Đề cương luận văn (y học) tìm điều kiện tối ưu cho một phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa cho các promoter wp, cp và qp của EBV, sử dụng các NL là các tế bào dòng
Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 24 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
24
Dung lượng
296,5 KB
Nội dung
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi khác quần thể dân cư vùng địa lý khác giới Nơi có tỷ lệ ung thư vịm cao miền Nam Trung Quốc Grơnlen, châu Âu lại có tỷ lệ thấp Các nước đơng nam Á, có Việt nam có tỷ lệ UTVMH trung bình Virut Epstein-Barr (EBV), yếu tố môi trường khác nhạy cảm di truyền cho liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mũi họng EBV yếu tố nghiên cứu nhiều EBV có mặt 100% khối u vịm mũi họng thể ung thư biểu mơ khơng biệt hóa tồn thể nhiễm tiềm ẩn I II, EBV biểu lộ gen quan trọng EBNA1, LMP1 EBNA1 giúp trì gen EBV tế bào chủ, LMP1 lại gen có chức quan trọng liên quan đến dẫn truyền tín hiệu, chống lại chết theo chương trình tế bào có khả sinh ung thư tế bào bị nhiễm Các gen nằm xa gen biểu lộ nhờ promoter khác EBNA1 biểu lộ thể nhiễm tiềm ẩn nhờ hoạt hóa promoter, bao gồm Cp, Wp Qp Tuy nhiên ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp Wp khơng hoạt động mà có Qp điều hòa biểu lộ gen EBNA1 Ngoại di truyền cho có vai trị quan trọng điều hịa biểu lộ gen, chúng bao gồm methyl hóa ADN vùng promoter, sửa chữa histon nucleosom Mức độ methyl hóa xảy vị trí CpG ADN vùng promoter exon1 có vai trị điều hịa biểu lộ gen, làm giảm biểu lộ khơng biểu lộ hồn tồn gen mà bình thường biểu lộ Việc xác định mức độ methyl hóa vùng khởi động gen có ý nghĩa quan trọng tìm hiểu chế bệnh sinh bệnh liên quan đến chức gen nhiều trình bệnh lý ung thư, đồng thời dấu ấn góp phần chẩn đốn sớm ung thư Ngồi ra, việc làm methyl hóa có tác dụng làm gen hoạt động trở lại thực chức chúng, giúp cho việc điều trị rối loạn hay bệnh lý khác Hiện nay, nhờ tiến sinh học phân tử người ta xác định mức độ methyl hóa gen đặc hiệu hay tồn bộ gen Các kỹ thuật dựa vào nguyên lý khác nhau, có kỹ thuật phức tạp, có ký thuật đơn giản thơng dụng Chúng sử dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa theo nguyên lý xử lý ADN phương pháp bisulfite để xác định mức độ methyl hóa promoter Wp, Cp Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1, đồng thời phát triển PCR đa mồi promoter Việc phát triển PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa giúp ích cho nghiên cứu ngoại di truyền mức độ ADN nhiều gen, đặc biệt gen ức chế ung thư Đề tài nhằm mục đích sau: Tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa cho promoter Wp, Cp Qp EBV, sử dụng nguyên liệu tế bào dòng Ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu xác định mức độ methyl hóa promoter điều hịa biểu lộ gen EBNA1 mẫu sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1.Tình hình ung thư vịm mũi họng giới Việt Nam Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), khối u phát triển từ tế bào biểu mô nằm vị trí