Nghiên cứu thành phần hóa học định hướng tác dụng chống oxy hóa của tràm gió melaleuca cajuputi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  Trần Thạch Thảo NGHIÊN CỨU THÀNH PHÂN HOA HỌC HƯƠNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOA CỦA LÁ TRÀM GIO (Folium Melaleucae) Luận văn Thạc sĩ Dược học: Dược liệu - Dược cổ truyền Thành phố Hồ Chí Minh - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  Trần Thạch Thảo NGHIÊN CỨU THÀNH PHÂN HOA HỌC HƯƠNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOA CỦA LÁ TRÀM GIO Folium Melaleucae Chuyên ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 60 72 04 06 Luận văn Thạc sĩ Dược học: Dược liệu - Dược cổ truyền NGƯỜI HƯỚNG DẤN KHOA HỌC: TS VÕ VĂN LẸO Thành phố Hồ Chí Minh - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Tác giả Trần Thạch Thảo TOM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược sĩ – năm học 2015 – 2017 Chuyên ngành: Dược liệu – Dược cổ truyền NGHIÊN CỨU THÀNH PHÂN HOA HỌC HƯƠNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOA CỦA LÁ TRÀM GIO (Folium Melaleucae) Trần Thạch Thảo Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Văn Lẹo Mở đầu Tràm gió (Melaleuca cajuputi Powel) dược liệu dùng nhiều cho mục đích chiết tinh dầu chưa có nghiên cứu nước thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa lồi Đó lí tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa Tràm gió Folium Melaleucae” Đối tượng: Tràm gió Melaleuca cajuputi Powell Quảng Ngãi Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa phân đoạn cao chiết mơ hình DPPH Sử dụng phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng, sắc ký cột chân không, sắc ký Sephadex LH-20 phương pháp tinh chế khác để phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh Xác định cấu trúc dựa vào liệu khối phổ phổ NMR Kết bàn luận Bột Tràm gió (10 kg) chiết ngấm kiệt với cồn 80%, thu cao cồn đặc (1,9 kg) Từ cao cồn, chiết phân bố lỏng – lỏng với dung môi thu cao nhexan (1,34 g), cao chloroform (85,89 g), cao ethyl acetat (152 g) cắn A từ dịch ethyl acetat (3,45 g) Hoạt tính chống oxy hóa cao nồng độ 6,25 µg/ml cho kết giảm dần theo thứ tự sau: cao ethyl acetat (39,52%) > cao nước (11,02% ) > cao cloroform (10,69%) > cao n-hexan (2,23% ) Do cao ethyl acetat chọn để khảo sát tiếp thành phần hóa học Từ 40 g cao ethyl acetat thu chất IC50 chất phân lập cao ethyl acetat xác định so sánh với acid ascorbic, kết thu sau: acid ascorbic (IC50 = 2,41 µg/ml) > cao EA 8,23 (µg/ml) > myricitrin (9,87 µg/ml) > myricitin 3-O-methyl 3’-β-D-xylopyranosid (12,95 µg/ml) > quercitin 3-O-methyl 3’β-D-xylopyranosid > acid 3,3’,4-tri-O-methylellagic ABTRACT Thesis of master of pharmacy, course: 2015 – 2017 Major: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION FOR THE ANTIOXIDANT CONSTITUENTS OF CAJETUT TREE’S LEAVES (Folium Melaleucae) Tran Thach Thao Dr Võ Văn Leo Introduction Melaleuca cajuputi Powell is a plant has been used for extracting oil But there has not been any study about other chemical constituents of Melaleuca cajuputi Powell in Vietnam Therefore, in this study, we aim to isolate substances of the leaves of Melaleuca cajuputi Powell for the antioxidant activity on DPPH Materials: the leaves of Melaleuca cajuputi Powell, collected in Quang Ngai Province Methods In-vitro screening of fractions and isolated compounds for the antioxidant activity on DPPH assay Method of liquid-liquid extraction, vacuum liquid chromatography, sephadex-LH20 chroamatography and other refined means were performed to isolate pure compounds from fractions that had highly effective antioxidant outcome Structure ellucidations were based on NMR and MS data Results and discussion The leave powder of Melaleuca cajuputi Powell (10 kg) was perculated with 80 % alcohol to obtain alcohol extract (1,9 kg) Alcohol extract was then consecutively liquid-liquid extracted with solvents to obtain n-hexane extract (1,34 g), chloroform extract (85,89 g), ethyl acetate extract (152 g) and a pricipitate A (3,45 g) from the ethyl acetate extract At the concentration of 6,25 µg/ml, the result of antioxidant effects of extracts were as follows: ethyl acetate extract (39,52%) > water extract (11,02%) > chloroform extract (10,69% ) > n-hexane extract (2,23%) Therefore, the ethyl acetate extract was selected for further analysis of chemical compounds From 40 g of the ethyl acetate extract, four compounds were achieved IC50 values of isolated substances and ethyl acetate extract were compared with ascorbic acid and the results obtained were as follows: acid ascorbic (IC50 = 2,41 µg/ml) > cao EA (8,23 µg/ml) > myricitrin (9,87 µg/ml) > myricitin 3-O-methyl 3’-β-D-xylopyranosid (12,95 µg/ml) > quercitin 3-O-methyl 3’-β-D-xylopyranosid methylellagic > acid 3,3’,4-tri-O- MỤC LỤC TÓM TẮT LUẬN VĂN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .6 DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 11 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 13 1.1.1 Vị trí phân loại 13 1.1.2 Đặc điểm họ Myrtaceae (Họ Sim) 13 1.1.3 Mơ tả hình thái chi Melaleuca L 14 1.1.4 Đặc điểm thực vật học loài Melaleuca cajuputi Powell 16 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 18 1.2.1 Thành phần hóa học chi Melaleuca 18 1.2.2 Thành phần hóa học loài Melaleuca cajuputi Powell 20 1.3 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 21 1.3.1 Theo y học cổ truyền .21 1.3.2 Theo y học đại .22 1.4 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA 23 1.4.1 Khái niệm 23 1.4.2 Hệ thống chống oxy hoá 24 1.4.3 Cơ chế chống oxy hóa 25 1.4.4 Các thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa .25 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 29 2.1.1 Nguyên liệu 29 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 29 2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 29 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.2.1 Nghiên cứu thực vật học 31 2.2.2 Thử tinh khiết 31 2.2.3 Xác định hàm lượng chất chiết dược liệu 31 2.2.4 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật .31 2.2.5 Chiết xuất 32 2.2.6 Tách phân đoạn chiết phân bố lỏng-lỏng .32 2.2.7 Phương pháp sàng lọc tác dụng chống oxy hóa mơ hình in vitro 32 2.2.8 Phân lập tinh chế chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa 34 2.2.9 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 35 2.2.10 Xác định khả chống oxy hóa chất tinh khiết 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38 3.1 NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC 38 3.1.1 Đặc điểm hình thái dược liệu 38 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu Tràm gió 38 3.1.3 Soi bột dược liệu Tràm gió 40 3.2 THỬ TINH KHIẾT 41 3.3 HÀM LƯỢNG CHẤT CHIẾT ĐƯỢC TRONG BỘT LÁ TRÀM GIÓ 42 3.4 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 42 3.4.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật .42 3.3.2 Chiết xuất phân lập chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa 43 3.3.3 Kiểm tra khả chống oxy hóa cao chiết phân đoạn 45 3.3.4 Phân lập chất từ cao EA 47 3.4.5 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập SKLM 52 3.4.6 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập UPLC 57 3.4.7 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 63 3.4.8 Tóm tắt kết trình chiết xuất phân lập 90 3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TRÊN CHẤT TINH KHIÊT 90 3.5.1 Định tính SKLM 90 3.5.2 Thử HTCO chất phân lập phương pháp DPPH 91 3.6 BÀN LUẬN 97 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO 101 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt br C-NMR 13 H-NMR Chữ nguyên broad C-Nuclear Magnetic Resonance 13 H-Nuclear Magnetic Resonance Ý nghĩa Đỉnh rộng Cộng hưởng từ hạt nhân C13 1 Cộng hưởng từ hạt nhân proton CF Chloroform Cloroform COSY Correlated Spectroscopy Phổ tương quan 1H – 1H d doublet Đỉnh đôi DCM Dichloromethane Dicloromethan dd doublet of doublets Đỉnh đôi kep DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Phổ DEPT DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EA Ethyl acetate Ethyl acetat HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ HMBC HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ HSQC HTCO Hoạt tính chống oxy hóa IC50 Inhibitor concentration 50% Nồng độ ức chế 50% J coupling constant Hằng số ghep J m multiplet Nhiều đỉnh, đỉnh bội MDA Malonyl dialdehyd MS Mas spectrometry Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân ppm parts per million Phần triệu s singlet Đỉnh đơn SKLM Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng tR Retention time Thời gian lưu UV Ultra violet (Phổ) tử ngoại VLC Vacuum liquid chromatography Sắc k (cột) chân không VS Vanilin - sulfuric Thuốc thử Vanilin-sulfuric DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình Tràm gió (Melaleuca cajuputi Powell) 17 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học flavonoid phân lập từ Melaleuca leucadendra L 19 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học polyphenol phân lập từ Melaleuca quinquenervia (Cav.) S T Blake .20 Hình 1.4 Flavonoid Tràm gió Melaleuca cajuputi Powell 20 Hình 1.5 Chromon Tràm gió Melaleuca cajuputi Powell 21 Hình 3.6 Đặc điểm hình thái Tràm gió (Melaleuca cajuputi Powell) 38 Hình 3.7 Vi phẫu (A), Sơ đồ cấu tạo (B) Tràm gió 38 Hình 3.8 Cấu tạo giải phẫu Tràm gió 39 Hình 3.9 Bột Tràm gió 40 Hình 3.10 Các cấu tử bột Tràm gió 41 