháo đường Đái tháo đường tuýp

Đái tháo đường tuýp tế bào beta bị phá hủy nên bệnh nhân không cịn cịn insulin, 95% chế tự miễn (tuýp 1A), 5% vô (tuýp1 B)

Đái tháo đường tuýp

Đái tháo đường tuýp suy giảm chức tế bào beta tụy tiến triển tảng đề kháng insulin

Bảng 1.1. Nguyên nhân ĐTĐ nguyên phát

Các nguyên nhân ĐTĐ tuýp ĐTĐ tuýp

Yếu tố nguy Kháng nguyên HLA-DR3, HLA-DR4

Tiền sử gia đình Đặc tính dân tộc

Ăn nhiều, tập luyện thể lực Nhiễm độc

Yếu tố khởi phát

Nhiễm virus

Stress chuyển hóa/ u cầu q mức

Béo phì

Stress chuyển hóa/ yêu cầu mức

Yếu tố bệnh sinh Phá hủy đảo tụy theo chế tự miễn

Các tế bào đảo tụy thối hóa/ suy yếu dần

Giảm receptor insulin

Đái tháo đường thai kỳ

ĐTĐ thai kỳ ĐTĐ chẩn đoán tháng tháng cuối thai kỳ khơng có chứng ĐTĐ tuýp 1, tuýp trước

Thể bệnh chuyên biệt ĐTĐ - Đái tháo đường thứ phát

4

insulin, khiếm khuyết nhiễm sắc thể thường, di truyền theo gen tế bào beta; hội chứng bất thường nhiễm sắc thể khác, [3, 4, 6]

1.1.3.Cơ chế bệnh sinh đái tháo đường tuýp

Hai yếu tố chế bệnh sinh kháng insulin rối loạn tiết insulin

1.1.3.1. Cơ chế liên quan đến kháng insulin

Kháng insulin tình trạng giảm tính nhạy cảm quan đích với insulin

Kháng insulin nhiều nguyên nhân: tế bào beta tiết insulin bất thường, có chất đối kháng insulin lưu thông máu như: glucagon, cortisol, catecholamine, hormon GH, axit béo tự (FFA), kháng thể kháng insulin, kháng thể kháng thụ thể insulin, resistin, TNF alpha (Tumor Necrosis factor alpha), IL-6 (Interleukin-6) [20]

1.1.3.2. Cơ chế liên quan đến rối loạn tiết insulin

Khi mắc tiểu đường tuýp 2, insulin mức bình thường tăng lên tốc độ tăng không tương ứng với mức tăng glucose máu Tế bào beta đảo tụy đáp ứng lại việc nồng độ glucose máu tăng cao cách sản xuất nhiều insulin Quá trình kéo dài khiến chức tế bào beta bị suy giảm [24]

Tăng insulin máu bù trừ, tăng tiền chất khơng có hoạt tính proinsulin, tính chất tiết insulin theo đợt nguyên nhân gây rối loạn tiết insulin

1.1.4.Dịch tễ học

Đái tháo đường bệnh rối loạn chuyển hóa đáng báo động toàn giới nước phát triển phát triển Nó gây gánh nặng lên xã hội, hệ thống tài chính, y tế cách nghiêm trọng

Theo Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF), năm 2019, tồn giới có 463 triệu người độ tuổi 20-79 (chiếm 9,3% tổng số người trưởng thành độ tuổi này) mắc bệnh tiểu đường, dự kiến tăng lên 578,4 triệu vào năm 2030 700,2 triệu vào năm 2045 Phân loại bệnh học bệnh tiểu đường chủ yếu phân tách thành tuýp tuýp 2, với ĐTĐ tuýp chiếm phần lớn (> 85%) tổng tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ Trong năm 2019, nửa số người mắc tiểu đường (231,9 triệu người) khơng biết họ mắc bệnh, có 4,2 triệu ca tử vong toàn giới bệnh tiểu đường độ tuổi từ 20-99 và chi phí chăm sóc sức khỏe tồn cầu cho người mắc bệnh tiểu đường ước tính 760.3 tỷ USD

5

1.1.5.Các biến chứng

Một số biến chứng nguy hiểm bệnh cấp tính, mạn tính kèm theo xuất bệnh tiểu đường khơng điều trị tốt q trình điều trị khơng chặt chẽ Biến chứng cấp tính giai đoạn đầu đái tháo đường thường gặp: nhiễm toan ceton – hay xảy đái tháo đường tuýp 2, hôn mê tăng áp lực thẩm thấu máu, hạ đường huyết – hay gặp người bệnh dùng thuốc hạ đường huyết liều dùng thuốc đói bỏ bữa Một số biến chứng mạn tính như: biến chứng mạch máu lớn (tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, bệnh mạch vành, ), bệnh lý mạch máu nhỏ (bệnh lý thận, bệnh lý võng mạc, bệnh lý thần kinh, ) [4, 6]

Các biến chứng bệnh đái tháo đường tuýp có liên quan đến trình phát sinh phát triển bệnh Do phát bệnh lâm sàng, bác sĩ phải tìm biến chứng bệnh

1.1.6.Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường

Dựa vào tác dụng chế tác dụng, thuốc điều trị bệnh ĐTĐ chia thành nhóm chính:

 Insulin thuốc kích thích tiết insulin sulfonylurea, nateglinid (starlix)

 Các thuốc làm tăng tính nhạy cảm thụ thể với insulin, giảm đề kháng insulin như: biguanid (metformin), thuốc nhóm thiazolidincdion  Các thuốc chống tăng glucose máu sau bữa ăn, thuốc ức chế enzyme

α-glucosidase như: acarbose, voglibose, miglitol, làm chất đường ruột hấp thụ chậm vào thể đường sau ăn không tăng cao máu

Ở bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2, cần kết hợp điều trị thuốc, chế độ ăn luyện tập thể chất để đạt hiệu quả tốt Ngoài ra, có số đối tượng có bệnh lý mắc kèm hay thể trạng khác nên cần kết hợp thuốc nhóm với lưu ý tương tác thuốc nhằm giảm đường huyết an toàn hữu hiệu

1.2 Enzym α-glucosidase chất ức chế enzym α-glucosidase

1.2.1.Tổng quan enzym chất ức chế enzym

Enzym chất xúc tác sinh học hình thành tế bào sinh vật dạng hợp chất protein có cấu trúc hóa học đặc thù Nhờ có enzym mà nhiều phản ứng hóa học xảy với hiệu suất cao điều kiện bình thường nhiệt độ, áp suất, pH Các phần tử tham gia vào lúc đầu trình phản ứng gọi chât enzym biến đối chất thành phân tử khác Enzym có tính đặc hiệu chọn lọc cao chất nó, đóng vai trò định hướng tất phản ứng xảy tế bào [16, 27]

6

phản ứng thuận nghịch không thuận nghịch với enzym Thường có hai loại ức chế thuận nghịch ức chế cạnh tranh ức chế không cạnh tranh [16, 27] Đối với chất ức chế cạnh tranh: chất kìm hãm có cấu trúc tương tự chất, gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng enzym, làm chức xúc tác enzym chậm lại Đối với chất ức chế không cạnh tranh: chất kìm hãm gắn thuận nghịch vào vị trí khác enzym (gọi vị trí dị lập thê) khơng gắn vào vị trí xúc tác làm thay đối cấu hình, vị trí hoạt động enzym khiến khơng phù hợp để chất gắn vào Khi giải phóng chất ức chế, hoạt tính xúc tác enzym bình thường trở lại [16]

1.2.2.Enzym α-glucosidase

Enzym α-glucosidase enzym thành phần, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzym làm gãy liên kết thủy phân), có màng bề mặt đường ruột, tham gia vào bước cuối q trình tiêu hóa carbohydrat [21, 44] Enzym α-glucosidase có tên gọi khác maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase glucoamylase, glucopyranosidase, glucosidoinvertase, D-glucosidase, α-glucoside hydrolase, α-1,4-glucosidase, α-D-α-glucoside glucohydrolase

