Luận văn y học (HOÀN CHỈNH) nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú lưu hành trong máu ngoại vi

ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vú (UTV) loại ung thư (UT) phổ biến phụ nữ nhiều nước giới, đặc biệt nước phát triển UTV chiếm gần 30% loại ung thư phụ nữ, ung thư có tỉ lệ tử vong cao thứ số loại ung thư Theo Hội nghiên cứu ung thư Mỹ, hàng năm toàn giới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú chẩn đoán 465.000 ca tử vong Ở Anh năm 2005 có 212.930 trường hợp mắc bệnh 40.840 ca tử vong [33] Ở Mỹ, năm 2010, 207.000 phụ nữ mắc bệnh ung thư vú chẩn đốn ước tính có tới 39.800 ca tử vong [38] Tại Việt Nam, theo ghi nhận UT giai đoạn 2001-2004, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi Hà Nội 29,7/100.000 dân, TP Hồ Chí Minh tỷ lệ 19,4/100.000 dân, đứng đầu loại UT nữ [1] [2] [16] Mặc dù vào năm 1990 trở đõy có nhiều tiến tầm sốt, chẩn đốn sớm thuốc điều trị ngày có hiệu nhiều trường hợp UTV chẩn đoán giai đoạn muộn dẫn đến việc điều trị tốn kinh tế cho bệnh nhân mà hiệu điều trị lại thấp Các phương pháp cận lâm sàng áp dụng chẩn đoán UT phương pháp chẩn đốn hình ảnh, phương pháp sinh thiết phương pháp hóa sinh phát dấu ấn ung thư (tumor marker) Mỗi loại phương pháp chẩn đốn có ưu điểm hạn chế, thường phải kết hợp phương pháp chẩn đoán khác đem lại hiệu chẩn đốn xác chẩn đốn sớm UTV Trong năm gần đây, với phát triển mạnh mẽ ngành y sinh học phân tử, có nhiều phương pháp giúp cho việc chẩn đoán phát sớm số loại UT nói chung UTV nói riêng ứng dụng Nguyên tắc chung phương pháp sử dụng kỹ thuật phân tích DNA xác định gen gây UT có tính chất gia đình, gen nguy cơ, gen gây UT thương tổn đột biến gen đặc hiệu cho UT Việc phát gen UT lấy từ cỏc mụ UT qua sinh thiết phẫu thuật có nhược điểm lớn phát muộn khối u lớn, gây đau đớn cho bệnh nhân, khó làm nhiều lần, phụ thuộc vào kỹ thuật sinh thiết nên xem phương pháp thường quy để chẩn đốn theo dõi q trình điều trị Do vậy, nghiên cứu phát thị UT máu ngoại vi có ưu điểm nhà nghiên cứu ý Các tế bào UT có nguồn gốc từ tế bào khối u nguyờn phỏt khối u di căn, sau thâm nhập di chuyển máu ngoại vi Các tế bào gọi tế bào khối u di chuyển (Circulating Tumor Cell -CTC) Các CTC chứng di tế bào UT trước cú cỏc biểu lâm sàng Hơn nữa, việc phát gen UT lấy từ mẫu máu ngoại vi có ưu điểm ớt gõy đau đớn cho bệnh nhân, làm nhiều lần Vì vậy, việc sử dụng thị khối u để xác định tế bào khối u máu ngoại vi đóng vai trị quan trọng, góp phần chẩn đốn nhanh, xác bệnh Một số gen thị khối u phát nghiên cứu có mRNA Survivin Gen Survivin mã hóa protein ức chế q trình chết theo chương trình tế bào (apoptosis) Protein biểu mạnh mô bào thai phát triển nhiều loại ung thư, có UTV, điều đặc biệt có ý nghĩa protein khơng biểu cỏc mụ bình thường [4] Có nhiều nghiên cứu thị mRNA Survivin biểu bệnh nhân UT chưa có hạch, gen Survivin xem công cụ hữu hiệu chẩn đoán sớm tiên lượng UTV Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nghiên cứu