Nghiên cứu khảo sát hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase của một số dược liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ THỊ QUỲNH QUYÊN NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT Thành phố Hồ Chí Minh – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ THỊ QUỲNH QUYÊN NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc Độc chất Mã số: 62 72 04 10 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Thị Minh Thuận PGS TS Võ Thị Bạch Huệ Thành phố Hồ Chí Minh – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Đỗ Thị Quỳnh Qun LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực luận văn, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô, đồng nghiệp bạn bè công tác nhiều quan đơn vị khác Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Võ Thị Bạch Huệ TS Nguyễn Thị Minh Thuận, hai người thầy tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Trong q trình thực đề tài, tơi ln nhận phối hợp giúp đỡ cá nhân nhiều quan đơn vị khác Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị đồng nghiệp bạn bè công tác Bộ môn Kiểm nghiệm, Bộ môn Dược liệu Bộ mơn Sinh Hóa Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học – Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược TPHCM tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập thực luận văn Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè, người bên, động viên giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn trình học tập nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn tất giúp đỡ quý báu này! Đỗ Thị Quỳnh Quyên i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .iv DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC BẢNG .vi MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bệnh Alzheimer 1.1.1 Tổng quan bệnh Alzheimer 1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh Vai trò hệ cholinergic bệnh Alzheimer 1.2.1 Acetylcholin 1.2.2 Enzym acetylcholinesterase 1.2.3 Giả thuyết vai trò hệ cholinergic bệnh Alzheimer 1.2.4 Các chất kháng enzym AChE dùng để điều trị bệnh Alzheimer Các thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng AChE .9 1.3.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman 1.3.1.1 Phương pháp đo quang .9 1.3.1.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học 10 1.3.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B 10 1.3.2.1 Phương pháp đo quang .11 1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học 11 Tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài ngồi nước 12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước ngồi 12 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 14 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 ii Đối tượng nghiên cứu .16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 17 2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 18 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE mẫu dược liệu 19 2.2.1.1 Chuẩn bị mẫu để nghiên cứu 19 2.2.1.2 Khảo sát phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE mẫu dược liệu in vitro 19 2.2.1.3 Đánh giá khả ức chế enzym AChE in vitro mẫu dược liệu 24 2.2.2 Khảo sát thành phần hóa thực vật mẫu dược liệu theo định hướng tác dụng ức chế enzym AChE 25 2.2.2.1 Xác định nguyên liệu .25 2.2.2.2 Chiết xuất cao toàn phần 25 2.2.2.3 Tách phân đoạn 25 2.2.3 Khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn phân lập 26 KẾT QUẢ 27 Sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE mẫu dược liệu .27 3.1.1 Chuẩn bị mẫu để nghiên cứu 27 3.1.2 Khảo sát phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE mẫu dược liệu in vitro 28 3.1.2.1 Thí nghiệm 1: khảo sát bước sóng hấp thu phản ứng 28 3.1.2.2 Thí nghiệm 2: khảo sát dung mơi hịa tan mẫu 29 