cửa mũi sau vịm họng, loại đứng hàng đầu số ung thư vùng đầu mặt cổ, với tính chất dịch tễ học đặc biệt liên quan tới địa lý Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi giới xếp thành vùng khác nhau: Khu vực có tỷ lệ mắc cao miền Nam Trung Quốc Grơnlen với tỷ lệ mắc từ 30 - 40/100.000 dân/năm Ngược lại, vùng có tỷ lệ mắc thấp, gồm châu Âu, Mỹ từ 0,7 - 1/100.000 dân/ năm Cịn lại vùng có tỷ lệ mắc trung bình ngày có xu hướng tăng lên, vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee đông nam Á với tỷ lệ từ 12/100.000 dân (23,39)Ở Việt nam UTVMH đứng hàng thứ ung thư nói chung đứng hàng đầu ung thư vùng đầu mặt cổ [4] 1.2 Những yếu tố nguy liên quan đến UTVMH 1.2.1 Vai trò virut Epstein-Barr Virut Epstein-Barr (EBV), yếu tố môi trường nghiên cứu nhiều cho thấy có liên quan chặt chẽ với UTVMH Người ta phát thấy EBV có mặt 100% khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mơ khơng biệt hóa (UCNT) EBV phát từ tế bào UTVMH từ lympho thâm nhiễm chứng minh từ chuột trụi lông truyền khối u lấy từ bệnh nhân UTVMH, khối u không chứa lympho thâm nhiễm (Klein cs 1974) [trích từ 89] Ngồi ra, sản phẩm gen EBV EBER, EBNA1 LMP-1,-2 xác định hầu hết mẫu sinh thiết UTVMH tổn thương sản biểu mô vịm họng gồm dịng tế bào tiền ác tính nhiễm EBV Điều phù hợp với giả thuyết cho EBV yếu tố khởi phát trình nhiều bước dẫn đến phát triển UTVMH [124] Ngoài việc phát EBV sản phẩm khối u vịm họng, người ta xác định kháng thể chống EBV huyết bệnh nhân Lượng kháng thể IgG IgA huyết bệnh nhân UTVMH cao - 10 lần so với bệnh nhân ung thư đầu mặt cổ khác người khỏe lâm sàng (Henle cs 1970, 1973; Klein cs 1970) [trích từ 89 c.binh] Đặc biệt IgA/VCA (kháng nguyên vỏ EBV), xét nghiệm sử dụng rộng rãi, thường qui nhiều nước giới, có Việt Nam [6],[8],[7],[13],[18],[25],[156] , có giá trị để theo dõi phát nguy mắc UTVMH, đồng thời có giá trị dấu ấn quan trọng theo dõi tái phát sau điều trị bệnh tăng cao( ref) Người ta cho tái hoạt hóa, chép nhân lên EBV tượng xảy suốt trình phát triển UTVMH tương quan với nồng độ IgA/VCA [89] 1.2.2 Mơi trường sống thói quen sinh hoạt Nhiều tác giả đề cập đến mơi trường sống khí hậu, bụi, khói nhiễm liên quan đến UTVMH, nói đến nhiều tập quán ăn uống Nhiều nghiên cứu bệnh - chứng tiến hành thu kết phù hợp với ý kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan lớn ăn cá muối từ nhỏ Dùng cá muối hàng ngày làm tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến 7.5 lần Sử dụng thuốc cỏ liên quan đến UTVMH thơng qua hoạt hóa EBV trực tiếp thơng qua ảnh hưởng đến tăng trưởng đến tế bào chuyển dạng EBV Các chứng khác hút thuốc dùng formadehyde có giá trị thấp bệnh sinh ung thư vòm họng 5 1.2.3 Yếu tố di truyền Người ta thấy người Trung Quốc sinh Bắc Mỹ có tỷ lệ mắc thấp so với người sinh đất nước Trung Quốc, tỷ lệ mắc chuẩn cao dân số nói chung [2] Điều cho thấy yếu tố di truyền có vai trị bệnh sinh UTVMH Ở Việt Nam, việc nghiên cứu mối liên quan HLA UTVMH cho thấy có tăng nguy mắc UTVMH với tăng tần suất kháng