vấn đề ung thư nói chung ung thư vú nói riêng Chính vậy, để bước đầu góp phần nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định tế bào UT máu ngoại vi chẩn đốn UTV phụ nữ, chúng tơi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu phát gen Survivin từ tế bào ung thư vú lưu hành máu ngoại vi ” với mục tiêu: Xây dựng qui trình phát gen Survivin từ tế bào ung thư vú lưu hành máu ngoại vi Bước đầu nhận xét giá trị xét nghiệm phát gen Survivin chẩn đoán ung thư vú Chương TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm bệnh dịch tễ học UTV 1.1.1 Khái niệm bệnh Ung thư vú tên gọi ung thư có nguồn gốc từ mụ vỳ, phần lớn từ ống dẫn sữa tiểu thuỳ.UTV có nguồn gốc từ ống sữa gọi UT biểu mơ tuyến sữa UT có nguồn gốc từ tiểu thuỳ gọi UT biểu mô tiểu thuỳ.Cú nhiều dạng UTV khác với trạng thái khác nhau, ác tính khác nhau, chất di truyền khác tỷ lệ sống sót khác phụ thuộc vào yếu tố 1.1.2 Dịch tễ học UTV Tình hình ung thư vú giới Ung thư vú bệnh ung thư hay gặp phụ nữ mà nguyên nhân gây tử vong phụ nữ nhiều nước Nguy mắc bệnh UTV theo suốt đời người phụ nữ Tỷ lệ mắc thay đổi nhiều, từ 25-35/100.000 dân Anh, Đan Mạch, Hà Lan Canada đến 15/100.000 dân Nhật Bản, Mexico, Venezuela [16] [18] [19] Bệnh có tỷ lệ mắc cao Mỹ Bắc Âu, tỷ lệ mắc trung bình Nam Âu,Tõy Âu thấp châu Á UTV có xu hướng tăng lên tất nước đặc biệt Nhật Bản Singapore, nơi có lối sống phương Tây hoá chế độ ăn đóng vai trị quan trọng phát triển UTV [16] Theo Hội nghiên cứu ung thư Mỹ, hàng năm tồn giới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú chẩn đoán 465.000 ca tử vong Ở Anh năm 2005 có 212.930 trường hợp mắc bệnh 40.840 ca tử vong (Hobday & Perez, 2005) Ở Mỹ năm 2007 có 178.480 ca xác định mắc bệnh UTV 40.460 ca tử vong (American cancer society, statistics 2007) Tỷ lệ UTV tăng theo tuổi, gặp lứa tuổi 30 (khoảng 0,8%), sau độ tuổi này, tỷ lệ mắc bệnh gia tăng cách nhanh chóng (khoảng 6,5% tuổi 30-40) Theo thống kê hiệp hội phòng chống UT Mỹ, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi tăng từ 25/100.000 dân độ tuổi 30-34 lên đến 200/100.000 dân độ tuổi từ 45-49 [3] Tuy nhiên người ta nhận thấy nguy mắc bệnh tăng chậm độ tuổi từ 45-50 Điều gợi ý UTV loại UT có liên quan mật thiết với nội tiết Tỷ lệ chết UTV tăng lên theo tỷ lệ mắc [3] Tuy nhiên, số nước phát triển tỷ lệ mắc UTV gia tăng nhanh chóng tỷ lệ chết giữ mức ổn định nhờ tiến sàng lọc phát bệnh sớm thành tựu đạt điều trị Người ta nhận thấy tỷ lệ mắc UTV tăng gấp lần so với năm 50 kỷ XX số nước có công nghiệp phát triển mạnh năm qua Nhật Bản, Singapore, số thành phố Trung Quốc Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ mắc cỏc vựng phần giải thích thay đổi lối sống, kinh tế phát triển, ngày có nhiều phụ nữ làm việc lĩnh vực cơng nghiệp, tuổi thọ trung bình tăng, thay đổi sinh sản, chế độ ăn Tình hình ung thư vú Việt Nam Tại Việt Nam, theo ghi nhận tình hình UT Hà Nội, TP Hồ Chí Minh số tỉnh nhiều năm, người ta ước tính tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi năm 2000 17,4/100.000 dõn,đứng đầu loai UT phụ nữ Khác với nước phương tây, Việt Nam UTV bắt đầu tăng nhanh độ tuổi 35 đạt tỷ lệ cao độ tuổi trước sau mãn kinh( 45-54 tuổi) sau có xu hướng giảm xuống rõ rệt Tại Việt Nam giai đoạn 2001-2004, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi Hà Nội 29,7/100.000 dân, TP Hồ Chí Minh Cần Thơ 19,4/100.000 dân, Hải phòng 10,5/100.000 dân, Thái Nguyên 11,6/100.000 dân, Huế 12,2/100.000 dân Đây loại UT có tỷ lệ mắc đứng đầu phụ nữ Việt Nam Tóm lại, UTV bệnh phổ biến tất loại ung thư phụ nữ giới Việt Nam 1.2 Tiến triển giai đoạn ung thư vú 1.2.1.Tiến triển ung thư vú Biểu lâm sàng UTV có đặc trưng kéo dài khác bệnh nhân Đa số trường hợp UTV xâm lấn phát sinh từ tế bào biểu mô thùy ống dẫn tuyến vú Các tế bào bị UT hóa nhân lên với tốc độ khoảng 60 ngày chu kỳ Ước tính, từ tế bào chuyển biến ác tính đến phát khối u có kích thước 1cm phải khoảng thời gian vài năm Chỉ số bệnh nhân (< 3%) sau xuất triệu chứng, UTV tiến triển nhanh tử vong vài tháng [4] [5] UTV có khả chữa khỏi nhiều bệnh nhân bệnh chẩn đoán giai đoạn tiền lâm sàng (chưa có triệu chứng hay dấu hiệu lâm sàng) Green Wood, Bloom CS theo dõi trường hợp UTV khơng điều trị, thấy thời gian sống thêm trung bình kể từ chẩn đoán 31 tháng, tỷ lệ sống thêm năm 40% năm 18 - 20%, có 4% sống thêm 10 năm [3] Giai đoạn chỗ: Khối u nguyên phát xuất phát từ đơn vị tiểu thùy - ống tuyến tận cùng, tức phần chế tiết tuyến vú Sau phát triển lan sang mô lân cận, xô đẩy tổ chức tuyến vú bình thường Xu hướng vượt khỏi mơ tuyến vú xâm nhiễm mô xung quanh đến cấu trúc lân cận da, làm co rút da, sần da cam, phù nề da, đỏ loét da Khi chỳng xõm nhiễm đến cân ngực thành ngực tạo thành khối cứng Giai đoạn lan tràn: + Theo đường bạch huyết: Nhờ mạng lưới mạch bạch huyết dày đặc, UTV lan tới chặng hạch hạch nách vị trí hay gặp vị trí dẫn lưu dịch, bạch huyết vú Tiếp theo hạch thượng đòn, vào hệ tuần hoàn tĩnh mạch cạnh sống, đám rối nối trực tiếp với vú qua mạch máu liên sườn + Theo đường máu: Các tế bào UTV di đến khắp nơi thể, nhiên UTV thường di tới xương, phổi, gan, não Khoảng 20 30% bệnh nhân hạch nách âm tính có di xa chứng tỏ di theo đường máu chủ yếu bệnh nhân Đôi lan tràn xảy thêm từ hệ tĩnh mạch vú, tiêu biểu từ hệ hạch bạch huyết da dẫn đến lan rộng, xâm lấn thành ngực sau đến màng phổi phổi Các tế bào UTV thường di sớm thời điểm chẩn đốn bệnh khơng thể phát di phương pháp chẩn đoán có, vai trị điều trị tồn thân đặt từ bệnh giai đoạn sớm [6] [7] 1.2.1 Các giai đoạn ung thư vú * Hệ thống xếp giai đoạn TNM Dưới hệ thống xếp GĐ (2004) ủy ban Liên kết chống Ung thư Mỹ (AJCC) [27] Hiện nay, hầu hết nghiên cứu cú cỏc nghiên cứu đa quốc gia áp dụng hệ thống xếp GĐ T: U nguyờn phỏt T0 Khơng có u nguyờn phỏt Tis (UTBM chỗ): UTBM nội ống, UTBM thùy chỗ, bệnh Paget núm vú khơng có u T1 U có đường kính lớn ≤ 2cm T2 U có đường kính lớn > 2cm ≤ 5cm T3 U có đường kính lớn > 5cm T4 U xâm lấn