THÍ NGHIỆM HÓA SINH

THÍ NGHIỆM HÓA SINHBÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINHXÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTHXÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASEKHẢO SÁT HOẠT ĐỘ INVERTASEKHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME UREASE

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ HĨA VÀ THỰC PHẨM BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn : T.s Trịnh Khánh Sơn BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH - Mục đích thí nghiệm Biết thao tác làm thí nghiệm, Trình bày ngun tắc, trình tự tiến hành, tính tốn kết đánh giá sai số yếu tố ảnh hưởng đến kết thí nghiệm Nguyên tắc Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp thủy phân tinh bột đến dextrin Đơn vị Wohlgemuth lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn mg tinh bột đến dextrin sau 30 phút 37oC có Cl- làm chất hoạt hóa Dụng cụ hóa chất • Dụng cụ: - 11 ống nghiệm, - Pipet ml (4 cái), - Bể điều nhiệt • Hóa chất cách pha hóa chất: - NaCl 0.5% - Tinh bột 0.5% - H2SO4 10% - Iodine 0.3% KI 3% Quy trình thực B1: Chuẩn bị dịch chiết amylase: Mẫu enzyme pha loãng 200 lần B2: Tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme amylase Lưu ý: Khi cho hồ tinh bột vào ống nghiệm, phải thực đồng đều, liên tục theo số giây, để thời gian phản ứng xảy ống nghiệm nhau, để có kết xác Lấy ống nghiệm lại (số11) cho vào ml nước cất, giọt thuốc thử Iodine KI, so sánh màu 10 ống nghiệm để xác định ống có nồng độ enzyme thấp thủy phân hồn tồn tinh bột thành dextrin BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH Tính kết nhận xét a) Mẫu 300C Lần Lần BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH Ống so màu  Kết thể bảng có đánh dấu:Vàng (v ), Xanh (x ), Đỏ (đ )  Bảng kết 1: Ống nghiệm 10 Độ pha loãng 16 32 64 128 256 512 1024 n/2 n/4 n/8 n/16 n/32 n/64 n/128 n/256 n/512 n/1024 Màu lần v v v v v v đ x x x Màu lần v v v v v đ đ x x x Nồng độ enzyme  So sánh màu chọn ống có nồng độ enzyme thấp thủy phân hoàn toàn tinh bột thành dextrin - Lần chọn ống số F1=64 - Lần chọn ống số F2=32  Tính tốn kết quả: - Lượng enzyme cho vào ống nghiệm n= m x = = 0,01 ( mg) - Một đơn vị Gohlgemuth (W) ứng với 300C Trong : F- Độ pha lỗng ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ thủy phân hồn tồn tinh bột ( ống nghiệm có màu trùng với màu ống nghiệm 11) Dựa vào kết thí nghiệm ta chọn F = 64 F = 32 W1 = = = 3,125 x 10-5 W2 = = = 6.25 x 10-5 - Số đơn vị Wohlgemuth có ml dịch chiết enzyme N1w = = = 320 N2w = = = 160 Chạy excel Nw = 240 113,1371 tính ml dịch trích enzyme Vậy số đơn vị Wohlgemuth có dịch chiết enzyme pha loãng 200 lần Nw = 48000 22627.42 b) Mẫu 37 C BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH Lần Lần Ống so màu  Bảng kết 2: Ống nghiệm 10 Độ pha loãng 16 32 64 128 256 512 1024 Nồngđộ enzyme n/2 n/4 n/8 n/16 n/32 n/64 n/128 n/256 n/512 n/1024 Màu lần v v V v đ đ X x x x Màu lần v v V v đ x X x x x  So sánh màu chọn ống có nồng độ enzyme thấp thủy phân hoàn toàn tinh bột thành dextrin - Lần 1chọn ống số F1=16 - Lần 2chọn ống