Cơ chế hoạt động enzym α-glucosidase: glucose cung cấp carbohydrat chứa thức ăn Sau vào thể, carbohydrat enzym tụy (α-amylase) ruột non (α-glucosidase) tiết ra, thủy phân thành phân tử đường đơn thẩm thấu vào máu, tỏa để nuôi tế bào thể Enzym α-glucosidase có chức xúc tác việc cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid chất đề giải phóng α-D-glucose [49] Có thể làm giảm thủy phân carbohydrat chậm thẩm thấu glucose vào máu việc kiểm soát hoạt động enzym α-glucosidase [35]

7

1.2.3.Các chất ức chế enzym α-glucosidase

1.2.3.1. Chất ức chế enzym α-glucosidase tổng hợp

Các thuốc tân dược có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase ruột, làm giảm hấp thu glucose vào máu sau ăn Acarbose, Miglitol, Voglibose sử dụng rộng rãi điều trị đái tháo đường tuýp [3] Acarbose tetrasaccharid, hấp thu đường tiêu hóa ức chế cạnh tranh với enzym α-glucosidase mà không gây hạ đường huyết không gây tăng tiết insulin Tuy vậy, lại để lại nhiều tác dụng phụ đường tiêu hóa đầy hơi, chướng bụng, tiêu chảy, buồn nôn, ăn đường mía thực phẩm có đường carbohydrat không hấp thụ lên men đại tràng [5]

1.2.3.2. Chất ức chế enzym α-glucosidase tự nhiên

Việc tìm kiếm hợp chất có nguồn gốc tự nhiên quan tâm để khắc phục nhược điểm hợp chất tổng hợp Hiện nay, nhà khoa học tìm số nhóm hợp chất ức chế enzym α-glucosidase flavonoid, alcaloid, curcuminoid, phenolic, terpinoid,

Bảng 1.2. Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase [44]

STT Nhóm hợp chất Tên hoạt chất

1 Flavonoid

Quercetin 3-O-β-d-xylopyranosyl (1’”→2”)-β-dgalactopyranoside, Luteolin, Apigennin, Hesperetin, (+)-catechin, Cyanidin-3-galactoside, Cyanidin-3-galactoside 2R,3R.4R,5R)2,5-bis(hydroxymethyl)-3,4-dihydroxypyrrolidine, 1-deoxynojirmycin

2 Alcaloid

Piperumbellactam A Piperumbellactam B Piperumbellactam C

3 Saponin-triterpenoid

Axit 3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic

28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-a-l- arabinopyranosyl-(I→3)-β-d-xylopyranosyl-(1→4)-α-Irhamnopyranosyl-(1→2)-β-d-fucopyranosyl ester

4 Curcuminoid

Curcumin

Demethoxycurcumin Bisdemethoxycurcumin

5 Phenolic Chebulanin

8 Chebulinic axit

(-)-3-O-galloylepicatechin (-)-3-O-galloylcatechin

6 Miscellaneous

Bromophenols 2,4,6-trbromophenol 2,4-dibromophenol

1.3 Quá trình oxy hóa thể chất chống oxy hóa

1.3.1.Khái niệm

Oxy hóa trình xảy phản ứng hóa học, mà electron chuyển thành chất oxy hóa, hình thành nên gốc tự Sự gia tăng gốc tự sinh phản ứng dây chuyền, dẫn đến phá hủy tế bào thể

Các gốc tự trạng thái cấu trúc phân thử có điện tích lẻ quỹ đạo điện tử ngồi cùng, bao gồm nguyên tử, phân tử, ion, electron chưa ghép gặp Chúng không ổn định tạo phản ứng hóa học với phân tử khác Các dạng hoạt động gốc tự ROS (Oxy hoạt tính), RNS (Nitrogen hoạt tính), RSS (Sulfur hoạt tính) [2, 32] Các gốc tự ổn định, có khả phản ứng cao với chất, thời gian tồn ngắn phụ thuộc vào chất điều kiện hệ mà tồn [23, 32]

Cơ chế hình thành gốc tự thể:

 Từ chuỗi hô hấp tế bào ty thể  Từ q trình peroxyd hóa lipid

 Từ phản ứng tạo gốc khác thể

Đích phân tử gốc tự gồm aicd deoxyribonucleic (ADN), acid ribonucleic (ARN), protein, lipid đường Một số bệnh nghiêm trọng liên quan đến phản ứng gốc tự ung thư, tim mạch, tiểu đường, béo phì, lupus ban đỏ, loét dày, Parkinson, bệnh Alzheimer, viêm khớp dạng thấp, ung thư [23, 28, 50]

Các chế chống oxy hóa [46]:

 Ức chế enzym xúc tác làm tăng sản xuất ROS/ RNS

 Tác động vào đường truyền tín hiệu oxy hóa khử, thúc đẩy q trình chống oxy hóa tế bào

 Phản ứng trực tiếp với gốc tự tạo chất độc hoạt tính

9

phân tử sinh học thông qua việc sản sinh peroxid gốc tự [31] Vai trò stress oxy hóa phát triển biến chứng nghiên cứu nhằm bổ sung thêm phương pháp điều trị biến chứng bệnh tiểu đường [30] Do đó, chất có khả chống oxy hóa cân chất oxy hóa chất tiềm điều trị bệnh đái tháo đường biến chứng đái tháo đường gây

1.3.2.Các chất chống oxy hóa

1.3.2.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh

Các chất chống oxy hóa nội sinh gồm có loại chất có chất enzym chất enzym Chúng có tác dụng ngăn chặn hình thành trung hòa gốc tự thể Các chất chống oxy hóa nội sinh khơng phải enzym tổng hợp thể ít, chủ yếu đến từ thực phẩm bổ sung [32] Các nhóm chất flavonoid, carotenoid, đến từ thực vật có khả chống oxy hóa tốt Các chất chống oxy hóa nội sinh tác dụng độc lập hiệp đồng với để chống lại gốc tự Nhờ mà q trình oxy hóa thể xảy mức độ định, trì cân trao đổi chất Nghiên cứu tìm kiếm hợp chất chống oxy hóa thảo dược hỗ trợ điều trị bệnh có liên quan đến oxy hóa thể

Bảng 1.3. Các chất chống oxy hóa nội sinh

Bản chất enzym Không phải enzym

Catalase

Superoxid dismutase Glutathion peroxidase Glutathion reductase

Glucose – phosphat dehydrogenase

Vitamin A, vitamin C, vitamin E Coenzym Q10

Hợp chất chứa nito (non-protein): axit uric

Hợp chất chứa lưu huỳnh: Glutathion

1.3.2.2. Các chất chống oxy hóa tổng hợp

10

Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học, ứng dụng số chất chống oxy hóa tổng hợp

Tên hợp chất Cơng thức cấu tạo Ứng dụng

BHA (butylated hydroxyanisole)

Chống oxy hóa thực phẩm

BHT (butylated hydroxytoluene)

Chống oxy hóa thực phẩm

TBHQ

(tert-butylhydroquinone)

Chống oxy hóa thực phẩm chế biến từ động vật

PG

(propyl gallate) Chống oxy hóa thực phẩm

OG

(octyl gallate)

Chống oxy hóa thực phẩm mỹ phẩm

Kháng nấm

2,4,5-Trihydroxy

butyrophenone Chống oxy hóa thực phẩm

NDGA

(nordihydroguaiaretic acid)

Chống oxy hóa thực phẩm

4-Hexylresorcinol Ngăn ngừa thực phẩm bị

11

1.3.2.3. Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật

Một số thực phẩm, đặc biệt thực vật, giàu chất chống oxy hóa thuộc nhiều nhóm khác Trong đó, đáng ý dẫn xuất phenol vitamin:

 Vitamin C (axit ascorbic): axit ascorbic bao gồm hai hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa (axit L-ascorbic, axit L-dehydroascorbic) hấp thụ qua đường tiêu hóa, loại bỏ gốc tự anion superoxide, hydro peroxide, gốc hydroxyl, oxy nhóm đơn oxit nitơ phản ứng pha nước tế bào, tái tạo lại vitamin E dạng oxy hóa thành dạng khử [32, 33]