3.1.2.3 Thí nghiệm 3: khảo sát động học phản ứng enzym AChE với chất thuốc thử 29 iii 3.1.3 Đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE in vitro mẫu dược liệu 30 Khảo sát thành phần hóa thực vật Dừa cạn theo định hướng tác dụng ức chế enzym AChE 33 3.2.1 Xác định nguyên liệu 33 3.2.1.1 Khảo sát thực vật học .33 3.2.1.2 Định tính sơ thành phần hóa học dược liệu 39 3.2.2 Chiết xuất cao toàn phần 40 3.2.3 Tách phân đoạn cao alkaloid 41 3.2.3.1 Sắc ký cột cao phân đoạn 43 3.2.3.2 Sắc ký cột cắn không tan .45 Khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn phân lập .50 BÀN LUẬN 52 Sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE mẫu dược liệu 52 Khảo sát thành phần hóa thực vật Dừa cạn theo định hướng tác dụng ức chế enzym AChE 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ tiếng Anh Từ tiếng Việt ACh Acetylcholine Acetylcholin AChE Acetylcholinesterase Enzym acetylcholinesterase AChEi Acetylcholinesterase inhibitor Chất ức chế enzym acetylcholinesterase AD Alzheimer disease Bệnh Alzheimer APP Amyloid precursor protein Gen sản xuất protein tiền chất amyloid ATCI Acetylthiocholine iodide Acetylthiocholin iodid Aβ Amyloid beta Amyloid beta BTLC Bioautography in the thin layer Sắc ký lớp mỏng sinh học chromatography BChE Butyrylcholinesterase Enzym butyrylcholinesterase DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxid DTNB 5,5’- dithiobis - nitrobenzoic acid Acid 5,5’- dithiobis - nitrobenzoic EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% NMDA N-methyl-D-aspartate N-methyl-D-aspartat MeOH Methanol Methanol VS Vanillin sulfuric acid reagent Thuốc thử vanillin – sulfuric v DANH MỤC CÁC HÌNH Hin ̀ h 1.1 Công thức cấu tạo acetylcholin Hình 1.2 Tóm tắt trình tổng hợp ACh mắc bệnh Alzheimer có ức chế enzym AChE [31] Hin ̀ h 1.3 Các vị trí hoạt động AChE Hình 1.4 Cơ chế chất ức chế AChE thuận nghịch .8 Hin ̀ h 3.1 Phổ UV – Vis hỗn hợp phản ứng enzym AChE với ACTI DTNB 28 Hin ̀ h 3.2 Kết khảo sát động học phản ứng enzym nồng độ 0,25U/ml .30 Hin ̀ h 3.3 Tương quan độ hấp thu mẫu thử thời gian phản ứng khoảng thời gian – 20 phút 30 Hin ̀ h 3.4 Sơ đồ quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế AChE in vitro 31 Hình 3.5 Cây Dừa cạn .33 Hin ̀ h 3.6 Hoa Dừa cạn 34 Hin ̀ h 3.7 Vi phẫu rễ Dừa cạn 35 Hình 3.8 Vi phẫu thân Dừa cạn 36 Hin ̀ h 3.9 Vi phẫu Dừa cạn (A), mô mềm giậu (B), lỗ khí (C) .37 Hình 3.10 Soi bột dược liệu Dừa cạn .38 Hin ̀ h 3.11 Quy trình chiết xuất alkaloid từ dược liệu Dừa cạn 41 Hin ̀ h 3.12 Quy trình xử lý sơ cao alkaloid toàn phần 42 Hình 3.13 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra cao phân đoạn 43 Hin ̀ h 3.14 Sắc ký lớp mỏng phân đoạn H1 - H8 45 Hình 3.15 Sắc ký lớp mỏng phân đoạn E1 – E18 47 Hình 3.16 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh khiết kết tinh .49 vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục dược liệu tiến hành khảo sát sơ tác dụng ức chế AChE 16 Bảng 2.2 Thành phần hỗn hợp phản ứng khảo sát tác dụng ức chế AChE 23 Bảng 3.1 Kết chiết xuất cao toàn phần mẫu dược liệu thử nghiệm cồn 80% 27 Bảng 3.2 Kết khảo sát dung mơi hịa tan mẫu 29 Bảng 3.3 Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định 31 Bảng 3.4 Kết đánh giá sơ khả ức chế enzym AChE mẫu dược liệu nghiên cứu 32 Bảng 3.5 Kết khảo sát thành phần hóa thực vật Dừa cạn 39 Bảng 3.6 Kết tách cao phân đoạn 44 Bảng 3.7 Kết tách phân đoạn cắn không tan 46 Bảng 3.8 Kết đánh giá hoạt tính kháng enzym AChE phân đoạn cột cao phân đoạn .50 Bảng 3.9 Kết đánh giá hoạt tính kháng enzym AChE phân đoạn cột cắn không tan 50 Bảng 3.10 Kết đánh giá hoạt tính kháng enzym AChE kết tinh thu 51 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 50 Kết quả: C.r.1 C.r.3 cho vết SKLM hai hệ dung môi C.r.2 cho hai vết sắc kí lớp mỏng Ba kết tinh khơng cho tín hiệu kiểm tra tinh khiết máy HPLC – PDA bước sóng 200 – 600nm Khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn phân lập Áp dụng phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế AChE in vitro xác định mục 3.1.3 để khảo sát tác dụng phân đoạn phân lập từ hai cột kết tinh thu Kết trình bày bảng 3.8, 3.9 3.10 Bảng 3.8 Kết đánh giá hoạt tính kháng enzym AChE phân đoạn cột cao phân đoạn Phân đoạn (1mg/ml) H1 H2 H3 H4 % ức chế 4,97 13,15 6,31 -7,26 Phân đoạn (1mg/ml) H5 H6 H7 H8 % ức chế 30,22 17,20 16,74 29,90 Bảng 3.9 Kết đánh giá hoạt tính kháng enzym AChE phân đoạn cột cắn không tan Phân đoạn (1mg/ml) E1 E2 E3 E4 E5 E6 % ức chế -6,47 13,54 25,61 13,10 18,99 16,93 Phân đoạn (1mg/ml) E7 E8 E9 E10 E11 E12 % ức chế 23,98 19,27 25,70 16,46 22,69 35,65 Phân đoạn (1mg/ml) E13 E14 E15 E16 E17 E18 % ức chế 40,24 67,26 61,97 68,45 78,79 37,16 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 51 Bảng 3.10 Kết đánh giá hoạt tính kháng enzym AChE kết tinh thu Kết tinh (1mg/ml) C.r.1 C.r.2 C.r.3 % ức chế 15,74 0,57 58,42 Nhận xét: kết tinh thu được, nhận thấy C.r.3 có khả ức chế enzym AChE trung bình nồng độ 1mg/ml (58,42%) Ở nồng độ 1mg/ml, phân đoạn cắn không tan cho kết ức chế enzym tốt so với phân đoạn cao phân đoạn Trong đó, phân đoạn E17 có kết ức chế enzym mức cao (78,79%), phân đoạn E14 E16 cho kết mức tương đối (67,26 68,45%) Các phân đoạn tiếp tục phân lập thành chất tinh khiết có điều kiện Có hai phân đoạn cho kết âm dung mơi khơng thể hịa tan hồn tồn mẫu làm cho dung dịch phản ứng bị đục dẫn tới sai lệch kết Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 52 BÀN LUẬN Sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE mẫu dược liệu Qua tài liệu tổng quan dược liệu hoạt chất có tác dụng kháng AChE sàng lọc nhiều nước giới, chọn 12 để tiến hành nghiên cứu sàng lọc [27, 32, 46, 59] Quy trình chiết xuất mẫu chuẩn bị cho phần sàng lọc Chúng chọn cồn 80% dung mơi chiết cồn chiết hầu hết chất có dược liệu Đề tài tiến hành chiết kiệt phương pháp chiết nóng từ định hướng cho việc chiết số lượng lớn để tiết kiệm chi phí, lượng mẫu thời gian nghiên cứu Quy trình khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE Trong trình nghiên cứu tìm kiếm hợp chất có tác dụng ức chế AChE, ngồi phương pháp in vitro đề cập cịn có hai mơ hình khác sử dụng mơ hình ex vivo mơ hình in vivo Việc lựa chọn mơ hình số mơ hình kể để nghiên cứu phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu Đề tài giai đoạn nghiên cứu sàng lọc ban đầu nên phương pháp in vitro lựa chọn ưu điểm cho kết nhanh, tiến hành đồng thời nhiều mẫu tốn Từ quy trình thử nghiệm tham khảo phần tổng quan, nhận thấy quy trình có điều chỉnh chất tham gia thử nghiệm ln có enzym, ACTI DTNB, yếu tố thay đổi quy trình thành phần đệm dung mơi pha mẫu Trong đó, enzym sử dụng nghiên cứu đa phần enzym từ cá chình điện Electrophorus electricus, có nghiên cứu sử dụng enzym sản xuất từ bò người Tuy nhiên chưa có nghiên cứu so sánh hiệu độ xác hai nguồn enzym Nồng độ enzym, ACTI DTNB sử dụng đề tài điều chỉnh cho phù hợp với nghiên cứu điều kiện kinh phí Các tài liệu cho thấy nồng độ enzym thấp sử dụng 0,2U/ml đề tài sử dụng nồng độ 0,25U/ml để tiến hành khảo sát phù hợp với nghiên cứu có số lượng mẫu lớn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 53 Lượng ACTI DTNB sử dụng có nhiều so với vài tài liệu để đảm bảo cho phản ứng enzym chất diễn hoàn toàn, hạn chế sai lệch kết đo Đề tài tiến hành thử nghiệm xác định bước sóng đo độ hấp thu, xác định dung mơi hịa tan, thời gian phản ứng ổn định để đo độ hấp thu Nếu dung mơi hịa tan mẫu khơng hồn tồn dung mơi ảnh hưởng nhiều đến enzym chất trình phản ứng dẫn đến sai số ảnh hưởng đến kết khảo sát Đồng thời thời gian để phản ứng ổn định không đủ dài sai lệch kết Dù có mức ảnh hưởng đến phản ứng lớn so với methanol nhiên DMSO hòa tan mẫu tốt so với MeOH nên cuối cùng, đề tài chọn dung mơi hịa tan mẫu DMSO 10% thời gian để phản ứng ổn định 15 phút Quá trình triển khai phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman in vitro nhận thấy kết thực nghiệm bị sai số vài nguyên nhân đây: - Sự có mặt tạp chất chất thử hỗn hợp phản ứng: tạp chất chất thử gây số tượng phản xạ, tán xạ ánh sáng hấp thu ánh sáng - Phản ứng thủy phân chất xảy enzym xúc tác: số chất tự phân hủy mà không cần enzym thủy phân Tỷ lệ chất tham gia phản ứng phụ thuộc chủ yếu vào độ bền hóa học chất tức phụ thuộc vào đặc tính hóa học - Dung mơi sử dụng để hịa tan mẫu thử: loại dung mơi thường dùng để hịa tan mẫu thử MeOH, ACN DMSO có tác dụng ức chế hoạt tính AChE mức độ khác Để hạn chế tác dụng ức chế hoạt tính enzym AChE dung môi, nồng độ hỗn hợp phản ứng cuối hai dung môi MeOH DMSO nên tối đa 10% 1% Vì vậy, số biện pháp áp dụng nghiên cứu để hạn chế tối đa sai số gặp phải gồm: - Sử dụng hóa chất đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 54 - Lựa chọn dung mơi có khả hịa tan hồn tồn mẫu thử tỷ lệ dung môi hỗn hợp phản ứng thấp - Bên cạnh việc tiến hành thử nghiệm với mẫu thử, cần song song tiến hành làm với mẫu trắng nhằm loại trừ sai số khách quan gặp phải Đối với thử nghiệm in vitro, bên cạnh việc xác định điều kiện thử nghiệm phù hợp, việc lựa chọn chất đối chứng dương yêu cầu bắt buộc để đánh giá hiệu quy trình phản ứng Với nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế AChE in vitro, chất thường sử dụng làm mẫu đối chứng dương donepezil galantamine [15] , eserin [27] berberin clorid [20, 38, 42] [29] , Trong số hợp chất này, có berberin clorid chưa sử dụng lâm sàng để điều trị bệnh Alzheimer Mặc dù vậy, berberin clorid lựa chọn làm chất đối chứng dương số nghiên cứu in vitro chất sở hữu hoạt tính ức chế AChE in vitro mạnh đồng thời sẵn có giá thành rẻ nhiều so với chất cịn lại Vì vậy, việc lựa chọn berberin clorid làm chất đối chứng dương nghiên cứu phù hợp với điều kiện thực tiễn Việt Nam Sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE 12 loại dược liệu nghiên cứu Luận văn sàng lọc 12 loại dược liệu từ tài liệu tham khảo, tìm Dừa cạn có tiềm ức chế enzym AChE để tiếp tục nghiên cứu sâu Khảo sát thành phần hóa thực vật Dừa cạn theo định hướng tác dụng ức chế enzym AChE Sau thu hái mẫu, tiến hành khảo sát hình thái, vi học soi bột để xác định dược liệu cần tìm Đồng thời so sánh với mô tả Dược điển Việt Nam IV để khẳng định Sau khảo sát sơ thành phần hóa thực vật nhận thấy Dừa cạn có tỷ lệ alkaloid cao theo tổng quan hầu hết chất có tác dụng ức chế enzym mạnh alkaloid nên định hướng chiết xuất phân lập dược liệu theo hướng phân lập alkaloid Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 55 Từ cao cồn 80% dược liệu tiến hành tách phân đoạn đơn giản kỹ thuật phù hợp thu cao phân đoạn tương ứng cao n-hexan, cao phân đoạn 1, cao phân đoạn , cắn không tan Dựa vào kết sắc ký mỏng khối lượng cao thực tế thu chọn cao phân đoạn cắn không tan để tiến hành chạy cột sắc ký Dựa vào kết thu khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn thu sau chạy sắc ký cột, chúng tơi nhận thấy phân đoạn có độ phân cực trung bình đến mạnh có tác dụng dược lý tốt phân đoạn phân cực Trong phân đoạn cột cắn không tan 3, phân đoạn E17 có kết ức chế enzym mức cao (78,79%), phân đoạn E14 E16 cho kết ức chế enzym mức tương đối (67,26 68,45%) Tuy nhiên hạn chế thời gian thực đề tài hàm lượng phân đoạn cao thấp nên chưa thể tiến hành phân lập chất tinh khiết Trong trình tách phân đoạn, phân lập kết tinh C.r.1, C.r.2 C.r.3 phân đoạn E3, E10 E11 