nguyên A11, A2, B17 liên kết cân A2-B17, A11- B17 [13],[20] Việc xác định gen khác liên quan với tính cảm thụ bệnh lý nghiên cứu : CYP 2E1 (chuyển hóa nitrosamine), glutathion transferase M1 [111],[153] Cơ chế tác động chúng chưa rõ ràng, song điều khẳng định phát triển UTVMH phối hợp tác động yếu tố môi trường sống, EBV HLA 1.3 Virut Epstein-Barr 1.3.1 Sinh học EBV Trên thực tế, 90 % người trưởng thành giới nhiễm EBV tồn lâu dài thể nhiễm Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua nước bọt lứa tuổi sớm đời sống người mà thường khơng có triệu chứng Ngồi ra, EBV lây nhiễm qua máu, tổ chức qua sữa mẹ truyền sang con, chí thơng qua quan hệ tình dục EBV nhân lên tuyến nước bọt, sau qua biểu mơ vịm họng xâp nhập vào tế bào lympho B qua thụ thể CD21 bề mặt tế bào Sau vào nhân tế bào, EBV tồn dạng vòng chủ yếu tự nhân lên nhờ nguyên liệu tế bào Tuy nhiên, EBV tích hợp vào DNA nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ tế bào dịng Namalwa, tích hợp vào nhiẽm sắc thể vị trí 1p35 Ở thể nhiễm tiềm ẩn lympho B, EBV biểu lộ kháng nguyên, với số lượng tế bào nhiễm thấp (1 tế bào lympho B/1ml máu) EBV khó bị tiêu diệt hệ miễn dịch Khi thể dung giải, EBV nhân lên nhiều giải phóng ngồi lại nhiễm vào tế bào lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt hình thành chu kỳ nhân lên thể Với tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho virut vào cách sau: Khả thứ nhất: xảy tiếp cận tế bào biểu mô vòm họng tế bào nhiễm EBV Tế bào B vào chu trình dung giải, bung virus, cung cấp số lượng lớn hạt virus cho tế bào khác diện rộng (Bayliss Wolf 1980,1981) [trích từ 89] Và khả thứ hai: virus vào tế bào biểu mô tượng thực bào qua trung gian rexeptơ với IgA (Sixbey Yao, 1992) [trích từ 89] Ngồi ra, phân tử MHC lớp II đường virus xâm nhập vào tế bào biểu mơ [10] Ngoài tế bào lympho B tế bào biểu mơ, đơi EBV cịn bị cơng tế bào máu khác đai thực bào, lympho T tế bào diệt tự nhiên (Nature Killer cell) 1.3.2 Cấu trúc EBV EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài gen khoảng 172-kb ADN chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid Suốt chiều dài gen chia làm vùng chính: chuỗi ngắn (US- short unique ), chuỗi lặp ( IR- internal repeat), chuỗi dài (UL - long unique ) chuỗi lặp cuối ( TR - terminal repeat ) EBV hình thành phân tử DNA dạng vịng tế bào bị nhiễm đầu TR nó.(hình 1A) Khi xử lý EBV dòng tế bào B95-8 emzym cắt giới hạn BamHI, đoạn gen tạo ký hiệu theo bảng chữ theo thứ tự kích thước giảm dần (hình 1B) Thuật ngữ sử dụng cho đoạn sau: Theo chữ ký hiệu cho đoạn ( A, B …), đọc trực tiếp ( trái phải) số bắt đầu theo thứ tự (1,2,3…) ví dụ BARF0, BARF1 EBV dịng tế bào B95-8 giải trình tự gen đầu tiên, có mã số ngân hàng gen V01555 [1] Các EBV sản xuất khoảng 100 kháng nguyên khác (các phân tử protein lớn) thể dung giải nó, ngược lại, có khoảng 10 kháng nguyên sản xuất thể nhiễm tiềm ẩn [2] Hình Sơ đồ cấu trúc EBV EBER1&2: EBV Early RNA EBNA1-6: EBV Nuclear Antigen LMP1&2: Latent Membrane Protein A A BamHI