 Vitamin E (tocopherol): vitamin E bao gồm tám đồng phân, với bốn tocopherol (α-tocopherol, β-tocopherol, γ-tocopherol, δ-tocopherol) bốn tocotrienols (α-tocotrienol, β-tocotrienol, γ-tocotrienol, δ- tocotrienol) Nó ngăn chặn q trình peroxy hóa lipid cách liên kết gốc hydro phenolic với gốc peroxyl, tạo thành gốc tocopheroxyl tiếp tục phản ứng chuỗi oxy hóa [32]

 Vitamin K: hịa tan chất béo, cần thiết cho trình chuyển đổi glutamate liên kết với protein thành γ-carboxyglutamate Cấu trúc 1,4-naphthoquinone có tác dụng chống oxy hóa Hai đồng dạng tự nhiên vitamin K1 K2 [32]

 Flavonoid: Flavonoid nhóm hợp chất chống oxy hóa bao gồm flavonol, flavanol, anthocyanin, isoflavonoid, flavanone flavones Các nhóm hydroxyl phenolic flavonoid có cấu trúc vịng, có đặc tính chống oxy hóa hoạt động chất khử, cho hydro, chất khử oxy nhóm đơn, thu dọn gốc superoxide tạo phức chelat Chúng kích hoạt enzyme chống oxy hóa, giảm gốc α-tocopherol (tocopheroxyls), ức chế enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa-khử, giảm nitro hóa, tăng mức axit uric phân tử trọng lượng phân tử thấp Một số flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao catechin, catechin-gallate, quercetin, kaempferol, EGCG từ trà xanh, Genistein đậu nành [32, 39]

 Ngồi cịn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm phenolic tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa axit phenolic, lingin, carotenoid, 1.4 Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase tác dụng chống oxy hóa in vitro

1.4.1.Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro

12

Phương pháp nghiên cứu in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase số hợp chất thiên nhiên dựa nguyên tắc:

 Enzym α-glucosidase gặp liên kết a-D-glucopyranosyl cắt đứt để giải phóng đường D-glucose

 Sử dụng chất có liên kết α với đường D-glucose p -nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNPG), tác dụng enzym α-glucosidase bị thủy phân cho đường α-D-glucose p-nitrophenol (pNP)

 p-nitrophenol hấp thu ánh sáng nhìn thấy được, đo độ hấp thu bước sóng λ = 405nm Từ xác định lượng D-glucose sinh

 Khi sử dụng chất ức chế α-glucosidase làm cho phản ứng enzym bị ngừng lại, không tạo sản phẩm D-glucose

α-glucosidase +

Hình 1.2 Nguyên tắckhảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase

1.4.2.Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro

Ngày nay, nhà khoa học nước tiến hành nhiều phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính chống oxy hóa, chia làm loại phương pháp

in vitro phương pháp in vivo Một số thử nghiệm đánh giá in vitro thường sử dụng: thu dọn gốc tự DPPH, dọn gốc tự superoxid O2•, dọn gốc tự hydroxyl

•OH, [19]

Thử tác dụng dọn gốc tự DPPH

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng gốc tự DPPH (màu tím đỏ) với chất chống oxy hóa để tạo hợp chất DPPH có màu vàng khơng hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 517 nm Đo độ hấp thụ bước sóng 517 nm dung dịch sau phản ứng để tính lượng DPPH cịn lại sau phản ứng

Ưu điểm: phổ biến nhất, nhanh, cho kết xác, dễ thực khơng tốn Tuy nhiên, phép thử chí mang ý nghĩa xác định khả loại bỏ gốc tự mẫu cần thử DPPH khơng tổn thể sống Dùng sàng lọc mẫu dược liệu

Thử tác dụng dọn gốc tự superoxid O2•

Nguyên tắc: Gốc tự O2• hình thành q trình oxy hóa xanthin

thành acid uric xúc tác enzym xanthinoxidase Gốc O2• tạo thành phản ứng

13

nm, đo hấp thụ quang dung dịch phản ứng bước sóng biết lượng O2•

tham gia phản ứng

Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, u cầu máy móc, kết thu tương đổi ổn định xác

Thử tác dụng dọn gốc tự superoxid •OH

Nguyên tắc: Phương pháp dựa phản ứng đường - deoxyribose gốc •OH Khi hoạt động oxy hóa đường deoxyribose để tạo sản phẩm cuối MDA (maloydialdehyd) Phân tử MDA phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) nhiệt độ cao màu hồng có hấp thụ ánh sáng cực đại bước sóng 532 nm Đo hấp thụ quang dung dịch bước sóng cho biết nồng độ MDA tạo sau q trìnhoxy hóa Từ tính mức độ deoxyribose bị oxy hóa mức độ dọn gốc tự •OH mẫu thử

Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, chi phí thấp Tuy nhiên gốc •OH có hoạt tính mạnh nên khó để đánh giá mức độ tác dụng kết xác thử nghiệm

1.5 Tổng quan Hồng đảng sâm

1.5.1.Nguồn gốc, phân loại

1.5.1.1. Tên khoa học Hồng đảng sâm

 Tên khoa học: Codonopsis javanica (Blume) Hook f

 Tên khác: đảng sâm Việt Nam, ngân đằng, đùi gà, mằn cáy (Tày), co nhả dòi (Thái), cang hô (H’Mông) [22]

 Theo hệ thống Armen Takhtajan, lồi Codonopsis javanica có vị trí phân loại sau:

 Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực)  Giới: Plantae (Thực vật)

 Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh)

 Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín)  Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai mầm)

 Phân lớp: Asteridaes

 Bộ: Asterales (Bộ Cúc)

 Họ: Campanulaceae (Họ Hoa Chuông; Cát kiến)  Chi: Codonopsis

14

Hình 1.3. Hình ảnh Hồng đảng sâm

1.5.1.2. Phân bố, sinh thái

Chi Codonopsis Blume có 44 lồi giới, phân bố chủ yếu cận nhiệt đới ôn đới ấm châu Á châu Âu Ở Việt Nam, có – lồi, lồi nhập nội, lồi cịn lại mọc tự nhiên Trong số loài mọc tự nhiên, thuốc gọi “đảng sâm” thực tế có lồi C javanica số lồi phát Hà Giang

Hồng đảng sâm vùng cận nhiệt đới, ghi nhận Trung Quốc, Mianma, Ấn Độ, Lào, Việt Nam Nhật Bản Ở Việt Nam, phân bố rộng rãi tập trung nhiều vùng núi phía Bắc, giảm dần phía Nam, gồm 14 tỉnh miền núi, tập trung Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang… Ở tỉnh phía nam, Hồng đảng sâm có núi Ngọc Linh vùng Đà Lạt Cây ưa ẩm, ưa sáng chịu nóng, thường mọc tương đối tập trung vùng nương rẫy cũ, ven rừng loại hình rừng núi đá vơi sau bị khai phá để lấy đất canh tác Trong tự nhiên, số trưởng thành có hoa chiếm tỷ lệ 30 – 40% Do rễ củ cắm sâu đất, nên sau bị đốt nương, có khả tái sinh [22]

1.5.2.Đặc điểm thực vật

Cây thảo, sống lâu năm, leo dây quấn Rễ củ nạc, hình trụ dài, đường kính đạt 1,2 – cm, phân nhánh, dầu rễ phình to, có nhiều vết sẹo lồi thân cũ Màu trắng ngà, có lõi gỗ màu vàng Thân trịn, có chỗ bị bóp méo quấn vào giá thể khác, màu lục nhạt pha tím Đường kính thân từ 1,5 – 3,0 mm Thân non thường có lơng, lớn lên nhẵn Tồn có nhựa mủ trắng

15

Hoa mọc riêng lẻ kẽ đối diện với phần ngọn, có cuống dài – cm, đài có phiến hẹp, tràng hình chng màu trắng vàng, có vân tím họng, chia thùy; nhị 5, nhị dẹt, bao phấn đính gốc, bầu hình cầu có