số F2=16  Tính tốn kết quả: - Lượng enzyme cho vào ống nghiệm : n= m x = = 0,01 ( mg) - Một đơn vị Gohlgemuth (W) ứng với 300C : W1 = = = 1.25 x 10-4 W2 = = = 1.25 x 10-4 Số đơn vị Wohlgemuth có ml dịch chiết enzyme : N1w = = = 80 N2w = = = 80 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH Chạy excel Nw= 80 tính 1ml dịch trích enzyme Vậy số đơn vị Wohlgemuth có dịch chiết enzyme pha lỗng 200 lần : Nw = 16000 KẾT QUẢ Ở 300C Nw = 48000 22627.42 Ở 370C Nw= 16000  Nguyên nhân gây sai số : +Pipet, ống nghiệm, dụng cụ thí nghiệm bị nhiễm +Cho lượng iodine KI không vào ống nghiệm +Sai số nhiệt độ bể điều nhiệt +Thao tác thí nghiệm chưa chuẩn xác + Enzyme nhạy với nhiệt độ, bị giảm hay hoạt tính khơng bảo quản cản thận q trình thí nghiệm + Thời gian thực hành khơng xác, kết thúc phản ứng không lúc Hướng khắc phục: - Rèn luyện thêm kỹ thực thao tác thí nghiệm, phải tuyệt đối - xác Thức nhiều lần thực hành để đưa thơng số xác + Tốc độ phản ứng enzyme tăng nhiệt độ tăng Và tốc độ phản ứng tăng giới hạn nhiệt độ định Vượt nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme giảm làm enzyme vô hoạt Bàn luận Cần phải nhận biết xác màu phức iodine hồ tinh bột để biết xác độ pha lỗng ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ thủy phân hồn tồn tinh bột (ống nghiệm có màu trùng với màu ống nghiệm 11) BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH Nồng độ enzyme lớn lượng tinh bột bị thuỷ phân nhiều Nhưng vượt nồng độ tới hạn vận tốc phản ứng chậm lại Quá trình thủy phân tinh bột đến dextrin, thêm NaCl vào nhằm giúp tăng hoạt độ enzym giúp q trình thủy phân đạt hiệu cao Ngồi q trình thủy phân 30 phút, có thêm H 2SO4 10% vào để ức chế hoạt động enzym để trình thủy phân dừng lại Nồng độ enzyme giảm dần từ ống đến ống 10 đó, phản ứng thủy phân tinh bột giảm dần Tinh bột khơng bị thủy phân hồn tồn, phần cịn sót lại phản ứng với iodine tạo dung dịch có màu xanh iodine, màu đậm nồng độ enzyme thấp, hoạt độ enzyme yếu Màu xanh thể rõ ống nghiệm 10 – mà nồng độ enzyme thấp, khơng cịn enzyme để thủy phân tinh bột Dựa vào màu sắc ống nghiệm sau trình thủy phân tinh bột đến dextrin với xúc tác enzym amylase ta thấy: Ở nhiệt độ 37oC, ống nghiệm số 1,2,3,4 gần màu hoàn tồn cịn lại màu Iodine =>q trình thủy phân gần hồn tồn Ở nhiệt độ phịng, ống nghiệm số 1,2,3,4,5,6 gần màu hoàn toàn cịn lại màu Iodine => q trình thủy phân gần hoàn toàn Vậy yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân nhiệt độ BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH BÀI THÍ NGHIỆM SỐ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASE Nguyên tắc Dưới tác dụng lipase, lipid bị thủy phân giải phóng acid béo Hàm lượng acid chuẩn độ kiềm Hoạt độ enzyme lượng kiềm cần để trung hịa acid hình thành Cơ chất tốt lipase lipid đối tượng enzyme Dụng cụ - hóa chất  Dụng cụ: Cối chày sứ, Erlen 10ml, Pipet 1ml, 10ml, Ống đong, Burret, Cốc 100ml, 250ml, Tủ ấm  Hóa chất cách pha hóa chất: - Đệm acetat pH=4.7 (trộn CH3COOH 1N CH3COONa 1N theo tỉ lệ 1:1) - Cồn 96o - Toluen - Ether ethylic - NaOH 0.1N - Phenolphthalein 1%: 1.0g