B C TR US IR UL TR 1.3.3 Thể tiềm ẩn EBV Giống tất virut herpes, EBV tồn dạng không hoạt động tế bào bị nhiễm Ở thể này, EBV biểu lộ 12 gen, có 10 gen số phiên mã để tổng hợp protein, bao gồm loại protein kháng nguyên nhân (EBV Nuclear Antigen ): EBNA1, 2,,3A,3B,3C, -LP; loại protenin màng tiềm ẩn ( Latent Membrane Protein): LMP1, 2A, 2B; loại RNA khơng mã hóa (EBV Early RNA) : EBER1&2 Có bốn thể tiềm ẩn phân loại dựa biểu lộ gen virut ( liệt kê theo bảng dưới) [11] 8 Bảng 1: Thể tiềm ẩn Biểu lộ gen Người thường bệnh liên quan EBV EBER1 & Người thường I LMP2A +/EBER1 & U lympho Burkitt, II EBNA1 NPC EBER1 & NPC, U lympho loại Hodgkin EBNA1 LMP1 U lympho tế bào T, ung thư tuyến nước bọt… LMP2A&2B EBER1&2 III U lympho sau ghép tạng U lympho EBNA1- bệnh nhân AIDS, bạch cầu đơn nhân nhiễn LMP1 khuẩn, DLBCL? LMP2A & B 1.3.4 Các gen EBVcủa thể nhiễm tiềm ẩn 1.3.4.1 EBNA1 Protein EBNA1 EBV thuộc dịng tế bào B95-8 có trọng lượng khoảng 66-95 kDa chiều dài 641 axit amin Kích thước thay đổi chủng khác khác đoạn lặp lại glycin- alanin (GlyAla) [58] Các cấu trúc EBNA1 chia thành bốn vùng rõ ràng: vùng nằm đầu N gồm 89 acid amin, vùng lặp lại Gly-Ala gồm 239 acid amin, vùng ngắn vùng gắn DNA đầu C có chiều dài từ 459-641 [59, 60] (Hình 3) EBNA1 protein biểu lộ tất tế bào nhiễm EBV [61-64] đóng vai trị quan trọng việc trì episom EBV (dạng vịng) nhân tế bào chủ, chức phiên mã virut [65, 66] Vùng gắn ADN protein EBNA1 tương tác với hai vùng nằm vùng oriP prơmơtơ Cp, bao gồm gia đình lặp lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa 20 đoạn nucleitid có trình tự lặp, đoạn DS (Dyat Symetry) có vị trí gắn, vùng có hai vị trí gắn xi chiều Qp Hình Cấu trúc EBNA1 Liên kết EBNA1 với vùng FR có tính cao so với DS Qp gắn với FR điều hịa phiên mã gen EBNA Các gen biểu lộ kiểm soát prơmơtơ Cp hay prơmơtơ Wp EBNA1 liên kết với intron xuôi chiều prơmơtơ Qp làm tự điều hịa biểu lộ protein EBNA1 [72] Ở thể nhiễm tiềm ẩn I II, prômôtơ Cp không hoạt động biểu lộ EBNA1 thực Qp Cp không hoạt động yếu tố phiên mã methyl hóa ADN [73, 74] 1.3.4.2 EBNA2 Protein EBNA2, có trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa Do có trình tự gen khác chủng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A EBNA2B, dấu ấn quan trọngđể xếp loại EBV typ I typ II [78] Các protein EBNA2A EBNA2B chứa 484 443 axit amin cách tương ứng giống trình tự khoảng 57% [79, 80] EBNA2 protein virut biểu lộ tế bào lympho B bị nhiễm, xuất 24-48 sau nhiễm EBV nuôi cấy tế bào in vitro[81] Protein mộtchất kích hoạt phiên mã gen đặc hiệu virut tế bào bao gồm gen CD21, CD23, Bcl-2 c-myc [82, 83], cần thiết cho tế bào B in vitro [84, 85] EBNA2 không gắn trự tiếp với ADN, tác động thông qua protein in khác RBP-JK), PU1 protein tế bào khác 1.3.4.3 Gia đình EBNA3 ( EBNA3A, 3B 3C) 10 Các gen gia đình EBNA3 bao gồm EBNA3A, 3B 3C nằm gen EBV, có cấu trúc exon-intron tương tự có trọng lượng phân tử từ 140-180 kDa Các chuỗi acid amin EBNA3A, 3B 3C EBV typ II có giống 84%, 80% 72% cách tương ứng [89] Các protein hoạt động có chức phiên mã tương tác với protein RBP-JK [90] 1.3.4.4 EBNA-LP Các protein EBNA dẫn đầu EBNA-LP có kích thước khác từ 20130 kDa, kết hoạt động prômôtơ Wp Cùng với EBNA2, EBNALP protein biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bào lympho B in vitro 1.3.4.5 LMP1 Protein LMP1 phiên mã từ vùng BNLF1 nằm gần cuối đầu 3'của gen EBV có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chủng virus [104, 105] Ở chủng EBV tế bào dòng B95-8, protein có ba vùng, (i) vùng đầu N gồm 24 axit amin, (ii) sáu vùng xuyên màng kỵ nước kết nối ba vịng bên ngồi hai vịng nội bào (iii) vùng đầu C có 200 acid bao gồm hai lĩnh vực chức quan trọng[104, 106] gọi vùng hoạt hóa CTAR1 (C-Trminal Activation Region1: aa194232) CTAR2 ( aa 351-386) LMP1 tham gia ba chức chuyển dạng , di chống lại chết theo chương trình LMP1 coi sản phẩm gen sinh ung thư làm chuyển dạng ngun bào sợi động vật gặm nhấm, biến đổi tế bào Rat-1 ống nghiệm để tăng trưởng độc lập, tumorigenic chuột nude [109] Biểu LMP1 tác động ảnh hưởng đáng kể đến tăng trưởng tế bào biểu mô, ức chế biệt hóa 11 chúng, gây biến đổi hình thái số dịng tế bào biểu mơ [110, 111], làm tăng biểu yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR [112] 1.3.4 LMP2A/2B LMP2 mã hóa chỗ ghép nối hình thành dạng vịng EBV [119] LMP2 có hai loại LMP2A LMP2B, phiên mã từ hai prômôtơ khác khác LMP2A có thêm đoạn 119 acid amin đầu N tận cịn LMP2 khơng có Mặc dù chưa biết chức cụ thể LMP2B, việc biểu mạnh mẽ nócho thấy đóng vai trị quan trọng sinh học EBV [120] Trong chức LMP2A kiểm tra tế bào B Tuy nhiên, protein biểu lộ tỷ lệ thấp khôi u vòm họng 1.4 Yếu tố ngoại di truyền UTVMH Ngoại di truyền nghiên cứu chế làm không biểu lộ gen mà không liên quan đến thay đổi trình tự nucleotid gen Những biến đổi ngoại di truyền di truyền từ hệ tế bào sang tế bào khác Khi nói đến ngoại di truyền người ta thường nhấn mạnh yếu tố là: methyl hóa ADN, sửa chữa histon nucleosom Các thay đối độc lập với methyl hóa xảy mức độ ADN yếu tố lại diễn mức độ protein 1.4.1 Methyl hóa ADN điều hịa biểu lộ gen Methyl hóa ADN kiện diễn nhóm CH3 liên kết đồng hóa trị với vị trí cacbon số Xytosin nằm vị trí hai nu cleotid XytosinGuanin viết tắt CpG (p liên kết phosphodiester) Khi CpG tập hợp nhiều khoảng 200bp ví trí gen có GC chiếm 50% người ta gọi đảo CpG Khoảng 10-15% CpG động vật có vú nằm vùng đảo CpG đảo CpG thường xuất vị trí vùng prơmơtơ exon1của khoảng 40% gen động vật có vú Cơ chế gắn gốc CH3 vào ADN 12 trình phân bào nhờ enzym methyltransferase (DNMT) Có loại DNMT xác định động vật có vú enzym chuyển nhóm CH3 từ S-adenosyl methionin sang ADN Trong mơ bình thường đảo CpG thường khơng methyl hóa Khi chúng bị methyl hóa vùng khởi động dẫn đến hai chế điều hòa biểu lộ gen: Một là, ức chế yếu tố điều hòa biểu lộ gen gắn vào vùng khởi động gốc CH3 gắn vào Xytosin, chế minh họa hình (?) Hai là, có protein gắn đặc hiệu với CpG methyl hóa làm axetyl histon làm cấu trúc sợi chromatin co lại , cuối dẫn