Quả nang, hình gần cầu, có cạnh mờ, đầu phẳng, phía có núm nhỏ hình nón, đường kính – cm, có đài tồn tại, chín màu tím tím đỏ, hạt nhiều màu vàng nhạt, bề mặt bóng, có vân dạng lưới

Mùa hoa từ tháng đến tháng 7, mùa từ tháng đến tháng [13, 18, 22]

1.5.3.Bộ phận dùng

Bộ phận dùng rễ phơi sấy khô Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica). Rễ thu hái vào mùa thu đông, rửa đất cát, cắt bỏ đầu rễ rễ con, phân loại rễ to nhỏ để riêng, phơi nắng nhẹ sấy nhiệt độ thấp khô, lăn cho mềm, tiếp tục phơi sấy nhẹ khơ hẳn

Rễ hình trụ, có phân nhánh, đường kính 0,5 – cm, mặt ngồi màu vàng nâu nhạt, có rạch dọc, ngang Loại to có thịt trắng ngà, vị dịu Khi dùng thái mỏng tẩm nước gừng, qua Dược liệu dễ bị sâu mọt cần bảo quản nơi khô [22]

1.5.4.Thành phần hóa học

Lồi Codonopsis javanica cho đến có cơng trình nghiên cứu

thành phần hóa học Theo đánh giá sơ bộ, non chứa nước 77,5%, protid 4,2%, glucid 13,1%, xơ 3,3%, caroten 3,6mg%, vitamin C 85,5mg% Sơ thấy rễ có đường, chất béo, khơng có saponin Cịn có tinh dầu, glucosid sentellarin vết alcaloid [11]

Theo Zheng-Tao Wang, C.javanica có taraxerol, β-sitosterol, α -spinasterol [37] Theo tài liệu Những thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, rễ Hồng đảng sâm không chứa saponin

Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu Hồng Minh Chung cộng có nghiên cứu ban đầu thành phần hóa học Hồng đảng sâm thu hái Sapa phát C.javanica có chứa saponin, đường khử 17 acid amin toàn phần; chất khoáng Ca, Fe, Mg, Cu, Mn, Zn, sesquiterpen 8β -hydroxyasterolid; dẫn xuất glycosid với phần khung stigmasta-7,25-dien-3-ol [7-10]

16

Stigmasta-7,25-dien-3-ol α-spinasterol 3-O-β-D-glucopyranosid Hình 1.4. Một số hợp chất phân lập từ rễ Hồng đảng sâm

1.5.5.Tác dụng công dụng 1.5.5.1. Tác dụng dược lý

Các tác dụng dược lý tác dụng ức chế enzym α-glucosidse chống oxy hóa C.Javanica chưa nghiên cứu chuyên sâu giới Việt Nam Do q trình thực đề tài, tham khảo tài liệu nghiên cứu tác dụng dược lý loài thuộc chi Codonopsis. Y học cổ truyền Trung Quốc dùng loài Đảng sâm: Codonopsis tangshen (Xuyên đảng sâm)

Codonopsis pilosula (Đảng sâm) [7]

Năm 1934, Kinh Lợi Bân Thạch Nguyên Cao dùng Đảng sâm ngâm với cồn 70o tháng Lọc đem bã lại sắc với nước: 1kg rễ dược liệu cho 200g

cao cồn 260g cao nước Chế loại thành dung dịch 20%, phần sau hấp tiệt trùng đem tiêm, phần cho lên men để loại hết hợp chất carbohydrat (như đường) tiêm, đồng thời chế thành thuốc cho uống [15] Kết thu sau:

 Đối với đường huyết: Tiêm Đảng sâm vào thỏ bình thường thấy lượng đường huyết tăng lên Tác giả cho Đảng sâm làm tăng lượng đường huyết thành phần hydratcarbon Đảng sâm tiêm cho uống Đảng sâm cho lên men để loại chất đường khơng làm lượng đường huyết tăng lên Tiêm thuốc Đảng sâm chưa lên men lên men không thấy ức chế tượng đường huyết tăng lên tiêm da dung dịch 10% diuretin (4 ml/ kg thể) Dựa vào quan điểm Richter, Rose, Nishi Pollak cho Diuretin gây đường thần kinh giao cảm nên Kinh Lợi Bân cho Đảng sâm không ức chế đường huyết cao nguồn gốc thần kinh

17

huyết áp adrenalin gây ra: lượng adrenalin tiêm cao tượng ức chế kém, lượng adrenalin tiêm thấp tượng ức chế mạnh

Theo nghiên cứu Chen cộng sự, chuột kháng insulin cho ăn fructose, cao chiết nước rễ C.javanica có tác dụng làm giảm tăng tiết insulin peroxyd hóa lipid Theo đó, C.javanica cải thiện đáng kể hoạt động enzym chống oxy hóa, bao gồm glutathion peroxidae, superoxide dismutase glutathione reductase gan [25]

1.5.5.2. Công dụng theo y học cổ truyền

Sử dụng thuốc có nguồn gốc thực vật phịng chữa bệnh thói quen, kinh nghiệm truyền thống người dân Việt Nam nhiều nước giới Có nhiều lồi dùng theo kinh nghiệm dân gian để làm giảm nhẹ triệu chứng biến chứng bệnh ĐTĐ: Cải xoong (Nasturium officinale

Brassicaceae); Mướp đắng (Mormordica charantia Cucurbitaceae); Bồ công anh (Taraxacum officinale Asteraceae); Dứa (Ananas sativus); Bạch truật (Atractiloides macrocephala Asteraceae); Ngò tàu (Eryngium foetidum Apiaceae); Quỷ trâm thảo (Bidens pilosa Asteraceae); Cam thảo nam (Scoparia ducis Scrophulariaceae); Dừa cạn (Catharanthus roseus Apocynaceae); Hoài sơn (Dioscorea persimilis

Dioscoreaceae); Ngọc trúc (Polygotanum officinale Liliaceae); Củ cải trắng (Ravanus sativus); Ổi (Psidium guajava); Chuối hột (Musra barjoo Sieb); Rau má (Celltela asiatica) [29]

Theo Y học cổ truyền, rễ Hồng đảng sâm có vị ngọt, tính bình, có tác dụng bổ tỳ, kiện vị, ích khí, sinh tân dịch, giải khát Rễ dùng chữa tỳ vị suy kém, phế khí hụt nhược, ăn, đại tiện lỏng, mệt mỏi, khát nước, ốm lâu thể suy nhược, lòi dom, sa tử cung, băng huyết, rong huyết, thiếu máu, vàng da, tăng bạch cầu, viêm thận, nước tiểu có albumin, chân phù đau Ngồi cịn dùng làm thuốc bổ dày, lợi tiểu, chữa ho, tiêu đờm [6], [7] Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu việc sử dụng Hồng đảng sâm C.javanica điều trị bệnh tiểu đường

Một số thuốc có Hồng đảng sâm dùng Việt Nam:

 Bồi đưỡng thể, chữa thận suy, đau lưng, mỏi gối, đái rắt: hồng đảng sâm 20g, tắc kè 5g, huyết giác 1g, trần bì 1g, tiểu hồi 0,5g, rượu 40o 250 ml, đường đủ Các vị thuốc cắt nhỏ, ngâm rượu khoảng tháng Mỗi lần uống 30 ml, ngày – lần

 Chữa thể suy nhược mệt mỏi, ăn không ngon, đại tiện lỏng: hồng đảng sâm 20g, bạch truật sao, đương quy, ba kích vị 12g Sắc uống, tán bột viên với mật ong, uống ngày 12 – 20g

18

Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu

Rễ Hồng đảng sâm thu mua vào tháng năm 2018, Buôn Ma Thuột Mẫu nghiên cứu giám định thực vật học Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược với tên khoa học Codonopsis javanica (Blume) Hook f., họ hoa Chuông (Campanulaceae) Mẫu tiêu lưu giữ Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Hình 2.1. Mẫu dược liệu Hồng đảng sâm