phenolphthalein pha với 50ml ethanol 50ml nước cất - Dầu đậu nành tinh khiết Cách tiến hành BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH Lặp lại thí nghiệm lần - Làm bình kiểm chứng tương tự dịch chiết enzyme phải đun cách thủy 10 phút để làm hoạt tính nước trước cho vào chất Phương trình phản ứng cơng thức H+ + NaOH => Na+ + H2O (1) b ml RCOOH + NaOH => RCOONa + H 2O (2) (a-b) ml Gọi a số ml NaOH để chuẩn độ bình thí nghiệm b số ml NaOH để chuẩn độ bình kiểm chứng  a -b số ml NaOH để chuẩn độ lượng acid tự sinh lipase trích ly  Vậy cơng thức tính hoạt độ lipase (X): X = (a-b)x10xk/m BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH Với k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N m: khối lượng hạt sử dụng Kết tính tốn b = 1.1 ml - Lần thí nghiệm a (ml) 5.5 6.3 X(1) = (5.5-1.1)x10x1/5 = 8.8 X(2) = (6-1.1)x10x1/5 = 9.8 X(3) = (6.3-1.1)x10x1/5 = 10.4  X = (8.8+9.8+10.4)/3 = 9.67 Nhận xét giải thích Số ml NaOH để chuẩn độ bình thí nghiệm lặp lại lần gần Số ml NaOH để chuẩn độ bình thí nghiệm cao số ml NaOH để chuẩn độ bình kiểm chứng bình kiểm chứng dịch chiết enzyme phải đun cách thủy làm hoạt tính nước trước cho chất, cịn bình thí nghiệm sau nghiền cho chất vào Thêm toluene vào có tác dụng làm diệt khuẩn  Lưu ý - Khi pha đệm acetate phải xác, tỉ lệ, pH= 4.7 pha thấp trở thành sút, cao thành acid - NaOH 0.1N phải pha xác nồng độ, sau dùng H2SO4.1N để xác định hệ số k Phải sử dụng ống chuẩn đậy lại để không bị hút ẩm - Khi thêm dầu đậu nành, đệm acetate, toluene vào bình erlen chứa đậu nành nghiền nhỏ xong lấy giấy nilon bịt lại để tránh bị hư Bàn luận mở rộng - Các yếu tố ảnh hưởng sai số: o Pha hóa chất khơng xác nồng độ, khơng tỷ lệ o Khi chuẩn độ, màu dịch enzyme đục nên khó quan sát lúc chuyển - màu, khơng nhìn thấy rõ nên dẫn đến hao hụt số ml NaOH chuẩn độ o Hút khơng xác thể tích Cách khắc phục sai số: o Cẩn thận thao tác, cách thực o Có thể lặp lại thao tác chuẩn độ nhiều lần để lấy kết xác o Có thể sử dụng phương pháp ly tâm tách bã để giảm thiểu sai số 10 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH BÀI BÁO CÁO SỐ 3: KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ INVERTASE Nguyên tắc Invertase enzyme thủy phân saccharose thành glucose fructose Dựa vào tính chất iodine dung dịch kiềm có khả oxi hóa glucose để xác định glucose sinh cách định phân iodine dư với dung dịch Na2S2O3 Dụng cụ- hóa chất  Dụng cụ: cốc thủy tinh 100- 250ml, bình tam giác 250ml, pipette 2ml- 10ml, buret 25ml, phễu thủy tinh  Saccharose 10%, NaOH 0.1N, iodine 0.1N, H2SO4 1N, hồ tinh bột 1%, dung dịch Na2S2O3 0.05N Cách tiến hành - Điều chế dung dịch invertase: cân 1g men bánh mì, hịa tan vào 50ml nước cất, cho vào bình định mức 100ml, lắc phút Để lắng, lọc lấy dịch lọc - Thực ống nghiệm sau: Số ống Dung dịch saccharose 10% (ml) Nước cất Dịch enzyme(ml) Dịch enzyme bị đun cách thủy (ml) Dãy ống nghiệm  nhiệt độ phòng để 30 phút 10 10 Đun cách thủy 10phút 10 10 Hút 5ml hỗn hợp dịch cho vào erlen 250ml 10 0 10 Xác định glucose - Saccharose bị enzyme đăc hiệu thủy phân thành glucose - Đun cách thủy để vô hoạt enzyme dừng phản ứng thủy phân để xác định - Đúng hoạt độ enzyme invertase Qui trình xác định glucose phản ứng hóa học diễn ra:  Cho vào erlen 10ml iodine 0.1N 15ml NaOH 0.1N Lúc ta có phản ứng xảy dd sau: (1) I2 + 2NaOH NaIO + NaI + H2O (2) C5H11O5CHO + NaIO + NaOH => C5H11O5COONa + NaI + H2O Cân (1) (2) ta được: 12 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH (3) I2 + 3NaOH+ RCHO => RCOONa + 2NaI + 2H2O Và sodium hypoiodite nhanh chóng dễ dàng phản ứng tạo sodium iodate : (4) 3NaIO => NaIO3 + NaI Kết hợp (1) với (4) ta được: (5) 3I2 + NaOH => NaIO3 + NaI+ H2O - Khi NaIO dư tức I2 dư phản ứng (5) diễn - Phản ứng số (3) có tham gia glucose nên cần nhỏ NaOH từ từ để lượng glucose phản ứng hết, NaOH dư phản ứng (4) có hội xảy làm lượng glucose cần chuẩn độ khơng có NaIO NaOH để phản ứng Cùng với đó, phản ứng số (4) xảy trước gây sai số phản ứng (7) xảy tạo I2  Sau để yên bình bóng tối 20 phút cho thêm 2ml H2SO4 1N thì: (6) NaIO + NaI + H2SO4=>I2 + Na2SO4 + H2O (7) NaIO3 + Nal + 3H2SO4 => 3I2 + 3Na2SO4 + 3H2O - Lượng NaIO dư NaIO3 phản ứng (5) tạo tác dụng với acid tạo lại I2  Định phân lượng iodine vừa tạo tương đương với lượng iodine thừa Na2S2O3 0.05N với thị hồ tinh bột 1% (8) I2 + 2Na2S2O3 => NaI + Na2S4O3 - Khi bỏ thị hồ tinh bột vào erlen có iodine nên tạo phức màu, chuẩn độ phản ứng (8) xảy ra, I2 chuẩn độ hết hỗn hợp màu phức ta dừng chuẩn độ Nghi số liệu tính kết 13 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH  Mẫu trước định phân:  Mẫu sau định phân: - Công thức: (V1-V2)*A*B/(1000*20*2*a*b*t*m) Trong đó: - V1: số ml cần để định phân dung dịch ống nghiệm - V2: số ml cần để định phân dung dịch ống nghiệm - A: thể tích tổng cộng ống nghiệm 14 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH - B: tổng thể tích trích ly enzyme có từ m (g) - a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose - b: thể tích trích ly enzyme vào ống nghiệm - t: thời gian thủy phân Tính kết Ống nghiệm VNa2S2O3 0.05N chuẩn lần (ml) VNa2S2O3 0.05N chuẩn lần (ml) 18.8 19 9.1 13.5 13.5 VNa2S2O3 0.05N chuẩn lần 3(ml) 19 9.05 13.5 VNa2S2O3 0.05N trung bình (ml) 18.9 9.05 13.5  Bảng số liệu Hoạt độ invertase: (18.9- 9.05)*20*100/(1000*20*2*5*10*1)=9.85x10-3 (mol/g.phút) - Đối với ống nghiệm số ta áp dụng cơng thức enzyme invertase bị bất hoạt glucose điều kiện làm thí nghiệm: a=(13.5- 9.05)*20*100/(1000*20*2*5*10*1)=4.45x10-3 (mol/g.phút)  Và a xem sai số thí nghiệm Nhận xét nguyên nhân sai số Do máy móc dụng cụ đo thiếu xác, thiếu tinh vi • Do người đo với trình độ tay nghề chưa cao, khả giác quan bị hạn • chế • Do điều kiện ngoại cảnh bên tác động tới, thời tiết thay đổi, mưa • • • • gió, nóng lạnh bất thường Lấy mẫu khơng xác Thời gian để enzyme phân hủy ống thí nghiệm khơng giống Pha hóa chất khơng nồng độ ảnh hưởng đến kết  Cách khắc phục: Thao tác tiến hành thí nhiệm phải xác, nhỏ giọt chất chuẩn để xác định điểm dừng thí nghiệm • Thực thí nghiệm nhiều lần để xác định kết xác • Phải canh thời gian thủy phân ống nghiệm  Ưu điểm: thí nghiệm đơn giản, sai số, điểm nhận