thành ngực da kích thước (thành ngực gồm xương sườn, gian sườn, cưa trước, khơng tính ngực) N: Hạch vùng N0 Không di hạch vùng N1 Di hạch nỏch cựng bờn di động N2 Di hạch nỏch cựng bờn cố định dính di hạch vú cựng bờn không di hạch nách N3 Di hạch hạ đũn cựng bên có khụng kốm hạch nỏch cựng bờn, di hạch vú cựng bờn kốm di hạch nỏch cựng bờn, di hạch thượng đũn cựng bên có khụng kốm hạch nách hạch vú cựng bờn M: Di xa M0 Không di xa M1 Có di xa Phân loại có điểm mới: di hạch hạ đòn xếp vào N3 (trước không đề cập), di hạch thượng đũn khụng xếp M1 mà thành N3 Di hạch vú trước xếp vào N3, phân khụng kốm hạch nách (N2b) kèm di hạch nách (N3b) * Xếp giai đoạn lâm sàng Bảng 1.1 Phân chia giai đoạn UTV GĐ I TNM tương ứng Tis N0 M0 T1 N0 M0 T0 N1 M1 IIA T1 N1 M0 T2 N0 M0 T2 N1 M0 IIB T3 N0 M0 T0 N2 M0 T1 N2 M0 IIIA T2 N2 M0 T3 N1 M0 T3 N2 M0 T4 N0 M0 IIIB T4 N1 M0 IIIC IV T4 N2 M0 T bất kỳ, N3, M0 T bất kỳ, N bất kỳ, M1 1.3 Chẩn đoán ung thư vú 1.3.1 Chẩn đoán xác định Chẩn đoán xác định UTV thiết phải có khẳng định giải phẫu bệnh học Giải phẫu bệnh coi “một tiêu chuẩn vàng” chẩn đoán ung thư vú Hiện Bệnh viện K, UTV chẩn đoán xác định dựa vào phương pháp: + Lâm sàng: khối u tính chất khối u + Chụp tuyến vú + Mô bệnh học: chọc hút kim nhỏ Nếu yếu tố nghi ngờ phải sinh thiết tức để chẩn đốn xác định Ngồi phương pháp thơng dụng trờn cũn số phương pháp khác như: sinh thiết kim, sinh thiết mở, sinh thiết 48 giờ, chụp vú kỹ thuật số, siêu âm vú, chụp cộng hưởng từ hạt nhân áp dụng cho trường hợp Hiện nay, nhiều lý mà chẩn đoán UTV kỹ thuật sinh học phân tử chưa ứng dụng rộng rãi, kỹ thuật thường cho kết chẩn đốn xác độ tin cậy cao Chính vậy, tiến hành đề tài nhằm nghiên cứu khả ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc phát hiện, chẩn đoán UTV phụ nữ 1.3.2 Chẩn đoán phân biệt: - U xơ tuyến vú: thường gặp phụ nữ trẻ, u thường tròn nhẵn, ranh giới rõ ràng, di động Để chẩn đoán phân biệt phải chụp X - quang tuyến vú, làm xét nghiệm mô bệnh học - Viêm xơ tuyến vú mang hóa: gặp nang đơn độc nhiều nang to nhỏ rải rác hai bờn vỳ Kích thước to từ vài mm đến 10cm, khám có cảm giác phải chẩn đốn phân biệt nhờ vào siêu âm - Viờm giãn tuyến vú: chảy dịch đầu vú dai dẳng lúc đầu dịch vàng trong, sau bội nhiễm thành dịch vàng mủ chất bã có mùi hơi, số khác chảy dịch máu - Áp xe tuyến vú: có triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau - Nang sữa: hình thành sau trình viêm tắc ống dẫn sữa, nang sữa lỏng đặc sền sệt - U nhú nội ống: tổn thương lòng ống dẫn sữa thường gặp ống dẫn sữa chính, tính chất u trịn, mềm gây chảy dịch, máu qua núm vú 10 bệnh, mẫu mơ làm chẩn đốn mơ bệnh học nhanh, cho kết vòng 30 phỳt.Mẫu lấy vào lọ vô trùng Việc lấy mẫu tiến hành nhà mô bệnh học, mẫu phải lấy vào mơ ung thư nhằm đảm bảo độ xác cho kết nghiên cứu Quy trình lấy mẫu phải đảm bảo vô trùng bảo quản nhiệt độ - 800C 2.2.Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: Thời gian nghiên cứu 3/2011 đến tháng 10/2011 - Địa điểm nghiên cứu: + Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen Viện Cơng nghệ sinh học + Phịng thí nghiệm Bộ mơn Hóa sinh Đại Học Y Hà Nội +Trung tâm nghiên cứu gen protein – Trường Đại học Y Hà Nội 2.3 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang Kết thu được xử lý hệ thống máy tính thuật toán y sinh học 2.4 Phương tiện nghiên cứu 2.4.1.Dụng cụ: Dụng cụ phải vô trùng tuyệt đối (hấp ướt 1200C vòng 20 phút) - Máy Gene Amp PCR System 9700(USA); Effpendorf (Đức) - Tủ lạnh sâu: -300 C; - 800C ( Sanyo), tủ ấm - Máy điện di ngang Mupid ( Nhật Bản), Máy điện di mao quản Agilent 2100 Bioanalyzer 33 - Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) ly tâm để bàn Effpendorf (Đức) - Máy soi gel chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA) - Máy xác định trình tự DNA tự động :ABI 3100, Applied Biosystems, USA - Pipet định mức, đầu cụn cỏc loại, ống PCR, ống effpendorf 1,5ml, ống Falcon, găng tay, giấy thấm vô trùng tuyệt đối - Lò vi súng,tủ sấy, tủ đá, nồi hấp trùng thiết bị khác thuộc phịng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học), khoa hoa sinh Đại Học Y Hà Nội, Trung tâm nghiên cứu gen Protein Trường Đại Học Y Hà Nội 2.4.2 Hóa chất - Húa chất dùng để tách chiết RNA tổng số : Isogen,cloroform, Isopropannol, Ethanol 75%, DEPC – water - Húa chất dùng để tổng hợp cDNA : Random primer, dNTP 10mM, PCR buffer 5X, DTT 0,1M (proteinase inhibitor), HPRI (RNAase inhibitor), MMLV-RT (Enzym phiờn mó ngược) - Hóa chất dùng cho PCR : 10X buffer, dNTP mix, Taq polymerase, GAPDH primer (10pmol/àl), nước cất *Mồi GAPDH (kiểm tra chất lượng cDNA) Mồi xuôi : 5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC- 3’ Mồi ngược: 5’- GAAGATGGTGATGGGATTC- 3’ + Mồi Survivin Mồi xuôi : 5’- AGGAACTGGCCCTTCTTGGAGG- 3’ Mồi ngược: 5’ - CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC-3’ 34 2.5 Quy trình kỹ thuật nghiên cứu 2.5.1 Quy trình nghiên cứu Người bình thường BN nghi ngờ UTV Lâm sàng XN ( hóa sinh, huyết học, CĐHA) Giải phẫu bệnh BN UTV giai đoạn khác BN UTV giai đoạn III, IV Máu BN có u xơ vú Mô (Lấy mổ) - Tách chiết , tinh RNA - RT-PCR - PCR tạo cDNA survivin - Điện di - Tinh cDNA Survivin ( lựa chọn đk tối ưu) Gen cDNA survivin theo đk Giải trình tự gen survivin So sánh trình tự gen survivin với ngân hàng gen biết Kết Kết luận Sơ bộ độ nhạy, đặc hiệu kỹ thuật theo điều kiện Nhận xét giá trị XN gen với XN khác 35 2.5.2 Kỹ thuật nghiên cứu Mẫu nghiên cứu sử dụng thời gian khoảng tháng sau thu thập ► Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm bờnh nhõn UTV Quá trình tách chiết RNA thực (theo Kit S.N.A.P hãng Invitrogen) điều kiện dụng cụ xử lý DEPC 0,1% qua đêm để loại bỏ RNase Sau khử trùng với nhiệt độ áp suất cao (140oC; 0,9 atm; thời gian 45’)  Mẫu máu bệnh nhân UTV sau thu thập tách RNA tổng số Q trình gồm có bước Bước thứ nhất: Tách nucleic acid tổng số - Lấy 200àl mỏu vào ống ependoft RNase Bổ sung proteinase K Vortex 30 giây, ủ 20 