2.1.2.Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Rễ thu mua rửa sạch, sấy khô lại lò sấy nhiệt độ 65oC

giờ Sau đem rễ xay nhỏ tiến hành chiết xuất theo phương pháp chiết xuất trình bày mục 2.3.1

2.1.3.Hóa chất, dung mơi

 Acid ascorbic (99%, Sigma – Aldrich, Singapore)

19  p-nitrophenol chuẩn (Merck)

 α-glucosidase 0,9 U/ml (pha nước khử ion lạnh) (Sigma)  Cao chiết tổng phân đoạn

 Dung môi: ethanol, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), n-buthanol (n-BuOH), methanol (MeOH), nước cất

2.1.4.Thiết bị, dụng cụ

 Cân phân tích AY 129 (Shimadzu – Nhật Bản)

 Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H (MRC – Israel)  Máy cô quay chân không Rotavapor R-210 (Buchi – Đức)  Máy khuấy từ gia nhiệt C-MAG HS (IKA – Đức)

 Máy đo quang UV Agilent technologies Cary 60 (UV-VIS – Mỹ)  Micro pipet đầu kênh – 20 μL, 10 – 100 μL, 100 – 1000 μL  Bông y tế, phễu lọc, đầu côn loại

 Cuvet (1ml, 3ml), Eppendorf 1,5 ml

 Các dụng cụ thủy tinh sử dụng thực nghiệm: Pipet, bình định mức, bình chiết, cốc có mỏ dung tích 25 – 800 ml, bình cầu dụng cụ cần thiết khác

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực mục tiêu đề ra, đề tài thiết kế với nội dung sau:

 Nội dung 1: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica

(Blume) Hook f.) theo phương pháp DPPH

 Nội dung 2: Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis

javanica (Blume) Hook f.) chất p

-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid 2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.Phương pháp chiết xuất

20

Hình 2.2. Sơ đồ chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm

2.3.2.Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa cao rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH

Thí nghiệm đánh giá tác dụng chống oxy hóa dịch chiết rễ Hồng đảng sâm tiến hành Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Nguyên lý

Hợp chất DPPH có khả tạo gốc tự bền dung dịch MeOH bão hòa Khi phản ứng với chất chống oxy hóa, dung dịch màu tím đỏ chuyển sang màu vàng cam khơng hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng λ = 517 nm Cho chất thử vào dung dịch này, chất có khả quét gốc tự làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng gốc tự DPPH Đo hấp thụ bước sóng biết lượng DPPH cịn lại sau phản ứng Đánh giá khả chống oxy hóa giá trị hấp thụ ánh sáng dung dịch thử nghiệm so với chất đối chứng

Chuẩn bị hóa chất cần thiết

 Dung môi MeOH đạt tiêu chuẩn phân tích

 Chất chuẩn dương acid ascorbic hòa tan MeOH bão hòa với dãy nồng độ 1; 5; 10; 20; 50 μg/mL

 Pha dung dịch DPPH có nồng độ 0,24mg/mL dung mơi MeOH  Mẫu thử: cao dược liệu pha loãng dung mơi MeOH bão hịa

21

Cách tiến hành

 Lấy 340 µL dung dịch DPPH MeOH, 100 µL dung dịch mẫu thử pha lỗng 560 µL MeOH trộn micro pipet, bọc giấy bạc, ủ 25˚C 15 phút

 Song song với mẫu thử, tiến hành mẫu chứng với điều kiện thành phần

 Tiến hành đo hấp thụ bước sóng λ = 517 nm Tất thí nghiệm lặp lại lần, lấy kết trung bình lần đo

Cách đánh giá kết

Thí nghiệm lặp lại lần Hoạt tính quét gốc tự DPPH đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức chế (I%) xác định IC50 phần mềm Sigma

Plot 10.0 dựa theo đồ thị nồng độ mẫu thử (C) phần trăm ức chế (I%) Tính I%

theo công thức sau:

I% = AC−At

AC− A0⋅ 100

Trong đó: I%: Hoạt tính chống oxy hóa

AC: Độ hấp thụ mẫu chứng

At: Độ hấp thụ mẫu thử

A0: Độ hấp thụ mẫu trắng (sử dụng methanol)

Tác dụng chống oxy hóa in vitro dịch chiết so sánh chất chuẩn dương acid ascorbic

2.3.3.Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao rễ Hồng đảng sâm

Thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro dịch chiết rễ Hồng đảng sâm tiến hành Viện công nghệ sinh học – Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam

Nguyên lý

Enzym α-glucosidase xúc tác trình chuyển chất p -nitrophenyl-α-D-glucopyranosid thành α-glucose p-nitrophenol có màu vàng nhạt - hấp thụ cực đại λ = 405 nm Chất kìm hãm enzym làm cường độ hấp thụ ánh sáng dung dịch giảm Dựa vào độ hấp thụ dung dịch có khơng có mặt chất thử, từ suy phần trăm ức chế enzym Dựa vào phần mềm, xác định IC50 Mẫu có hoạt tính

càng cao giá trị IC50 thấp

Chuẩn bị hóa chất cần thiết

22

Cách tiến hành

Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase thực theo phương pháp Moradi-Afrapoli F cộng [48] Cụ thể sau:

 Chất thử hòa tan DMSO (Dimethyl sulfoxid) pha loãng đệm phosphate 10 mM (pH 6,8) 50 μL đưa vào giếng khay 96 giếng để có nồng độ 256 μg/mL, 64 μg/mL, 16 μg/mL; μg/mL  Thêm vào giếng 20 μL α-glucosidase (0,5U/mL) 130 μL đệm

phosphate 100 mM (pH 6,8), trộn ủ 37°C 15 phút  Thêm vào giếng chất pNPG, ủ tiếp 37°C 60 phút

 Đĩa thí nghiệm có chất thử, đệm phosphate pNPG sứ dụng làm chất chứng trắng (blank) Giếng thí nghiệm có DMSO 10%, đệm phosphate, enzym pNPG sử dụng làm đối chứng Thí nghiệm lặp lại lần để đảm bảo xác

 Dừng thí nghiệm cách thêm vào 80 μL Na2CO3 0,2M đo OD

máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad) bước sóng λ = 405nm

Cách đánh giá kết

Công thức đánh giá khả ức chế enzym α-glucosidase mẫu thử:

% ức chế = 100 - At

Ac × 100 Trong đó:

 Ac = A đối chứng = OD đối chứng – OD mẫu trắng đối chứng

 At = A mẫu thử = OD mẫu thử - OD mẫu trắng thử

Giá trị IC50 tính dựa vào đồ thị phương trình biểu diễn nồng độ % ức

chế enzym α-glucosidase cao toàn phần phân đoạn dịch chiết từ rễ Hồng

đảng sâm

2.4 Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu lưu trữ phân tích xử lý liệu theo phương pháp thống kê sinh học máy vi tính phần mềm Microsoft Office Excel 2016 phần mềm SigmaPlot 12 (Systat Software, Inc, Mỹ)

Các thuật tốn sử dụng:

 Giá trị trung bình (𝑋) được tính trung bình cộng lần đo

 Độ lệch chuẩn (SD) tính cơng thức: SD = √Σ̅(Xi−X̅)

23

 Kết thí nghiệm biểu thị giá trị trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn (𝑋 ± SD)

 Giá trị IC50 tính hàm số y = ax2 + bx + c, biểu diễn mối tương

24

Chương KẾT QUẢ

3.1 Quy trình chiết xuất phân đoạn dịch chiết cao rễ Hồng đảng sâm Rễ Hồng đảng sâm (200g) sau sấy khô, cắt nhỏ chiết xuất lần với ethanol tuyệt đối thu 12,32g cao ethanol Sau đó, giữ lại 2,32g cao ethanol để đánh giá khả chống oxy hóa ức chế enzym α-glucosidase in vitro, lấy 10g lại đem hòa tan vào nước cất chiết phân đoạn với n-hexan, ethyl acetat, n-buthanol thu 3,16g cao n-hexan; 5,03g cao ethyl acetat 5,26g cao n-buthanol Kết cho thấy rễ Hồng đảng sâm chứa lượng lớn hợp chất tự nhiên Tách chiết phương pháp dùng dung mơi có độ phân cực từ thấp đến cao giúp tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách chiết hợp chất sau