biết rõ ràng giọt dư Na2S2O3 làm dung dịch chuyển từ màu nâu sang trắng 15 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH  Nhược điểm: thao tác phương pháp cách chuẩn độ ảnh hưởng lớn đến kết quả, phải canh thời gian thủy phân ống nghiệm Bàn luận Nhiệt độ tốc độ pha lỗng có ảnh hưởng lớn đến trình thủy phân saccharose thiết bị phản ứng liên tục Khi tăng nhiệt độ từ 35 lên 55 oC, hoạt tính enzyme thủy phân tăng; nhiên, hoạt tính enzyme giảm nhanh thủy phân Cịn tăng tốc độ pha lỗng suất hoạt động phản ứng tăng, nhiên hiệu suất thủy phân giảm 16 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 4: KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME UREASE Nguyên tắc Urease enzyme thủy phân đặc hiệu urea theo phản ứng: NH2 -CO-NH2 + H2O → NH3 + CO2 Khi thêm formaldehyde vào môi trường tạo thành hexamethylene tetramine giải phóng acid carbonic 2(NH4)2CO3 + 6HCHO → (CH2)6N4 + 2H2CO3 + 6H2O Cách pha hóa chất - Formol trung tính: cho 10ml dung dịch 10% formol vào erlen, bổ sung 2ml 0.5% phenolphtalein Nhỏ giọt NaOH 0.2N vào erlen xuất màu hồng nhạt phenolphtalein Ghi nhận lượng NaOH 0.2N sử dụng ( Vml ) Căn tỉ lệ dung dịch formol 10% NaOH 0.2N sử dụng, tiến hành điều chế 100ml formol 10% trung hòa ( không sử dụng phenolphtalein) - Phenolphtalein 1%: 0.1g phenolphtalein pha với 50ml ethanol 50ml nước cất Tiến hành 3.1 - Điếu chế dung dịch urease Xay nhiễu đậu nành nguyên hạt thành bột để phá vỡ tế bào giải phóng enzyme - Lọc thu dịch lọc để trách ngăn cản enzyme với chất, lấy dịch enzyme với thể tích xác để trình chuẩn độ thuận lợi 17 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH 3.2 Khảo sát động học Chuẩn bị dãy ống nghiệm, dãy ống Ở dãy cho dung dịch vào theo bảng sau: Ống nghiệm Ure 1/3M (ml) Nước cất (ml) Dd urease (ml) - 5 3 5 5 5 Cho nước vào ống nghiệm với thể tích tăng dần nhầm mục đích pha lỗng enzyme theo nồng độ để khảo sát số liệu vẽ đồ thị - Khi thêm formaldehyde vào môi trường tạo thành hexamethylene tetramine giải phóng acid carbonic sau chuẩn độ lượng acid sinh NaOH 3.3 Xác định hoạt độ Ống nghiệm Ure 2% (ml) Nước cất (ml) DD Urease (ml) DD Urease đun cách thủy (ml) Thực dãy ống nghiệm sau: - 5 5 0 Khi thêm formaldehyde vào môi trường tạo thành hexamethylene tetramine giải phóng acid carbonic sau chuẩn độ lượng acid sinh NaOH - Ống mẫu thử khơng có chất - Ống mẫu vữa có chất vừa có dịch enzyme 18 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH - Ống mẫu có chất dịch enzyme đun cách thủy để vô hoạt enzyme Để xác định lượng urea bị thủy phân khơng có hoạt động enzyme Tính kết quả: 4.1 Khảo sát động học  Kết thí nghiệm 30°C Ống nghiệm NaOH dùng để chuẩn độ 0.5 0.9 1 1.1 1.1 lần thứ (ml) NaOH dùng để chuẩn độ 0.5 0.9 1.2 1.3 1.3 1.4 lần thứ hai (ml) NaOH trung bình dùng để 0.5 0.9 1.1 1.15 1.2 1.25 2,75x10-5 2,875.10-5 3.10-5 3,125.10-5 chuẩn độ (ml) Y= số mol ure bị thủy phân( 2,25.10-5 mol) [S]=số mol ure ban đầu Vận tốc phản ứng thủy phân v= 10-3 1,125.10-6 10-3 10-3 1,375.10-6 1,438 10-6 101,5 10-6 10-3 1,563 10-6 d (S) Y = dt 20  Kết thí nghiệm 40°C Ống nghiệm NaOH