Hình 3.11 SKLM kiểm tra cao phân bố 45 Hình 3.12 Sắc ký đồ cao phân đoạn Tràm gió với TT DPPH 46 Hình 13 Biểu đồ kết thử HTCO phân đoạn cao chiết 47 Hình 3.14 Sắc ký đồ phân đoạn cao EA qua cột VLC 49 Hình 3.15 Sắc ký đồ ME-1 hệ dung môi .54 Hình 3.16 Sắc ký đồ ME-2 ME-3 hệ dung môi 55 Hình 3.17 Sắc ký đồ ME-4 hệ dung môi .56 Hình 3.18 Sắc ký đồ ME-5 hệ dung môi .57 Hình 3.19 Sắc ký đồ UPLC ME-1 59 Hình 3.20 Sắc ký đồ UPLC ME-2 60 Hình 3.21 Sắc ký đồ UPLC ME-3 61 Hình 3.22 Sắc ký đồ UPLC ME-4 62 Hình 3.23 Sắc ký đồ UPLC ME-5 63 Hình 3.24 Phổ MS (MS-) ME-1 64 Hình 3.25 Phổ UV (MeOH) ME-1 64 Hình 3.26 Khung ME-1 65 Hình 3.27 Công thức cấu tạo ME-1 67 Hình 3.28 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) ME-1 69 Hình 3.29 Phổ MS (MS-) ME-2 69 Hình 3.30 Phổ UV (MeOH) ME-2 70 PL-18 Phụ lục 35 Phổ 13C & DEPT-NMR (DMSO d6,, 125 MHz) ME-3 Phụ lục 36 Phổ 13C & DEPT-NMR (DMSO d6,, 125 MHz) trích vung 65-110 ppm ME-3 PL-19 Phụ lục 37 Phổ HSQC (DMSO d6,) hợp chất ME-3 Phụ lục 38 Phổ HSQC (DMSO d6) trích vung 65-110; 3-7 ppm ME-3 PL-20 Phụ lục 39 Phổ HMBC (DMSO d6,) ME-3 Phụ lục 40 Phổ HMBC (DMSO d6,) trích vung 90-170; 4-13 ppm ME-3 PL-21 Phụ lục 41 Phổ HMBC (DMSO d6,) trích vung 90-165; 5-7 ppm ME-3 Phụ lục 42 Phổ HMBC (DMSO d6,) trích vung 15-75; 0,5-5,5 ppm ME-3 PL-22 Phụ lục 43 Phổ HMBC (DMSO d6) trích vung 66-75,5; 0,5-5,5 ppm ME-3 Phụ lục 44 Phổ COSY (DMSO d6) ME-3 PL-23 Phụ lục 45 Phổ COSY (DMSO d6) trích vung 6-7,1 ppm ME-3 Phụ lục 46 Phổ COSY (DMSO d6) trích vung 3-5,4 ppm ME-3 PL-24 Phụ lục 47 Phổ COSY (DMSO d6) trích vung 0,5-3,5 ppm ME-3 Phụ lục 48 Phổ 13C-NMR (DMSO d6,, 125 MHz) ME-4 PL-25 Phụ lục 49 Phổ 13C-NMR (DMSO d6,, 125 MHz) trích vung 65-180 ppm ME-4 Phụ lục 50 Phổ 1H-NMR (DMSO d6,, 500 MHz) ME-4 PL-26 Phụ lục 51 Phổ 1H-NMR (DMSO d6,, 500 MHz) trích vung 6,1-7,9 ppm ME-4 Phụ lục 52 Phổ 1H-NMR (DMSO d6,, 500 MHz) trích vung 3,2-5,8 ppm ME-4 PL-27 Phụ lục 53 Phổ 13C & DEPT-NMR (DMSO d6,, 125 MHz) ME-4 Phụ lục 54 Phổ 13C & DEPT-NMR (DMSO d6,, 125 MHz) trích vung 60-175 ppm ME-4 PL-28 Phụ lục 55 Phổ HSQC (DMSO d6) ME-4 Phụ lục 56 Phổ HSQC (DMSO d6) trích vung 90-125; 6-8 ppm ME-4 PL-29 Phụ lục 57 Phổ HSQC (DMSO d6) trích vung 55-105; 3-5 ppm ME-4 Phụ lục 58 Phổ HMBC (DMSO d6) ME-4 PL-30 Phụ lục 59 Phổ HMBC (DMSO d6) trích vung 90-165; 6-8 ppm ME-4 Phụ lục 60 Phổ HMBC (DMSO d6) trích vung 65-155; 3-5,2 ppm ME-4 PL-31 Phụ lục 61 Phổ COSY (DMSO d6) ME-4 Phụ lục 62 Phổ COSY (DMSO d6) trích vung 3-5,2 ppm ME-4 PL-32 Phụ lục 63 Phổ COSY (DMSO d6) trích vung 6-8 ppm ME-4 ... có nghiên cứu nước thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa lồi Đó lí tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa Tràm gió Folium Melaleucae” Đối tượng: Tràm gió. .. nghiên cứu thành phần tác dụng thành phần tinh dầu 12 Chính thực tiễn đó, khn khổ luận văn cao học, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa Tràm gió Melaleuca. .. cao dùng để phân tích thành phần hóa học thử tác dụng chống oxy hóa 2.2.7 Phương pháp sàng lọc tác dụng chống oxy hóa mơ hình in vitro 2.2.7.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa phương pháp DPPH