Hình 3.1. Sơ đồ sản phẩm chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm 200g dược liệu

12,32g cao EtOH 2,32g cao EtOH

Cao chiết nước 3,16g cao n-hexan

5,03g cao ethyl acetat

5,26g cao n-buthanol Cao chiết nước

Cao chiết nước

Giữ lại Chiết xuất lần

Chiết phân đoạn lần

Chiết phân đoạn lần

25

Sau chiết phân đoạn xong, phân đoạn dịch chiết cao tổng đem hịa tan dung mơi methanol nhằm chuẩn bị dung dịch mẫu thử có nồng độ khác cho trình đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase tác dụng chống oxy hóa in vitro của rễ Hồng đảng sâm

3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH

Tác dụng chống oxy hóa in vitro theo phương pháp DPPH cao toàn phần phân đoạn dịch chiết từ rễ Hồng đảng sâm thí nghiệm nồng độ 31,25; 62,5; 125; 250; 500 1000 μg/mL Acid ascorbic chất chứng dương sử dụng thí nghiệm Giá trị phần trăm ức chế I (%) cao chiết toàn phần phân đoạn cao chiết nồng độ khác từ rễ Hồng đảng sâm Acid ascorbic trình bày bảng 3.1 hình 3.2

Bảng 3.1. Khả chống oxy hóa in vitro dịch chiết tồn phần phân đoạn dịch chiết cao rễ Hồng đảng sâm chất đối chứng nồng độ khác

Phân đoạn

% ức chế nồng độ (µg/mL) Giá trị IC50

(µg/mL)

1000 500 250 125 62,5 31,25

Ethanol 92,78 ± 3,2 75,36 ± 1,9 59,63 ± 2,3 43,25 ± 1,6 23,54 ± 0,9 10,24

± 0,4 186,5 ± 7,4 n-Hexan 79,46

± 2,1 57,36 ± 2,2 48,25 ± 1,7 31,25 ± 1,1 14,6 ± 0,5 7,84

± 0,2 294,7±10,2 EtOAc 97,58

± 3,3 86,45 ± 2,2 76,24 ± 1,9 65,87 ± 1,6 46,35 ± 1,5 35,25

± 1,2 80,6 ± 2,8 n-BuOH 85,7

± 1,9 74,6 ± 2,0 60,5 ± 2,1 45,8 ± 1,5 30,7 ± 0,9 12,9

± 0,3 159,2 ± 9,1 Chất

đối chứng

% ức chế nồng độ (µg/mL) Giá trị IC50

(µg/mL)

50 20 10 5 1

Acid

26

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả chống oxy hóa cao chiết tồn phần phân đoạn cao rễ Hồng đảng sâm nồng độ khác

Từ bảng 3.1 hình 3.2., kết cho thấy tác dụng chống oxy hóa in vitro

tăng dần theo nồng độ Dịch chiết ethanol toàn phần từ rễ Hồng đảng sâm thể tác dụng chống oxy hóa in vitro với giá trị IC50 tính 186,5 ± 7,4 µg/mL Trong

các phân đoạn dịch chiết, phân đoạn EtOAc thể tác dụng chống oxy hóa in vitro

mạnh với I% nồng độ cao 1000 µg/mL 97,58 %, giá trị IC50 tính

là 80,6 ± 2,8 µg/mL Tiếp theo phân đoạn n-BuOH với giá trị I% đạt 85,7 % nồng độ cao 1000 µg/mL, giá trị IC50 tính 159,2 ± 9,1 µg/mL Phân đoạn

n-Hexan thể tác dụng chống oxy hóa yếu với giá trị IC50 tính 294,7 ±

10,2 µg/mL

Song song với mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng dương acid ascorbic cho thấy tác dụng chống oxy hóa in vitro acid ascorbic hoạt động ổn định thí nghiệm, có giá trị IC50 17,2 ± 1,4 µg/mL thể qua hình 3.3

0 200 400 600 800 1000 1200

20 40 60 80 100

0 200 400 600 800 1000 1200

20 40 60 80 100 120

0 200 400 600 800 1000

0 20 40 60 80 100

C (µg/mL) I%

C (µg/mL)

I% n-hexan

C (µg/mL) C (µg/mL)

I% I%

BuOH EtOAc

27

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn khả chống oxy hóa in vitro acid ascorbic

3.3 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm

Tác dụng dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao toàn phần phân đoạn dịch chiết từ rễ Hồng đảng sâm thí nghiệm nồng độ 31,25; 62,5; 125; 250; 500 1000 μg/mL Acarbose chất chứng dương sử dụng thí nghiệm Giá trị phần trăm ức chế I (%) cao chiết toàn phần phân đoạn cao chiết nồng độ khác từ rễ Hồng đảng sâm chất đối chứng dương trình bày bảng 3.2 hình 3.4

Bảng 3.2. Khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao toàn phần, phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm chất đối chứng nồng độ khác

Phân đoạn

% ức chế nồng độ (µg/mL) Giá trị IC50

(µg/mL)

1000 500 250 125 62,5 31,25

Ethanol 95,23 ± 3,6 80,23 ± 2,9 69,25 ± 2,5 51,24 ± 1,8 39,25 ± 1,3 25,14

± 0,8 99,5 ± 4,8 n-Hexan 68,25

± 2,6 58,25 ± 1,9 49,2 ± 1,4 32,12 ± 1,1 15,23 ± 0,4 8,25

± 0,3 291,4 ± 8,7 EtOAc 98,25

± 3,5 84,23 ± 2,3 73,51 ± 2,0 62,32 ± 1,8 42,17 ± 1,3 32,36

± 1,0 80,4 ± 5,9 n-BuOH 86,3

± 3,0 75,6 ± 2,5 63,5 ± 2,4 46,3 ± 1,3 32,6 ± 0,9 15,6

± 0,5 129,6 ± 6,2 Chất đối

chứng

% ức chế nồng độ (µg/mL) Giá trị IC50

(µg/mL)

50 20 10 5 1

Acarbose 85,68 ± 3,2 52,42 ± 1,3 36,58 ± 1,2 21,2 ± 0,8 5,33

± 0,1 156,8 ± 2,8

0 10 20 30 40 50 60

28

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao toàn phần phân đoạn rễ Hồng đảng sâm nồng độ khác

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro Acarbose

0 200 400 600 800 1000 1200 20 40 60 80 100

0 200 400 600 800 1000 1200 10 20 30 40 50 60 70 80

0 200 400 600 800 1000 1200 20 40 60 80 100 120

0 200 400 600 800 1000 1200 20 40 60 80 100

0 200 400 600 800 1000 1200

0 20 40 60 80 100 EtOH n-Hexan EtOAc BuOH C (µg/mL) C (µg/mL) C (µg/mL) C (µg/mL) I%

I% I%

I%

C (µg/mL)

29

Từ bảng 3.2 hình 3.4., kết cho thấy khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro tăng dần theo nồng độ Dịch chiết ethanol toàn phần, phân đoạn EtOAc n-BuOH từ rễ Hồng đảng sâm có giá trị IC50 99,5 ± 4,8 µg/mL,

80,4 ± 5,9 µg/mL, 129,6 ± 6,2 µg/mL, thể tác dụng ức chế enzym α-glucosidase tốt mẫu chứng Acarbose (giá trị IC50 156,8 ± 2,8 µg/mL) Trong phân

đoạn dịch chiết, phân đoạn EtOAc thể tác dụng chống oxy hóa in vitro mạnh với I% nồng độ cao 1000 µg/mL 98,25% Phân đoạn n-Hexan thể tác dụng chống oxy hóa in vitro yếu với giá trị IC50 tính 291,4 ± 8,7

µg/mL

30

Chương BÀN LUẬN

Hiện nay, đái tháo đường bệnh lý gây ảnh hưởng lên nhiều vấn đề sức khỏe khác, phát sinh nhiều biến chứng trầm trọng, ảnh hưởng lớn đến chất lượng sống nguyên nhân gây tử vong hàng đầu Số lượng người mắc đái tháo đường tăng gấp đơi vịng thập kỉ gần ngày trẻ hóa qua năm Bệnh ĐTĐ gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tim mạch, mù lịa, suy thận, cắt cụt chi [6] Chính hậu ĐTĐ gây khơng cho cá nhân người bệnh mà tạo nên gánh nặng cho tồn xã hội, hệ thống y tế, tài quốc gia nhà khoa học giới nỗ lực tìm kiếm phương pháp phòng điều trị hiệu bệnh ĐTĐ, ngăn ngừa biến chứng nâng cao chất lượng sống Bên cạnh việc nghiên cứu phát triển tân dược, nhà khoa học tiến hành nhiều nghiên cứu chứng minh loại thảo dược có tác dụng hạ glucose máu, dược liệu có khả chống oxy hóa ức chế enzym α-glucosidase

Rễ Hồng đảng sâm có tác dụng dược lý tốt, sử dụng nhiều y học cổ truyền Hồng đảng sâm thường dùng để bồi bổ sức khỏe, dùng loại thuốc bổ, giúp bổ tỳ, ích khí, tân khát Tuy nhiên, Việt Nam, rễ C.javanica thường xuyên bị khai thác lấy rễ củ để làm thuốc Nạn phá rừng làm nương rẫy trực tiếp làm cho khu phân bố tự nhiên bị thu hẹp nhanh chóng Trữ lượng tự nhiên bị giảm sút nhiều Từ nhiều năm nay, Hồng đảng sâm loài thuộc chi Codonopsis liệt vào Sách Đỏ Việt Nam đối tượng ưu tiên bảo tồn [1] Chính thế, để bảo vệ nguồn dược liệu mang tính đặc hữu khu vực nên có nhiều nghiên cứu Việt Nam nhằm bảo tồn, nhân giống phát triển C.javanica loài khác thuộc chi Codonopsis [14, 17]

Trong bệnh ĐTĐ, trình tăng glucose huyết thể sản sinh nhiều gốc tự làm suy yếu hệ thống phòng thủ chống oxy hóa nội sinh Do đó, việc sử dụng chất chống oxy hóa để phịng ngừa làm suy giảm triệu chứng bệnh ĐTĐ biện pháp thường cân nhắc sử dụng Phương pháp quét gốc tự DPPH sử dụng rộng rãi để giá khả chống oxy hóa in vitro có nhiều ưu điểm phương pháp khác Kết nghiên cứu cho thấy tác dụng chống oxy hóa phương pháp thu dọn gốc tự DPPH cao chiết toàn phần cao chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm phụ thuộc vào nồng độ: nồng độ cao chiết tăng tác dụng quét gốc tự tăng theo dựa theo đồ thị dựng hình 3.2 Cao chiết phân đoạn EtOAc rễ Hồng đảng sâm có quét gốc tự DPPH cao với IC50 80,6±2,8 μg/mL

Kết nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa Hồng đảng sâm nghiên cứu nảy tương đồng với nghiên cứu giới loài chi Codonopsis Sang-Min Jeon cộng có nghiên cứu lồi khác chi Codonopsis là Codonopsis lanceolata tác dụng chống oxy hóa in vitro lồi thơng qua chiết cao áp hấp q trình lên men có hiệu so với cách chiết xuất thông thường [41] Chang-Seon Yoo Sung-Jin Kim chứng minh chiết xuất methanol Codonopsis pilosula có tác dụng chống oxy hóa in vivo

31

và cộng nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường chống oxy hóa mơ hình chuột mắc bệnh tiểu đường cơng thức có tên gọi SR10, bao gồm rễ

Astragali, rễ Codonopsis Cortex Lycii Kết cho thấy SR10 có hiệu việc giảm mức đường huyết điều trị mãn tính cách cải thiện chức tế bào beta Các hoạt động biểu enzyme chống oxy hóa, catalase superoxide dismutase tăng lên điều trị SR10 Hơn nữa, SR10 không cho thấy tác dụng gây độc thể [34]

Enzym α-glucosidase enzym nằm màng đường ruột, tham gia vào bước cuối q trình tiêu hóa Enzym xúc tác cho q trình phân hủy đường disaccaride sucrose hay maltose thành monosaccharide glucose, chất ức chế enzym làm giảm trình hấp thu đường từ quan tiêu hóa vào máu Các chất ức chế enzym α-glucosidase sử dụng làm thuốc tân dược acarbose, voglibose, thường gây nên số tác dụng không mong muốn đau bụng, tiêu chảy, Trong nghiên cứu này, acarbose sử dụng làm chất đối chứng dương để đánh giá khả ức chế enzym α-glucosidase Kết nghiên cứu đề tài cho thấy cao chiết EtOH toàn phần, phân đoạn EtOAc n-BuOH rễ Hồng đảng sâm có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase mạnh so với chứng dương acarbose Ngoài ra, tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao chiết toàn phần cao chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm phụ thuộc vào nồng độ (hình 3.4) Hướng nghiên cứu loài việc điều trị bệnh ĐTĐ tiến hành phân tách hợp chất cao chiết để phân lập hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase với giá trị IC50 cao

Kết nghiên cứu cao chiết rễ C.Javanica đề tài tương đồng với nghiên cứu trước loài chi Codonopsis Kai He cộng chứng minh Codonopsis pilosula có khả hạ đường huyết chuột bị tiểu đường streptozotocin việc ức chế tốt enzym α-glucosidase [38] Suk Whan Jung cộng nghiên cứu rễ Codonopsis lanceolata có chứa hợp chất tangshenoside β-adenosine có tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro yếu với IC50 lần 1,4 9,3 mM [42]

32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro phân đoạn dịch chiết từ rễ Hồng đảng sâm thu phân đoạn EtOAc có tác dụng tốt với giá trị IC50 = 80,6 ± 2,8 µg/mL, xếp sau phân đoạn n-BuOH,

EtOH n-Hexan

Nghiên cứu đánh giá phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym α – glucosidase in vitro tốt với giá trị IC50 = 80,4 ± µg/mL so với

phân đoạn dịch chiết lại từ rễ Hồng đảng sâm Ngoài ra, hai phân đoạn n-BuOH EtOH cho thấy khả ức chế enzym α – glucosidase in vitro với IC50 lần

lượt 129,6 ± 6,2 99,5 ± 4,8 µg/mL KIẾN NGHỊ

Nghiên cứu thêm phương pháp tách chiết thành phần hóa học rễ Hồng đảng sâm dung môi khác để thu hàm lượng chất có tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym α – glucosidase cao

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

1 Nguyễn Tiến Bân, Trần Đình Lý, Nguyễn Tập cộng (2007), Sách đỏ Việt Nam (phần II - Thực vật), NXB Khoa học tự nhiên công nghệ

2 Đàm Trung Bảo (2001), "Các gốc tự do", Tạp chí Dược học, 6, tr 29-30

3 Bệnh viện Bạch Mai (2017), "Đái tháo đường", Hướng dẫn chẩn đoán điều trị bệnh nội khoa, NXB Y học, tr 411-416

4 Bộ Y tế (2009), "Bệnh học", Đái tháo đường, NXB Giáo Dục, tr 179 - 191

5 Bộ Y tế (2012), "Hormon thuốc điều trị rối loạn nội tiết", Dược lý học tập 2, NXB Y học, tr 303-304

6 Bộ Y Tế (2017), "Hướng dẫn chẩn đoán điều trị đái tháo đường típ 2"

7 Hồng Minh Chung (2003), "Định lượng số chất khống Đảng sâm Việt Nam, dịch chiết men bia chế phẩm SMC", Tạp chí dược liệu, 8(1), tr 21 - 23 Hoàng Minh Chung (2006), "Nghiên cứu bào chế Chế phẩm trà tan "Thảo Sâm Đông