dùng để chuẩn độ lần 0.5 1,4 1,5 2,2 2,6 thứ (ml) NaOH dùng để chuẩn độ lần 0.5 1,3 1,5 2,1 2,2 2,6 thứ hai (ml) NaOH trung bình dùng để 0.5 1,35 1,5 2,05 2,2 2,6 chuẩn độ (ml) Y= số mol ure bị thủy 3,75.10-5 5,125.10-5 5,5.10-5 3,35.10-5 6,5.10-5 phân( mol) 19 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH [S]=số mol ure ban đầu Vận tốc phản ứng thủy phân v= 10 -3 10 -3 1.10-3 10-3 1,675.10-6 2,038.10-6 2,563.10-6 2,75.10-6 10-3 3,25.10-6 d (S) Y = dt 20 Đồ thị biểu diễn phương trình động học Michaelis-Menten 30°C Đồ thị biểu diễn phương trình động học Michaelis-Menten 40°C 20 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH  Tính tốn kết 40°C: Ta có phương trình y= (113,56.x + 274,26).103 Có đồ thị cắt trục 1/V 1/Vmax trục 1/S -1/Km Từ suy -1/Km = -2,41 suy Km = 0,415 1/Vmax= 274,26.103 Vậy vận tốc thủy phân enzyme 40°C : = 274,26.103 + 0,451 274,26.103.3=645333.78 V Suy V= 1,55.10-6  Tính tốn kết 30°C: Ta có phương trình y= (100,36x + 586,13).103 Có đồ thị cắt trục 1/V 1/Vmax trục 1/S -1/Km Từ suy -1/Km =-5,84 suy Km= 0,171 1/Vmax= 586,13.103 Vậy vận tốc thủy phân enzyme 40°C : =586,13.103 + 0,171 586,13.103.3=886814,69 V Suy V= 1,13.10-6 Vậy nhiệt độ 30oC vận tốc thủy phân enzyme bé nhiệt độ 40o 21 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH  Giải thích cơng thức cách lập đồ thị biểu diễn phương trình động học - Michealis- Menten: Trên hệ trục tọa độ vẽ đường cong biễu diễn đường chất bị thủy phân theo nồng độ chất ban đầu nhiệt độ ( Y1 Y2 theo [S]) - Vẽ đường thẳng biễu diễn biến thiên 1/v theo 1/[S] nhiệt độ thủy phân Trong đó: v= d(S)/dt = Y/20 (v vận tốc phản ứng thủy phân) Đây đồ thị biễu diễn phương trình động học Michaelis-Menten:  Với: + Vmax: vận tốc thủy phân cực đại + [S]: nồng độ chất + Km: số Michaelis-Menten Các đường thẳng cắt trục hoành trục tung giá trị nghịch đảo Km Vmax Hãy tính trị số chế độ nhiệt  Chứng minh phương trình Khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chất Gọi: v1 vận tốc phản ứng tạo thành phức chất ES v-1 vận tốc phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E S v2 vận tốc phản ứng tạo thành E P (sản phẩm) v1 = k1 [E] [S] v-1 = k-1[ES] v2 = k2 [ES] Khi hệ thống đạt trạng thái cân ta có: k-1[ES]+k2[ES] = k1[E][S] (k-1+k2)[ES] = k+1[E][S] (2) Gọi: E0 nồng độ ban đầu: [E0]=[E]+[ES]=>[E]=[E0]-[ES] (3) Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có: (k-1+k2)[ES] = k1([E0]-[ES]) [S] 22 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH [ES] = Nếu đặt Km= k-1+k2/ k1(Km: gọi số Michalis Menten) Ta có: [ES] = [E0][S]/ Km+[S] Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là: V = k2 [ES] Thay [ES] giá trị ta thu được: v = (4) Qua ta thấy nồng độ enzyme cao vận tốc phản ứng enzyme lớn Vận tốc đạt cực đại toàn enzyme liên kết với chất Vmax= k 2[E0] Thay vào phương trình (4) ta được: v = Vmax (5) Phương trình (5) gọi phương trình Michelis Menten Km đặc trưng cho lực enzyme với chất, Km có trị số nhỏ lực enzyme với chất lớn, nghĩa vận tốc phản ứng enzyme xúc tác lớn Sự biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất Khi tăng [S] v phản ứng tăng, tăng [S] đến giá trị v đạt đến giá trị Vmax không tăng ta tiếp tục tăng [S] Khi Km = [S] v0 =1/2 Vmax Năm 1934 Lineweaver Burk, sở phương trình (5) nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b 23 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ chất theo Lineweaver – Burk 4.2 Xác định hoạt độ  Bảng số liệu: Ống nghiệm VNaOH 0.05N chuẩn lần VNaOH 0.05N chuẩn lần 0.10 0.10 1.10 1.00 0.20 0.20 VNaOH 0.05N chuẩn lần 0.15 1.00 0.20 VNaOH 0.05N trung bình 0.117 1.033 0.200  Tính kết quả: Hoạt độ urease biểu diễn số mol ure bị thủy phân lượng enzyme urease có 1g bột đậu nành thời gian phút 40oC (V2 - V1)xAxk/(20x103x2xtxaxm) = ( 1.033-0.1167)x250x1/(20x103x20x60x5x10) = 1.91x10-6 (mol/phút) 24 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH Trong đó: V1, V2: số ml NaOH 0.05N dùng định phân dung dịch ống nghiệm a: thể tích enzyme cho vào ống nghiệm A: tổng thể tích enzyme có từ m(g) bột đậu nành t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu cân k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.05N  Vậy hoạt độ enzyme urease: ( 1.033-0.1167)x250x1/(20x103x20x60x5x10) = 1.91x10-6  Vì urea bị thủy phân sẵn hay điều kiện diễn thí nghiệm acid tạo khơng mong muốn nên công thức áp dụng cho mẫu mà enzyme bị vô hoạt: a = (V3 - V1)xAxk/(20x103x2xtxaxm) =(0.2-0.1167)x250x1/(20x103x20x60x5x10)=1.73x10-8(mol/phút) Vậy ta lấy a làm sai số hoạt độ enzyme Chứng minh công thức Bàn luận mở rộng: Ý nghĩa việc nghiên cứu động học enzyme Việc nghiên cứu động học enzyme có ý nghĩa quan trọng : - Biết chế phân tử tác động enzyme - Cho phép ta hiểu biết mối quan hệ mặt lượng q trình enzyme - Thấy vai trị quan trọng mặt lý thuyết lẫn thực hành: lựa chọn đơn vị hoạt động enzyme người ta cần phải biết điều kiện tốt hoạt động enzyme, cần phải biết yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động chúng - Là điều kiện cần thiết để thực tốt bước tinh chế enzyme Ngoài tác nhân nồng độ chất, chất hoạt hóa, pH mơi trường,… nhiệt độ tác nhân ảnh hưởng đến hoạt động enzyme Vì thực nghiệm khảo sát động học enzyme hữu ích bổ trợ cho kiến thức chuyên môn Những nguyên nhân phương pháp hạn chế sai số : • Nguyên nhân : Thao tác thí nghiệm : Canh thời gian khơng chuẩn xác Chuẩn độ khơng xác 25 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH • Thao tác thêm hóa chất cho thừa thiếu Hướng khắc phục : tỉ mĩ thao tác tí nghiệm, lặp lặp lại nhiều lần 26 ...BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH - Mục đích thí nghiệm Biết thao tác làm thí nghiệm, Trình bày ngun tắc,... ống thí nghiệm khơng giống Pha hóa chất khơng nồng độ ảnh hưởng đến kết  Cách khắc phục: Thao tác tiến hành thí nhiệm phải xác, nhỏ giọt chất chuẩn để xác định điểm dừng thí nghiệm • Thực thí nghiệm. .. Có thể sử dụng phương pháp ly tâm tách bã để giảm thiểu sai số 10 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH 11 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH BÀI BÁO CÁO SỐ 3: KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ INVERTASE Nguyên tắc Invertase enzyme