cột cắn không tan Khi thử tinh khiết sắc ký mỏng kết tinh C.r.1 C.r.3 cho vết sắc ký, nhiên lại phát pic HPLC – PDA vùng bước sóng 200 – 600nm, chưa xác định C.r.1 C.r.3 có phải chất tinh khiết hay không Tuy nhiên, dựa vào kết sơ hóa thực vật C.r.3 phân lập từ phân đoạn EtOAc dự đốn kết tinh triterpen Kết khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE kết tinh cho thấy, kết tinh C.r.3 có tác dụng ức chế enzym AChE trung bình (58,42%) Vì hạn chế thời gian nên đề tài chưa thể tiến hành xác định độ tinh khiết cấu trúc phân tử kết tinh này, có điều kiện tiến hành phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry - LC – MS) phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai (Differential Scanning Calorimetry – DSC) để xác định độ tinh khiết kết tinh đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance – NMR) để tiến hành xác định cấu trúc Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Qua tháng làm đề tài, thu kết sau: Sàng lọc dược liệu có tác dụng kháng AChE Khảo sát phương pháp thử nghiệm Xác định vài thông số tối ưu quy trình thích hợp cho thử nghiệm sàng lọc: bước sóng đo độ hấp thu 415nm, dung mơi hịa tan mẫu DMSO 10%, thời gian ủ để phản ứng ổn định 15 phút Kết khảo sát 12 loại dược liệu Sàng lọc 12 mẫu cao toàn phần nồng độ 1mg/ml, xác định dược liệu Dừa cạn có kết ức chế 50% để tiếp tục khảo sát thành phần hóa học Khảo sát thành phần hóa học Dừa cạn Dựa vào kết khảo sát sơ hóa thực vật xác định quy trình chiết alkaloid cho dược liệu Dừa cạn Từ cao alkaloid toàn phần, phân tách thành phân đoạn có độ phân cực khác phương pháp phù hợp thu cao phân đoạn Tiến hành chạy cột sắc ký cao phân đoạn cao phân đoạn cắn không tan Kết quả, cột cao phân đoạn thu phân đoạn nhỏ cột cắn không tan thu 18 phân đoạn với kết tinh Tiếp tục khảo sát tác dụng kháng AChE với phân đoạn nhỏ kết tinh từ hai cột, ta thấy phân đoạn cột cắn khơng tan có tiềm tác dụng kháng AChE so với phân đoạn cột cao phân đoạn Trong bật có phân đoạn E17 có kết ức chế enzym mức cao (78,79%), phân đoạn E14 E16 cho kết mức tương đối (67,26 68,45%) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 57 Thu kết tinh từ phân đoạn E3, E10 E11 cột cắn không tan chưa xác định độ tinh khiết kết tinh Trong kết tinh kết tinh C.r.3 có tác dụng ức chế enzym AChE trung bình Kiến nghị Tiếp tục phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn E17, E14 E16 lượng mẫu lớn tiếp tục thử nghiệm sâu cho chất có tiềm (nếu có) dược liệu Xác định độ tinh khiết kết tinh C.r.3 xác định công thức phân tử kết tinh chất tinh khiết Có thể áp dụng phương pháp sàng lọc dược liệu có hoạt tính kháng AChE mà đề tài xác định để tiếp tục sàng lọc mẫu dược liệu khác nhằm tìm dược liệu có tiềm cao hơn./ Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Trương Thị Thùy An (2008), Nghiên cứu sàng lọc số dược liệu có tác động ức chế acetylcholinesterase, Đại học Khoa học tự nhiên TPHCM Nguyễn Trần Giáng Hương Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông (2011), Dược lý học Vol NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội Hoàng Việt Dũng (2014), Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase hai loài Piper thomsonii (C DC.) Hook f var Thomsonii Piper hymenophyllum Miq., họ hồ tiêu (Piperaceae), Đại học Dược Hà Nội Đỗ Quyên Đỗ Thị Hà (2015), Phân lập xác định cấu trúc hợp chất alcaloid ức chế acetyl cholinesterase loài Stephania dielsiana Y C Wu phương pháp sắc ký lớp mỏng sử dụng chất màu hoạt tính sinh học, Đại học Dược Hà Nội Bộ môn dược liệu (2016), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh Đặng Hồng Qun (2014), "Khảo sát khả cải thiện suy giảm trí nhớ cao chiết từ sinh khối Cordyceps spp chuột nhắt", Tạp chí sinh học vol 36, pp 203-208 Đỗ Quyên (2011), "Nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase ", Nghiên cứu dược Thông tin thuốc, (4), pp 137-139 Nguyễn Minh Trang (2014), Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ chuột bị thiếu máu não cục khả ức chế acetylcholinesterase rau đắng biển (Bacopa Monnieri (Linn) Wettst), Đại học Dược Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Anne Adsersen, Bente Gauguin, et al (2006), "Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for acetylcholinesterase inhibitory activity", Journal of Ethnopharmacology, vol 104(3), pp 418-422 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 10 Daniel S Auld, Tom J Kornecook, et al (2002), "Alzheimer’s disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies", Progress in neurobiology, vol 68(3), pp 209-245 11 DL Bai, XC Tang, et al (2000), "Huperzine A, a potential therapeutic agent for treatment of Alzheimer's disease", Current medicinal chemistry, vol 7(3), pp 355-374 12 George Bartzokis (2011), "Alzheimer's disease as homeostatic responses to age-related myelin breakdown", Neurobiology of aging, vol 32(8), pp 13411371 13 Jacqueline S Birks (2006), "Cholinesterase inhibitors for Alzheimer's disease", The Cochrane Library 14 Mary Bond, G Rogers, et al (2012), "The effectiveness and cost-effectiveness of donepezil, galantamine, rivastigmine and memantine for the treatment of Alzheimer's disease (review of Technology Appraisal No 111): a systematic review and economic model" 15 Elaine Monteiro Cardoso-Lopes, James Andreas Maier, et al (2010), "Alkaloids from stems of Esenbeckia leiocarpa Engl.(Rutaceae) as potential treatment for Alzheimer disease", Molecules, vol 15(12), pp 9205-9213 16 Jung Keun Cho, Young Bae Ryu, et al (2012), "Cholinestrase inhibitory effects of geranylated flavonoids from Paulownia tomentosa fruits", Bioorganic & medicinal chemistry, vol 20(8), pp 2595-2602 17 Wanjoo Chun GV Johnson (2006), "The role of tau phosphorylation and cleavage in neuronal cell death", Frontiers in bioscience: a journal and virtual library, vol 12, pp 733-756 18 Mirjana B Colovic, Danijela Z Krstic, et al (2013), "Acetylcholinesterase inhibitors: pharmacology and toxicology", Current neuropharmacology, vol 11(3), pp 315-335 19 Sivaraman Dhanasekaran, Panneerselvam Perumal, et al (2015), "In-vitro Screening for acetylcholinesterase enzyme inhibition potential and antioxidant Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM activity of extracts of Ipomoea aquatica Forsk: therapeutic lead for Alzheimer’s disease" 20 Saviana Di Giovanni, Aline Borloz, et al (2008), "In vitro screening assays to identify natural or synthetic acetylcholinesterase inhibitors: thin layer chromatography versus microplate methods", european journal of pharmaceutical sciences, vol 33(2), pp 109-119 21 Hay Dvir, Israel Silman, et al (2010), "Acetylcholinesterase: from 3D structure to function", Chemico-biological interactions, vol 187(1), pp 10-22 22 IMS Eldeen, FR Van Heerden, et al (2010), "In vitro biological activities of niloticane, a new bioactive cassane diterpene from the bark of Acacia nilotica subsp kraussiana", Journal of ethnopharmacology, vol 128(3), pp 555-560 23 George L Ellman, K Diane Courtney, et al (1961), "A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity", Biochemical pharmacology, vol 7(2), pp 88IN191-9095 24 A Ferreira, C Proenỗa, et al (2006), "The in vitro screening for acetylcholinesterase inhibition and antioxidant activity of medicinal plants from Portugal", Journal of ethnopharmacology, vol 108(1), pp 31-37 25 Paul T Francis, Alan M Palmer, et al (1999), "The cholinergic hypothesis of Alzheimer’s disease: a review of progress", Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, vol 66(2), pp 137-147 26 Hui Ming Ge, Chun Hua Zhu, et al (2008), "Hopeahainol A: an acetylcholinesterase inhibitor from Hopea hainanensis", Chemistry-a European Journal, vol 14(1), pp 376-381 27 A Gholamhoseinian, MN Moradi, et al (2009), "Screening the methanol extracts of some Iranian plants for acetylcholinesterase inhibitory activity", Research in pharmaceutical sciences, vol 4(2), pp 105 28 M Goedert, MG Spillantini, et al (1991), "Tau proteins and neurofibrillary degeneration", Brain pathology, vol 1(4), pp 279-286 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 29 Homa Hajimehdipoor, Tina Tehranifar, et al (2013), "Acetylcholinesterase inhibitory effect of some medicinal herbs used in Iranian traditional medicine for memory improvement", Global J Botanical Sci, vol 1(1), pp 18-21 30 John Hardy David Allsop (1991), "Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease", Trends in pharmacological sciences, vol 12, pp 383-388 31 David B Hogan (2009), "Practical approach to the use of cholinesterase inhibitors in patients with early Alzheimer’s disease", Geriatr Aging, vol 12(4), pp 202-207 32 Peter J Houghton, Yuhao Ren, et al (2006), "Acetylcholinesterase inhibitors from plants and fungi", Natural Product Reports, vol 23(2), pp 181-199 33 Karen Hsiao, Paul Chapman, et al (1996), "Correlative memory deficits, Aβ elevation, and amyloid plaques in transgenic mice", Science, vol 274(5284), pp 99-103 34 Khalid Iqbal, Alejandra del C Alonso, et al (2005), "Tau pathology in Alzheimer disease and other tauopathies", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease, vol 1739(2), pp 198-210 35 Zhong Jin (2009), "Amaryllidaceae and Sceletium alkaloids", Natural product reports, vol 26(3), pp 363-381 36 Hyun Ah Jung, Byung-Sun Min, et al (2009), "Anti-Alzheimer and antioxidant activities of Coptidis Rhizoma alkaloids", Biological and Pharmaceutical Bulletin, vol 32(8), pp 1433-1438 37 Dorothea Kaufmann, Anudeep Kaur Dogra, et al (2016), "Extracts from Traditional Chinese Medicinal plants inhibit acetylcholinesterase, a known Alzheimer’s disease target", Molecules, vol 21(9), pp 1161 38 Roosanee Langjae, Somchai Bussarawit, et al (2007), "Acetylcholinesteraseinhibiting steroidal alkaloid from the sponge Corticium sp", Steroids, vol 72(9), pp 682-685 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 39 Ira T Lott Elizabeth Head (2005), "Alzheimer disease and Down syndrome: factors in pathogenesis", Neurobiology of aging, vol 26(3), pp 383-389 40 Andrew Marston, J Kissling, et al (2002), "A rapid TLC bioautographic method for the detection of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitors in plants", Phytochemical Analysis, vol 13(1), pp 51-54 41 Maya Mathew Sarada Subramanian (2014), "In vitro screening for anticholinesterase and antioxidant activity of methanolic extracts of ayurvedic medicinal plants used for cognitive disorders", PLoS One, vol 9(1), pp e86804 42 Byung Sun Min, To Dao Cuong, et al (2010), "Cholinesterase inhibitors from Cleistocalyx operculatus buds", Archives of pharmacal research, vol 33(10), pp 1665-1670 43 Abbas Mollataghi, Emilie Coudiere, et al (2012), "Anti-acetylcholinesterase, anti-α-glucosidase, anti-leishmanial and anti-fungal activities of chemical constituents of Beilschmiedia species", Fitoterapia, vol 83(2), pp 298-302 44 Amritpal Mudher Simon Lovestone (2002), "Alzheimer's disease–do tauists and baptists finally shake hands?", Trends in neurosciences, vol 25(1), pp 22-26 45 Elliott J Mufson, Scott E Counts, et al (2008), "Cholinergic system during the progression of Alzheimer’s disease: therapeutic implications", Expert review of neurotherapeutics, vol 8(11), pp 1703-1718 46 Pulok K Mukherjee, Venkatesan Kumar, et al (2007), "Acetylcholinesterase inhibitors from plants", Phytomedicine, vol 14(4), pp 289-300 47 Ana P Murray, María Belén Faraoni, et al (2013), "Natural AChE inhibitors from plants and their contribution to Alzheimer’s disease therapy", Current Neuropharmacology, vol 11(4), pp 388-413 48 Gargi Nag BRATATI De (2011), "Acetylcholinesterase inhibitory activity of Terminalia chebula, Terminalia bellerica and Emblica officinalis and some phenolic compounds", Int J Pharm Pharm Sci, vol 3(3), pp 121-4 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 49 Gurdal Orhan, Ilkay Orhan, et al (2009), "Contemporary anticholinesterase pharmaceuticals of natural origin and their synthetic analogues for the treatment of Alzheimer's disease", Recent Patents on CNS Drug Discovery, vol 4(1), pp 43-51 50 Tuomo Polvikoski, Raimo Sulkava, et al (1995), "Apolipoprotein E, dementia, and cortical deposition of β-amyloid protein", New England Journal of Medicine, vol 333(19), pp 1242-1248 51 In Kyung Rhee, Michiel van de Meent, et al (2001), "Screening for acetylcholinesterase inhibitors from Amaryllidaceae using silica gel thin-layer chromatography in combination with bioactivity staining", Journal of chromatography A, vol 915(1), pp 217-223 52 Christoph Schmitz, Bart PF Rutten, et al (2004), "Hippocampal neuron loss exceeds amyloid plaque load in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease", The American journal of pathology, vol 164(4), pp 1495-1502 53 ZX Shen (2004), "Brain cholinesterases: II The molecular and cellular basis of Alzheimer's disease", Medical hypotheses, vol 63(2), pp 308-321 54 Bo Su, Xinglong Wang, et al (2008), "Oxidative stress signaling in Alzheimer’s disease", Current Alzheimer Research, vol 5(6), pp 525 55 Zhong‐mei Tang, Zhao‐yan Wang, et al (2007), "Screening of acetylcholinesterase inhibitors in natural extracts by CE with electrophoretically mediated microanalysis technique", Electrophoresis, vol 28(3), pp 360-365 56 P Tiraboschi, LA Hansen, et al (2004), "The importance of neuritic plaques and tangles to the development and evolution of AD", Neurology, vol 62(11), pp 1984-1989 57 K Van Asperen (1962), "A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method", Journal of insect physiology, vol 8(4), pp 401-416 58 G Waldemar, B Dubois, et al (2007), "Recommendations for the diagnosis and management of Alzheimer's disease and other disorders associated with Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM dementia: EFNS guideline", European Journal of Neurology, vol 14(1), pp e1-e26 59 Philip Williams, Analia Sorribas, et al (2011), "Natural products as a source of Alzheimer's drug leads", Natural product reports, vol 28(1), pp 48-77 60 Zhong-duo Yang, Dong-bo Zhang, et al (2012), "Skimmianine, a furoquinoline alkaloid from Zanthoxylum nitidum as a potential acetylcholinesterase inhibitor", Medicinal chemistry research, vol 21(6), pp 722-725 61 Junying Zhang, Peng Li, et al (2013), "Ameliorative effects of a combination of baicalin, jasminoidin and cholic acid on ibotenic acid-induced dementia model in rats", PloS one, vol 8(2), pp e56658 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ THỊ QUỲNH QUYÊN NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc Độc chất Mã số: 62 72... truyền Việt Nam Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu khảo sát hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase số dược liệu? ?? với mong muốn tìm hoạt chất tiềm góp phần ngăn chặn tiến... có hoạt tính kháng enzym AChE tiềm dược liệu - Khảo sát thực vật học dược liệu chọn + Khảo sát đặc điểm hình thái: mơ tả đặc điểm thực vật học dựa quan sát tươi + Khảo sát cấu tạo vi học dược liệu