Đơ" dùng cho cộng đồng", Tạp chí nghiên cứu y dược, 46(6), tr 109-113

9 Hoàng Minh Chung (2009), "Sesquiterpen Đảng sâm trước sau chế biến ", Tạp chí dược liệu, 14(3), tr 163 - 166

10 Hoàng Minh Chung (2010), "Phân lập, nhận dạng dẫn xuất glycosid Đảng sâm Việt Nam", Tạp chí dược liệu, 15(3), tr 182 - 186

11 Trần Thanh Hà, Hà Vân Oanh Đỗ Thị Hà (2016), "Thành phần hóa học phân đoạn chiết n-butanol rễ loài đảng sâm Việt Nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f) ", Tạp chí Dược học, 56(4)

12 Trần Thanh Hà, Nguyễn Minh Khởi, Nguyễn Thị Hà cộng (2014), "Thành phần hóa học rễ đảng sâm", Tạp chí Dược Liệu, 19, tr 211-215

13 Pham Thanh Huyen, Nguyen Quynh Nga, Phan Van Truong cộng (2014), "Study on Morphological and Microscopic Characteristic of Codonopsis javanica (Blume) Hook f & Thoms in Vietnam", Journal of Medicinal Materials-Hanoi,

19(5), tr 263-268

14 Đinh Đoàn Long Phạm Thanh Huyền (2017), "Sử dụng thị ADN (RAPD-PCR) nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng cơng tác bảo tồn phát triển Việt Nam", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, 33, tr 32-39

15 Đỗ Tất Lợi (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam

16 Nguyễn Văn Mùi (2015), Enzyme học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 361

17 Nguyễn Thị Thanh Nga (2012), Đánh giá đa dạng di truyền số loài dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) kỹ thuật AND mã vạchĐại học Quốc gia Hà Nội

18 Nguyễn Tập (2007), Cẩm nang thuốc cần bảo vệ Việt Nam, NXB Y học 19 Hoàng Thị Thúy (2019), Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase

tác dụng chống oxy hóa dịch chiết bơ (Persea americana Mill.), Khoa Y Dược - ĐHQGHN

21 Bùi Thanh Tùng, Đặng Kim Thu, Hải PT cộng (2018), "Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase phân đoạn dịch chiết Lựu (Punica granatum Linn)", Tạp chí Y Dược cổ truyền Việt Nam, 5(18), tr 59-63

22 Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Vol 23 Viện Dược Liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ thảo

dược, NXB Khoa học kỹ thuật

24 Đỗ Quốc Việt, Trần Văn Sung Nguyễn Thanh Thủy (2006), "Sơ nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết Chuối hột (Musa balbisiana Colla.) chuột thực nghiệm", Tạp chí Dược học, 5, tr 8-10

Tài liệu tiếng Anh

25 Kun-Ning Chen, Wen-Huang Peng, Chien-Wen Hou cộng (2013), "Codonopsis javanica root extracts attenuate hyperinsulinemia and lipid peroxidation in fructose-fed insulin resistant rats", journal of food and drug analysis, 21(4), tr 347-355

26 Abdullateef Isiaka Alagbonsi, Toyin Mohammed Salman, Hussein Mofomosara Salahdeen cộng (2016), "Effects of adenosine and caffeine on blood glucose levels in rats", Nigerian Journal of Experimental and Clinical Biosciences,

4(2), tr 35

27 Antonio Blanco Gustavo Blanco (2017), "Enzymes", Medical Biochemistry, tr 153-175

28 Halliwell B (1994), "Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence?", The Lancet, 344(8924), tr 721-724

29 Padavala Ajay Babu, Gadde Suneetha, Radha Boddepalli cộng (2006), "A database of 389 medicinal plants for diabetes", Bioinformation, 1(4), tr 130 30 John W Baynes (1991), "Role of oxidative stress in development of complications in

diabetes", Diabetes, 40(4), tr 405-412

31 D John Betteridge (2000), "What is oxidative stress?", Metabolism-Clinical and Experimental, 49(2), tr 3-8

32 Márcio Carocho Isabel CFR Ferreira (2013), "A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives", Food and chemical toxicology, 51, tr 15-25

33 Anitra C Carr Balz Frei (1999), "Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans", The American journal of clinical nutrition, 69(6), tr 1086-1107

34 Judy Yuet‐Wa Chan, Fung‐Chun Lam, Ping‐Chung Leung cộng (2009), "Antihyperglycemic and antioxidative effects of a herbal formulation of Radix Astragali, Radix Codonopsis and Cortex Lycii in a mouse model of type diabetes mellitus", Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives,

35 Chun Whan Choi, Yeon Hee Choi, Mi-Ran Cha cộng (2010), "Yeast α-glucosidase inhibition by isoflavones from plants of Leguminosae as an in vitro alternative to acarbose", Journal of agricultural and food chemistry, 58(18), tr 9988-9993

36 Rajnish Gupta, Anil K Sharma, MP Dobhal cộng (2011), "Antidiabetic and antioxidant potential of β‐sitosterol in streptozotocin‐induced experimental hyperglycemia", Journal of diabetes, 3(1), tr 29-37

37 Jing-Yu He, Na Ma, Shu Zhu cộng (2015), "The genus Codonopsis (Campanulaceae): a review of phytochemistry, bioactivity and quality control", Journal of natural medicines, 69(1), tr 1-21

38 Kai He, Xuegang Li, Xin Chen cộng (2011), "Evaluation of antidiabetic potential of selected traditional Chinese medicines in STZ-induced diabetic mice", Journal of ethnopharmacology, 137(3), tr 1135-1142

39 Kelly E Heim, Anthony R Tagliaferro Dennis J Bobilya (2002), "Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships", The Journal of nutritional biochemistry, 13(10), tr 572-584

40 Federation ID (2019), IDF Diabetes Atlas 9th Edition, 9th, International Diabetes Federation

41 Sang-Min Jeon, So-Young Kim, In-Hye Kim cộng (2013), "Antioxidant activities of processed Deoduck (Codonopsis lanceolata) extracts", Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, 42(6), tr 924-932

42 Suk Whan Jung, Ae Jin Han, Hae Jin Hong cộng (2006), "alpha-glucosidase inhibitors from the roots of Codonopsis lanceolata Trautv", Agricultural Chemistry and Biotechnology, 49(4), tr 162

43 Ritu Khanra, Niloy Bhattacharjee, Tarun K Dua cộng (2017), "Taraxerol, a pentacyclic triterpenoid, from Abroma augusta leaf attenuates diabetic nephropathy in type diabetic rats", Biomedicine & Pharmacotherapy, 94, tr 726-741

44 Sunil Kumar, Smita Narwal, Vipin Kumar cộng (2011), "α-glucosidase inhibitors from plants: A natural approach to treat diabetes", Pharmacognosy reviews, 5(9), tr 19

45 Chia-Ying Li, Hong-Xi Xu, Quan-Bin Han cộng (2009), "Quality assessment of Radix Codonopsis by quantitative nuclear magnetic resonance", Journal of Chromatography A, 1216(11), tr 2124-2129

46 Camilo López-Alarcón Ana Denicola (2013), "Evaluating the antioxidant capacity of natural products: A review on chemical and cellular-based assays", Analytica chimica acta, 763, tr 1-10

47 Ayman M Mahmoud Omnia E Hussein (2014), "Hesperidin as a promising anti-diabetic flavonoid: the underlying molecular mechanism", Int J Food Nutr Sci| Volume, 3(3), tr

48 Fahimeh Moradi-Afrapoli, Behavar Asghari, Soodabeh Saeidnia cộng (2012), "In vitro α-glucosidase inhibitory activity of phenolic constituents from aerial parts of Polygonum hyrcanicum", DARU Journal of Pharmaceutical Sciences,

49 Kenjiro Tadera, Yuji Minami, Kouta Takamatsu cộng (2006), "Inhibition of α-glucosidase and α-amylase by flavonoids", Journal of nutritional science and vitaminology, 52(2), tr 149-153

50 Marian Valko, Dieter Leibfritz, Jan Moncol cộng (2007), "Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease", The international journal of biochemistry & cell biology, 39(1), tr 44-84