phút 37oC Ly tâm 12.000v/p, thu dịch Bổ sung 400 àl isopropanol, đảo Chuyển dịch sang cột S.N.A.P Ly tâm phỳt,12.000v/p, bỏ dịch ly tâm Rửa lần dung dịch X Sau lần rửa ly tâm cột, thời gian phút để loại bỏ hết dịch Dùng 135 àl nước không chứa RNase để thu nucleic acid tổng số Bước thứ hai: Loại DNA - Thêm 15 àl đệm 10X 1àl (2 đơn vị) DNase (không chứa RNase) - Ủ 37oC 10 phỳt Thờm 450àl đệm gắn kết, đảo ngược ống 5-6 - lần Thêm 400 àl isopropanol đảo ống - 10 lần Chuyển dịch vào cột S.N.A.P Ly tâm tốc độ tối đa phút, loại dịch ly tâm Rửa lần dung dịch X Sau lần rửa ly tâm cột, thời gian phút để loại hết dịch Dùng 125 àl nước không chứa RNase để thu RNA tổng số 36  Mẫu mô bệnh nhân UTV: Cân khoảng 120-150 mg, cho 1ml Isogen với bệnh phẩm vào cối sứ nghiền nát tạo thành dung dịch đồng nhất, Isogen có tác dụng phá vỡ tế bào, giải phóng nucleic acid - Dịch thu cho vào ống ependoft RNase để nhiệt độ phịng phút, sau ly tâm 12.000v/p 4oC 10 phút - Ly tâm, hút phần dịch ống, loại bỏ phần lớp lipid phần cặn xác tế bào đáy ống - Bổ xung 200àg chloroform, đảo 15 giây sau ủ phút nhiệt - - độ phịng Ly tâm 12.000v/p 4oC 15 phút Dịch sau ly tâm chia làm lớp: + Lớp trờn chứa RNA tổng số + Lớp chứa DNA + Lớp cuối protein Dùng pipet hút phần dịch chuyển sang ống ependoft Thêm 500 àl isopropanol, đảo đều, để 10 phút nhiệt độ phòng Ly tâm 12.000v/p 4oC 15 phút Loại dịch sau ly tâm, RNA tổng số nằm phần đáy ống Rửa cặn 1ml dung dịch ethanol 75% lạnh RNase, đảo nhẹ Ly tâm 12.000v/p 4oC 10 phút Loại dịch nổi, giữ lại phần cặn, mở nắp ống để khơ tự nhiên Hịa tan lại 25 àl nước không chứa RNase để thu RNA tổng số Cất giữ RNA tổng số thu - 80oC 37 ► Kỹ thuật RT-PCR tổng hợp chuỗi cDNA RT-PCR(hay cịn gọi phiờn mó ngược PCR) kỹ thuật sử dụng RNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên chuỗi DNA bổ sung (cDNA), gồm có giai đoạn: 1) Giai đoạn thứ tổng hợp cDNA (complementary DNA) từ RNA tác dụng enzyme phiờn mó ngược mồi oligo(T) mồi ngẫu nhiên; 2) giai đoạn nhân gen quan tâm từ cDNA PCR với mồi đặc hiệu tác dụng DNA polymerase Nguyên liệu trình dNTP với tham gia enzyme phiờn mã ngược MMLV-RT (Moloney Murine Leukemia Virus-Reverse Trancriptase) thành phần khác như: Taq polymerase, dung dịch đệm PCR 5X, mồi ngẫu nhiên (Random primer), chất ức chế enzyme RNA (RNAase inhibitor), protease inhibitor (DTT), nước cất DEPC Cách tiến hành sau: - Lấy 5àg RNA tổng số cho tube, hoàn thành vừa đủ 6àl với nước cất DEPC, ủ 65-70oC 5-10 phút để biến tính chuỗi RNA, sau cho vào đá lạnh phút - Random primer: 2àl; pha lỗng 20 lần - dNTP 10mM: 5àl - Để hỗn hợp nhiệt độ 20- 25 oC 10 phút, để primer gắn với RNA khn, sau để vào đá lạnh phút - Tiếp tục cho vào : + PCR buffer 5X 4àl + Protease inhibitor 0,1M 1àl + RNAase inhibitor 1àl + MMLV-RT 1àl Tổng thể tích phản ứng : 20 àl - Sau trộn thành phần phản ứng pipet, ly tâm thật nhanh khoảng 10-15 giây - Đưa vào máy PCR, phản ứng tiến hành với chu trình nhiệt sau 38 94oC 94°C : 30giây 