đến yếu tố phiên mã không gắn vào vùng DNA (Hình ?) Hình 13 Chú thích (Hình ): Một chế khơng biểu lộ gen methyl hóa ADN A: Hai nucleotid CpG vùng prơmơtơ khơng methyl hóa, cho phép phiên mã xảy tế bào bình thường B: Phiên mã bị chặn tăng methyla hóa vùng prơmơtơ Do methyl hóa ADN gen tế bào ung thư mục tiêu hấp dẫn điều trị kiến thức lĩnh vực chẩn đoán phân tử, tức là, phát sớm bệnh sử dụng PCR để xác định methyl hóa ADN [ luận án] 1.4.2 Methyl hóa ADN promotor EBNA1 14 EBNA1 biểu lộ tế bào nhiễm nhờ hoạt hóa promoter khác thể tiềm ẩn khác (Wp, Cp Qp) chu kỳ dung giải (Fp) Ở chu kỳ dung giải, EBNA1 biểu lộ promoter Fp hoạt hóa, promoter khác khơng hoạt động Ngược lại, thể nhiễm tiềm ẩn Wp, Cp Qp hoạt hóa, nhiên phụ thuộc vào thể nhiễm tiềm ẩn I, II hay III Ở thể nhiễm tiềm ẩn I II có Qp hoạt động, thể nhiễm tiềm ẩn III, hai promoter Wp Cp hoạt động Hai promoter hoạt động luân phiên Wp hoạt động trước thời gian ngắn, sau chuyển sang Cp hoạt động lâu dài Hình Các vùng promotor EBV điểu khiển phiên mã Việc promoter đóng mở thực yếu tố khác nhau, có methyl hóa CpG vùng promoter Ở thể nhiễm tiềm ẩn I II, promoter Wp Cp bị đóng lại, EBV biểu lộ EBNA1 Qp trường hợp UTVMH Tuy nhiên, người ta chưa biết ung thư vịm mũi họng EBV lại có biểu lộ số gen nêu, khác với số ung thư liên quan đến EBV Nghiên cứu methyl hóa giúp tìm hiều chế biểu lộ gen, đồng thời dấu ấn giúp cho 15 chẩn đoán điều trị liên quan đến ngoại di truyền rối loạn sửa chữa nhờ chất hóa học bổ sung vào tế bào Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Thời gian địa điểm nghiên cứu -Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/2011 đến tháng 10/2011 - Mẫu thu thập Khoa xạ trị tổng hợp, Bệnh viện K Hà Nội 16 - Các kỹ thuật tiến hành Phịng thí nghiệm môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh; Labo Trung tâm Y - Sinh học, Trường Đại học Y Hà Nội; Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện K Hà Nội 2.2 Đối tượng nghiên cứu 2.2.1 Nhóm bệnh nhân 2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân - Bệnh nhân nhập viện, chẩn đoán xác định UTVMH dựa vào triệu chứng lâm sàng kết giải phẫu bệnh mơ sinh thiết lấy từ khối u vịm họng Các bệnh nhân chọn vào nghiên cứu xếp loại giai đoạn từ II đến IVB với T 1-4 N 0–3 M0 theo cách phân loại T N M giai đoạn lâm sàng Hiệp hội quốc tế chống ung thư năm 1997 - Tiêu mô sinh thiết Những tiêu mô sinh thiết tươi tiêu mô sinh thiết đúc farafin bệnh nhân chẩn đốn UTVMH thể khơng biệt hóa 2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ - Các thể mơ bệnh học khác UCNT - Các bệnh nhân giai đoạn có di - Bệnh nhân đến khám định kỳ 2.3 Phương pháp tiêu nghiên cứu: 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu: - Thiết kế nghiên cứu mơ tả cắt ngang - Trình tự kỹ thuật cần thực hiện: + Thiết kế mồi 17 + Chiết tách AND, ARN, Protein + Xử lý AND Bisulfite + Chạy kỹ thuật PCR đơn mồi + Chạy kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu 2.3.2 Biến số số nghiên cứu: 2.3.3 Phương pháp thu thập thông tin - Quan sát ghi kết xét nghiệm - Hồi cứu thông tin từ hồ sơ bệnh án điền phiếu theo mẫu (phụ lục kèm theo) 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu làm trước nhập vào máy tính Xử lý số liệu phần mềm chương trình SPSS 15.0 với test thống kê thích hợp y học 18 2.5 Sơ đồ nghiên cứu ADN Mẫu Tách chiết mẫu ARN Protein RT-PCA Bisulfite MSP CDNA MMSP PCR 19 CHƯƠNG DỰ KIẾN KẾT QUẢ 20 CHƯƠNG DỰ KIẾN BÀN LUẬN 21 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 22 KHUYẾN NGHỊ 23 KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU Tiến độ thời gian Các hoạt động triển 1,2,3 khai Nghiên cứu tài liệu 4,5,6,7 10 viết, bảo vệ đề cương Thu thập số liệu Nhập số liệu Xử lý số liệu Viết báo cáo bảo vệ 2.Dự trù kinh phí Cơng việc 1.Chuẩn bị đề cương - Công thu thập tài liệu tham khảo - Photo tài liệu tham khảo - Hoàn thiện đề cương Thu thập số liệu - Triết tách mẫu - Hóa chất sinh phẩm: + Bisufite + DNTPs + Enzym (Buffer) + Mồi In ấn tài liệu Chi phí phát sinh Tổng số tiền Thành tiền 500.000đ 200.000đ 100.000đ 200.000đ 28.000.000 4000.0000 8000.000/1kit 7.500.000 5000.000/250 mẫu 3.500.000/40 Nucleotid 1.000.000đ 500.000đ 30.000.000đ 11,12 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN 1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng giới Việt Nam 1.2 Những yếu tố nguy liên quan đến UTVMH 1.2.1 Vai trò virut Epstein-Barr 1.2.2 Mơi trường sống thói quen sinh hoạt 1.2.3 Yếu tố di truyền .5 1.3 Virut Epstein-Barr 1.3.1 Sinh học EBV 1.3.2 Cấu trúc EBV 1.3.3 Thể tiềm ẩn EBV 1.3.4 Các gen EBVcủa thể nhiễm tiềm ẩn 1.4 Yếu tố ngoại di truyền UTVMH .11 1.4.1 Methyl hóa ADN điều hịa biểu lộ gen 11 1.4.2 Methyl hóa ADN promotor EBNA1 .13 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1.Thời gian địa điểm nghiên cứu .15 2.2 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2.1 Nhóm bệnh nhân 16 2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 16 2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ .16 2.3 Phương pháp tiêu nghiên cứu: 16 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu: 16 2.3.2 Biến số số nghiên cứu: 17 2.3.3 Phương pháp thu thập thông tin 17 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 17 2.5 Sơ đồ nghiên cứu 18 DỰ KIẾN KẾT QUẢ 19 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 20 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 21 KHUYẾN NGHỊ 22 ... gen, đặc biệt gen ức chế ung thư Đề tài nhằm mục đích sau: Tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa cho promoter Wp, Cp Qp EBV, sử dụng nguyên liệu tế bào dòng Ứng dụng PCR. .. xác định mức độ methyl hóa promoter Wp, Cp Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1, đồng thời phát triển PCR đa mồi promoter Việc phát triển PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa giúp ích cho nghiên cứu ngoại... gen methyl hóa ADN A: Hai nucleotid CpG vùng prômôtơ không methyl hóa, cho phép phiên mã xảy tế bào bình thường B: Phiên mã bị chặn tăng methyla hóa vùng prơmơtơ Do methyl hóa ADN gen tế bào