55°C : 20giây : phút 35-40 chu kỳ 72°C : 20giây 72oC : phút o C : bảo quản tạm thời Sau kết thúc trình tổng hợp, lấy sản phẩm ly tâm nhanh, thu c DNA, cất giữ -200C Để kiểm tra chất lượng cDNA tách chiết từ RNA tổng số, sử dụng kỹ thuật PCR với mồi GAPDH ► Phản ứng PCR sử dụng mồi GAPDH - 10X buffer : àl - dNTP : àl - Tag polymerase : 0,2 àl - GAPDH primer (10 pmol/ml) + Forward : àl + Reverse : àl : : àl- 1,5 àl 11,8 àl- 8,8 àl - cDNA - Nước cất Tổng thể tích phản ứng : 20 àl  Khi tiến hành kiểm tra chất lượng cDNA phải làm đồng thời với mẫu âm (nước cất)  Chu trình nhiệt phản ứng PCR sau: 94oC : phút 39 o 72 C : phút 94oC : 30giây 55°C : 20giây 35-40 chu kỳ 72°C : 20giây 4oC : bảo quản tạm thời  Sản phẩm PCR chạy agarose 1,5 % để kiểm tra chất lượng cDNA Thành cơng tổng hợp cDNA có nghĩa cDNA trở thành nguồn nguyên liệu quan trọng cho trình tiếp theo, ảnh hưởng trực tiếp đến nhiều phản ứng PCR có phản ứng sử dụng mồi GAPDH để đánh giá cDNA ► Phản ứng PCR sử dụng mồi Survivin Sử dụng cặp mồi phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học) cung cấp Mồi xuôi : 5’- AGGAACTGGCCCTTCTTGGAGG- 3’ Mồi ngược : 5’ - CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC-3’ 40 Với cặp mồi thực phản ứng PCR với thành phần sau: Thành phần phản ứng Dung dịch đệm Mồi F Mồi R DNA khuôn Taq-polymerase dNTPs Mgcl2 BSA 1X Bổ sung H2O đủ Nồng độ 10X 10 pmol/àl 10 pmol/ àl 10-100pmol/ àl unit/ àl 10nM 25mM 1mg/ml Thể tích 2,5 àl àl àl àl 0,5 àl 2,5 àl 2,5 àl àl 10 àl PCR dự định thực với chu trình nhiệt sau : Biến tính 94 oC:2 phút; Thực 30 chu kỳ phản ứng với chu trình nhiệt : Biến tính 94 oC – 45 giây, bắt cặp 50-60oC – 45 giây, kéo dài 72oC- phút để hồn tất phản ứng; Sau mẫu giữ 4oC Tuy nhiên, cặp primer cần xác định nhiệt độ bắt cặp thích hợp ► Kỹ thuật điện di gel agarose 1,5% * Nguyên tắc Dựa vào đặc tính cấu trúc acid nucleic Đó phân tử tích điện âm khắp bề mặt nên chịu tác động điện trường, chúng di chuyển cực dương Phát sản phẩm PCR qua quan sát đèn UV nhờ phát màu ethidium bromide gắn xen DNA [6] - Cách chuẩn bị gel agarose 1,5% Cân 1,5 g agarose hòa tan vừa đủ 10 ml Tris boric acid EDTA (TBE) ( sử dụng lị vi sóng) Sauk hi agarose tan hết để nguội 55-60 oC, đổ vào khuôn gel, tùy thuộc vào số lượng giờngs cần cho điện di mà cài lược làm giếng từ 4-6-8-10 - Cách pha dung dịch TBE 10 X Tris 0,89 M; Acid Boric 0,89 M; EDTA 0,02 M 41 - Kỹ thuật điện di gel agarose 1,5% Thành phần Dung dịch TLPT chuẩn(Hae III) cDNA Loading buffer 10 X Tổng số Ống chuẩn 10 àl 10 àl Ống bệnh phẩm àl àl 10 àl - Đưa gel agarose vào máy điện di, cho TBE đến ngập gel - Dung pipet đầu côn nhỏ hút dung dịch ống đưa vào giếng (10 àl/ giếng) Điện di khoảng 30 phút - Nhuộm gel với ethidium bromide khoảng 20 phút rửa lại nước cất - Hiển thị sản phẩm khuếch đại ánh sáng đèn cực tím (UV) máy soi gel Sản phẩm khuếch đại nhận biết nhờ kích thước chúng dựa vào thang DNA chuẩn - Chụp ảnh ► Giải trình tự DNA - Xác định trình tự gen Survivin dựa phương pháp Sanger cộng Qui trình xác định trình tự gồm bước:  Bước 1: Thực PCR với hỗn hợp phản ứng giải trình tự gồm: 14àl nước cất vơ trùng 4àl DTCS 0,5àl mồi (10pmol/àl) 50-100ng DNA khuôn Hỗn hợp thực 30 chu kỳ với chu trình luân nhiệt thực trờn mỏy PCR 9700 : 96oC 20 giây 50oC 20 giây 60oC phút  Bước : Tinh sản phẩm PCR giải trình tự ethanol: Theo nguyên tắc: acid nucleic chất tan nước tích điện âm PO3, hòa tan với dung dịch muối Natri điện tích âm kết hợp với điện 42 tích dương (Na+) thành phân tử khơng tan nước kết tủa Nước có số điện mơi cao, làm cho Na + PO3- khó kết hợp với Ngược lại, ethanol có số điện môi thấp, nên tạo điều kiện cho Na + tương tác với PO3-, làm kết tủa acid nucleic [32] - Bổ xung àl EDTA 12,5mM, pH = Ly tâm 4000 v/p 45 giây - Thờm 60àl ethanol 95%, ủ nhiệt độ phòng 15 phút - Ly tâm 4500 v/p 45 phút để thu cặn - Rửa cặn 60àl ethanol 70% Ly tâm 10.000v/p để thu cặn - Để khô cặn nhiệt độ phịng phút - Khi cặn khơ, thêm vào 10àl Hidiformamide, trộn nhẹ nhàng - Biến tính 95oC phút  Xác định trình tự trờn mỏy: Sản phẩm PCR giải trình tự sau tinh đưa vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems) để đọc trình tự ►So sánh với trình tự nucleotide gen Survivin công bố ngân hàng gen 43 2.6 Vấn đề đạo đức đề tài * Các đối tượng tham gia nghiên cứu hồn tồn tự nguyện có quyền rút lui khỏi nghiên cứu không muốn tham gia nghiên cứu * Quyền lợi đối tượng tham gia nghiên cứu: Bệnh nhân tiền bồi dưỡng cho q trình khám lấy máu * Các thơng tin liên quan đến bệnh nhân đảm bảo bí mật * Các kỹ thuật thao tác bệnh nhân bảo đảm đỳng chuyờn mụn.Trong trường hợp xảy tai biến nhiễm trùng lấy mỏu…bệnh nhõn điều trị miễn phí khỏi hồn tồn bệnh nhân khơng phải chịu chi phí khác * Đề tài nghiên cứu thực hồn tồn mục đích khoa học khơng mục đích khác 44 CHƯƠNG DỰ KIẾN KẾT QUẢ 1) Xây dựng qui trình phát gen Survivin dựa vào việc khuếch đại gen Survivin từ tế bào ung thư vú lưu hành máu ngoại vi mụ vỳ 2) Bước đầu nhận xét giá trị xét nghiệm phát gen Survivin chẩn đoán ung thư vú 45 CHƯƠNG DỰ KIẾN BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN Dựa vào kết nghiên cứu so sánh với kết nghiên cứu nước ngồi 46 DỰ TRÙ KINH PHÍ Đề tài hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp PGS.TS.Phạm Thiện Ngọc làm chủ nhiệm đề tài quan chủ trì đề tài Trường Đại Học Y Hà Nội 47 ... nghiên cứu ? ?Nghiên cứu phát gen Survivin từ tế bào ung thư vú lưu hành máu ngoại vi ” với mục tiêu: X? ?y dựng qui trình phát gen Survivin từ tế bào ung thư vú lưu hành máu ngoại vi Bước đầu nhận... trình phát gen Survivin dựa vào vi? ??c khuếch đại gen Survivin từ tế bào ung thư vú lưu hành máu ngoại vi mụ vỳ 2) Bước đầu nhận xét giá trị xét nghiệm phát gen Survivin chẩn đoán ung thư vú 45... định tế bào UT máu ngoại vi góp phần chẩn đốn UTV phụ nữ, tiến hành nghiên cứu ? ?Nghiên cứu phát gen Survivin từ tế bào ung thư vú lưu hành máu ngoại vi ” 31 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN