Độc tính với tế bào của hỗn hợp ba kháng sinh (metronidazole, ciprofloxacin và minocyclin)

ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA RĂNG HÀM MẶT NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NCKH CẤP CƠ SỞ ĐỘC TÍNH VỚI TẾ BÀO CỦA HỖN HỢP BA KHÁNG SINH (Metronidazole, Ciprofloxacin Minocyclin) Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Hồng Đạo Bảo Trâm BS Nguyễn Đình Quý Thành phố Hồ Chí Minh 2017 - 2018 MỞ ĐẦU Mục tiêu điều trị nội nha bị nhiễm khuẩn tủy sát khuẩn hệ thống ống tủy Trong phƣơng pháp nội nha tái tạo áp dụng chƣa trƣởng thành, tủy đƣợc xử lý, tạo môi trƣờng vô khuẩn, kích thích tái tạo mơ tạo điều kiện để chân tiếp tục phát triển Trên giới, có nhiều nghiên cứu thử nghiệm phƣơng pháp sử dụng hỗn hợp kháng sinh điều trị nội nha chƣa trƣởng thành có tủy hoại tử [18], số nghiên cứu đề cập đến hỗn hợp kháng sinh ciprofloxacin, metronidazol minocyclin [8] Tại Việt Nam, chƣa có nhiều nghiên cứu sử dụng hỗn hợp kháng sinh nội nha điều trị vĩnh viễn chƣa đóng chóp bị hoại tử tuỷ Nghiên cứu đƣợc thực nhằm khảo sát độc tính với tế bào hỗn hợp kháng sinh ciprofloxacin, metronidazol minocyclin nguyên bào sợi 3T3 chuột tế bào gốc tuỷ ngƣời, với mục tiêu cụ thể nhƣ sau: Xác định mức độ độc tính tế bào hỗn hợp kháng sinh ciprofloxacin, metronidazol minocyclin nguyên bào sợi 3T3 chuột tế bào gốc tuỷ ngƣời So sánh mức độ độc tính với tế bào của hỗn hợp kháng sinh ciprofloxacin, metronidazol minocyclin, với hỗn hợp kháng sinh ciprofloxacin metronidazol, calci hydroxide nguyên bào sợi 3T3 chuột tế bào gốc tuỷ ngƣời ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thử nghiệm in vitro đánh giá độc tính hỗn hợp ba kháng sinh (ciprofloxacin, ciprofloxacin minocyclin), hỗn hợp hai kháng sinh (ciprofloxacin, metronidazol), calcium hydroxide thực nguyên bào sợi 3T3 chuột tế bào gốc tủy ngƣời Nghiên cứu đƣợc tiến hành Trung Tâm Y Sinh Học Phân Tử, Đại Học Y Dƣợc TP HCM Phịng Thí nghiệm Kỹ nghệ Mơ Vật liệu Y sinh, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM, từ tháng 10/2017 - 7/2018 Vật liệu thử nghiệm: – Hỗn hợp ba kháng sinh (TAP) gồm tỉ lệ 1:1:1 theo khối lƣợng ciprofloxaxin, metronidazol minocyclin – Hỗn hợp hai kháng sinh (DAP) gồm tỉ lệ 1:1 theo khối lƣợng ciprofloxaxin metronidazol – Calcium hydroxide (CH) Số lô Ngày sản xuất Hạn dùng 17046 13/11/2017 12/11/2021 Vật liệu Metronidazol 250 mg (Flagyl®) Ciprofloxacin 500 mg (Ecof- lox) D70561 18/07/2017 17/07/2020 Minocyclin 50 mg (Zalenka) 16004 15/12/2016 15/12/2019 11276 04/2016 06/2021 Calcium hydroxide (Master Dent, USA) Thành phần Hoạt chất: metronidazol Tá dƣợc: tinh bột mì, povidone, magnesi stearat Lớp bao: methyl hydroxypropyl cellulose, polyoxyethylen glycol 20000 Hoạt chất: ciprofloxacin HCl Tá dƣợc: microcrystallin cellulose BP, maize starch BP, sodium starch glycollate, sodium lauryl sulphate BP, colloidal anhydrous silica BP, purified talc BP, magnesium stearate BP, instacoat-sol white Hoạt chất: minocyclin HCl Tá dƣợc: calci phosphat dibasic khan, talc, magnesi stearat, croscarmellose natri, sillicon dioxide Hoạt chất: calcium hydroxide Nghiên cứu đánh giá tỉ lệ phần trăm tế bào sống sau ni cấy mơi trƣờng có hỗn hợp ba kháng sinh (TAP), hỗn hợp hai kháng sinh (DAP) calci hydoroxide (CH) nồng độ 0,125; 0,25; 0,5; (mg/ml) Hỗn hợp ba kháng sinh (TAP) đƣợc chuẩn bị cách hòa tan 100mg hỗn hợp (tỉ lệ ciprofloxacin:metronidazol:minocyclin 1:1:1, 33.3 mg loại kháng sinh) vào 10ml nƣớc cất Hỗn hợp hai kháng sinh (DAP) đƣợc chuẩn bị cách hòa tan 100mg hỗn hợp (tỉ lệ metronidazol, ciprofloxacin 1:1, 50mg loại kháng sinh) vào 10ml nƣớc cất CH đƣợc chuẩn bị cách hoà tan 100mg calcium hydroxide vào 10ml nƣớc cất Nồng độ dung dịch mẹ 10mg/ml Sau lọc qua màng lọc vơ trùng kích thƣớc 0,2μm (Sartorius Minisart 17597K) Sau pha lỗng mơi trƣờng ni cấy tế bào, dùng cơng thức × = × ( : nồng độ, : thể tích) để đƣợc nồng độ mong muốn [19] Các loại vật liệu đƣợc chuẩn bị nhiệt độ phòng vào ngày thực thử nghiệm Tế bào: Chuẩn bị tế bào 3T3: – Nguyên bào sợi 3T3 chuột đƣợc cung cấp Phịng thí nghiệm tế bào Trung tâm Y sinh học phân tử trƣờng Đại học Y Dƣợc TP HCM Tế bào 3T3 hệ 14 đƣợc cấy chuyền đến hệ 15, sau thực thử nghiệm hệ 16 Theo dõi tăng sinh tế bào trải lớp đơn phủ bề mặt đĩa nuôi (độ bao phủ đạt 80%) Cấy chuyền tế bào 3T3 – Hút bỏ môi trƣờng nuôi cấy cũ – Rửa bề mặt đĩa nuôi với 10ml PBS – Thêm vào 1ml trypsin - EDTA 0,25%, ủ tủ ấm 37°C phút để tách tế bào khỏi bề mặt đĩa nuôi – Thêm 5ml DMEM + 10% CS để bất hoạt trypsin – Hút toàn 6ml đĩa ống falcon 15ml, ly tâm 3000 vòng/phút, phút, nhiệt độ phòng – Sau ly tâm hút bỏ môi trƣờng ống falcon, thêm 10ml môi trƣờng để huyền phù tế bào – Chuẩn bị - đĩa nuôi cấy (tùy tỉ lệ cấy chuyền), cho vào đĩa 10ml môi trƣờng nuôi cấy (DMEM + 10% CS) lƣợng huyền phù tế bào đƣợc chia cho đĩa – Ủ 37°C, 5% CO2 – Thay môi trƣờng ngày – Tế bào đĩa nuôi cấy đạt mật độ 80% đƣợc thu hoạch để thực thử nghiệm Chuẩn bị DPSC: – Tế bào gốc tuỷ đƣợc nuôi cấy từ tủy cối lớn thứ ba đƣợc nhổ theo định, Khoa Răng Hàm Mặt - Trƣờng Đại Học Y Dƣợc TP HCM, độ tuổi bệnh nhân từ 18 - 25 tuổi, nhổ nguyên vẹn, không sâu răng, khơng có bệnh lý tủy răng, bệnh lý vùng quanh chóp Răng sau nhổ đƣợc cho vào dung dịch bảo quản (DMEM/F12), lƣu trữ đá lạnh chuyển vào phịng thí nghiệm ni cấy tế bào [2] Ba cối lớn thứ ba ba ngƣời đƣợc sử dụng nghiên cứu Răng khôn ngƣời nhổ, nguyên vẹn, đƣợc làm phần mô mềm xung quanh, cho vào falcon chứa 5ml dung dịch chuyên chở (DMEM/F12 + 10% FBS + Penicillin 100UI/ml - Streptomycin 100µg/ml) Sau falcon đƣợc bảo quản đá lạnh chuyển vào Phịng Thí nghiệm Kỹ nghệ Mô Vật liệu Y sinh, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM Răng đƣợc xử lý thực phân lập, ni cấy chun gia phịng thí nghiệm Ba dòng tế bào phân lập từ cối lớn thứ ba đƣợc dùng cho thử nghiệm nghiên cứu Quy trình phân lập ni cấy DPSC [11]: – Dùng mũi khoan 701 vô trùng cắt rãnh khoảng 2mm xung quanh cổ (đƣờng nối men ngà) không làm lộ tủy – Ngâm vào 5ml dung dịch povidone iodin 10% 10 phút – Rửa lần PBS – Tách đôi phần thân chân kìm nhổ răng, thu đƣợc mô tủy – Cắt nhỏ mô tủy kéo nhỏ 1ml Trypsin 0,25% – Ủ 37°C 30 phút, 10 phút lấy voxtex phút – Thêm môi trƣờng nuôi cấy, lọc qua màng lọc 70μm – Ly tâm 3000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng, thu huyền phù tế bào – Cho huyền phù tế bào vào bình Roux 25cm2 – Thay môi trƣờng ngày/lần đến tế bào phủ 80% bề mặt Roux thực cấy chuyền – Tế bào hệ thứ đƣợc dùng cho nghiên cứu Nuôi cấy tế bào đĩa 96 giếng: – Thu nhận tế bào theo phƣơng pháp trypsin hóa – Lấy 20µl để xác định mật độ tế bào 1ml huyền phù với phƣơng pháp đếm buồng đếm hồng cầu – Xác định lƣợng thể tích huyền phù thích hợp để đạt đƣợc số lƣợng tế bào mong muốn – Gieo tế bào lên đĩa 96 giếng, giếng 104 tế bào – Ủ 37°C, 5% CO2 24 để tế bào bám vào đáy đĩa 96 giếng Đếm số lƣợng tế bào buồng đếm hồng cầu: – Huyền phù tế bào, sau lấy 20µl huyền phù tế bào trộn với 20µl trypan blue 0,4% (tỉ lệ pha loãng 1:1) – Trộn mẫu pippette – Phủ buồng đềm lamelle cho giọt huyền phù vào buồng đếm cách nhỏ sát mép chỗ tiếp xúc cạnh lamelle buồng đếm – Định vị buồng đếm kính hiển vi vật kính x4, đếm tế bào vật kính x10 – Đếm số tế bào vùng đếm góc buồng đếm Đếm tất tế bào không bắt màu thuốc nhuộm (tế bào sống) tế bào bắt màu thuốc nhuộm (tế bào chết) Đếm theo nguyên tắc cạnh - bên phải (đối với tế bào nằm vạch ranh giới, đếm tế bào nằm phía bên phải ô đếm, không đếm tế bào nằm cạnh dƣới bên trái) – Đếm hai mẫu lấy số lƣợng tế bào trung bình A, tính mật độ tế bào theo cơng thức: (A/4) × 104 (tế bào/ml) – Mẫu đƣợc nhuộm tỉ lệ 1:1 với trypan blue nên mẫu đƣợc pha loãng hai lần Vậy số lƣợng tế bào ml huyền phù ban đầu N = (A/4) × × 104 (tế bào/ml) Đánh giá phần trăm tế bào sống sau thử nghiệm: Sau chuyển tế bào lên đĩa 96 giếng, đánh giá phần trăm tế bào sống sau xử lý với loại vật liệu TAP, DAP CH nồng độ 0,125; 0,25; 0,5; (mg/ml) thử nghiệm đo màu formazan (thử nghiệm MTT MTS), thử nghiệm lặp lại ba lần với mẫu chứng âm Quy trình nhƣ sau: Ngày thứ nhất: Cấy tế bào (3T3 DPSC) đĩa 96 giếng, giếng 104 tế bào Ngày thứ hai (sau cấy tế bào lên đĩa 96 giếng 24 giờ): – Kiểm tra tế bào dƣới kính hiển vi để đảm bảo tế bào bám dính – Thay mơi trƣờng ni cấy môi trƣờng bổ sung mẫu thử nồng độ xác định + Đối với tế bào 3T3: nồng độ lặp lại hai lần + Đối với tế bào DPSC: nồng độ lặp lại ba lần Ngày thứ ba (sau thêm TAP, DAP CH vào đĩa 96 giếng xử lý 24 giờ): – Quan sát tế bào dƣới kính hiển vi – Hút bỏ môi trƣờng nuôi cấy giếng – Đối với tế bào 3T3 + Thêm vào giếng 100μl môi trƣờng 20μl MTS/PMS ủ 37°C, 5% CO2 + Đo mật độ quang OD bƣớc sóng 492nm máy đo OD (SFRI IRE 96), liệu đƣợc nhập vào máy tính – Đối với DPSC + Thêm vào giếng 100μl môi trƣờng nuôi cấy bổ sung MTT (nồng độ MTT 0,5mg/ml), ủ 37°C, 5% CO2 + Hút bỏ MTT, thêm vào 100μl DMSO:Ethanol 1:1 ủ 37°C, 5% CO2 + Đo mật độ quang bƣớc sóng 570nm máy đo OD (EZ Reader 400), sử dụng phần mềm Galapagos để ghi nhận lƣu kết máy tính phịng thí nghiệm Độc tính vật liệu đƣợc đánh giá thơng qua tỉ lệ sống (%) tế bào sau nuôi cấy mơi trƣờng có vật liệu thử nghiệm KẾT QUẢ Nghiên cứu in vitro đƣợc thực nhằm đánh giá độc tính hỗn hợp ba kháng sinh (ciprofloxacin, metronidazol, minocyclin - TAP), so sánh với độc tính hỗn hợp hai kháng sinh (ciprofloxacin, metronidazol - DAP) calcium hydroxide (CH) nguyên bào sợi 3T3 chuột tế bào DPSC ngƣời Trong thử nghiệm, nguyên bào sợi 3T3 DPSC đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng có DAP, TAP CH nồng độ 0,125; 0,25; 0,5; (mg/ml) Sau 24 giờ, độc tính vật liệu đƣợc đánh giá dựa tỉ lệ tế bào sống (%) Kết đƣợc trình bày theo hai mục tiêu Mục tiêu thứ xác định so sánh độc tính TAP, DAP CH lên tế bào 3T3 Mục tiêu thứ hai xác định so sánh độc tính TAP, DAP CH lên tế bào DPSC Độc tính tế bào 3T3: Đánh giá định tính: Sau xử lý tế bào với mẫu thử, hình thái tế bào đƣợc quan sát qua kính hiển vi soi ngƣợc Kết cho thấy nhóm tế bào tiếp xúc với TAP, nồng độ thuốc tăng lên mật độ tế bào giảm dần; nồng độ 1mg/ml, có nhiều tế bào chết co tròn lên bề mặt Đối với nhóm tiếp xúc với DAP, kết thu đƣợc tƣơng tự nhƣ nhóm tiếp xúc với TAP; nồng độ cao, mật độ tế bào giảm Ở nhóm tiếp xúc với CH, nồng độ vật liệu thử nghiệm không ảnh hƣởng tới mật độ tế bào Hình 1: Hình thái tế bào 3T3 mẫu thử với TAP (vật kính 10X) Hình 2: Hình thái tế bào 3T3 mẫu thử với DAP (vật kính 10X) Hình 3: Hình thái tế bào 3T3 mẫu thử với CH (vật kính 10X) Đánh giá định lượng: Tế bào 3T3 đƣợc nuôi cấy đến mật độ tế bào chiếm 80% bề mặt đĩa nuôi, thực thử nghiệm hệ 16 Tế bào ddwwocj nuôi cấy mơi trƣờng có TAP, DAP CH nồng độ 0,125; 0,25; 0,5; mg/ml sau 24 Kết cho thấy TAP nồng độ 0,125 mg/ml không gây độc tế bào 3T3, với tỉ lệ phần trăm tế bào sống 76,5%, (khơng có khác biệt với nhóm chứng p = 0,66), nồng độ TAP tăng tỉ lệ phần trăm tế bào 3T3 sống giảm (khác biệt với nhóm chứng âm, p < 0,05) Tỉ lệ phần trăm tế bào 3T3 sống sau thử nghiệm với TAP, DAP CH Nồng độ (mg/ml) Trung vị (khoảng tứ phân vị) Vật liệu 0,125 TAP 76,5 (72,2-77,8) 76 (73,7-80,1) 96,2 (94,3-99,8) 101,5 (98,7-103,7) DAP CH C 0,25 66,2 (54,2-68,1) 69,9 (63,9-71,8) 100,5 (98,2-101,2) 101,5 (98,7-103,7) 0,5 52,7 (43,3-58,7) 50,7 (49,2-56,3) 92,9 (83,3-97,1) 101,5 (98,7-103,7) 33,8 (23,5-38,6) 40,2 (36,6-49) 89 (84,5-91) 101,5 (98,7-103,7) TAP: hỗn hợp ba kháng sinh (ciprofloxacin, metronidazol minocyclin) DAP: hỗn hợp hai kháng sinh (ciprofloxacin, metronidazol) CH: calcium hydroxide C: nhóm chứng âm, mơi trƣờng ni cấy khơng có vật liệu thử nghiệm Đối với DAP, nồng độ 0,125 mg/ml hỗn hợp kháng sinh không gây độc tế bào 3T3, với tỉ lệ phần trăm tế bào sống 76%; khơng có khác biệt so với nhóm chứng (p = 0,64) Tƣơng tự nhƣ TAP, nồng độ DAP tăng, phần trăm tế bào sống giảm có ý nghĩa so với nhóm chứng (p DAP > CH KIẾN NGHỊ – Thử nghiệm đánh giá khả diệt khuẩn hỗn hợp kháng sinh nồng độ không gây độc tế bào 3T3 DPSC (≤ 0,125 mg/ml) vi khuẩn phân lập từ tủy bị hoại tử – Thử nghiệm bào chế hỗn hợp kháng sinh có nồng độ khơng gây độc tế bào có tác dụng diệt khuẩn hiệu hƣớng đến ứng dụng lâm sàng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Lê Bảo Hà, Đồn Ngun Vũ, Tơ Minh Quân cộng (2012), “Tiềm ứng dụng tế bào gốc tuỷ ngƣời”, Tạp chí nghiên cứu y học, 16 (1), 127–134 Lê Hồng Sơn, Ngơ Thị Quỳnh Lan Trần Lê Bảo Hà (2014), “3 Hiệu bảo quản tế bào gốc tuỷ dung dịch chuyên chở”, Tạp chí nghiên cứu y học, 18 (1), 282– 287 Hồng Đạo Bảo Trâm, Tơ Minh Quân, Đoàn Nguyên Vũ cộng (2013), “Phân lập nuôi cấy tế bào gốc tuỷ chuột”, Tạp chí nghiên cứu y học, 82 (2), 67–73 Hoàng Đạo Bảo Trâm Tạ Thành Văn (2012), “Tế bào gốc nhú chóp tiềm tái tạo mơ chƣa trƣởng thành”, Tạp chí nghiên cứu y học, 79 (2), 337–341 Võ Đắc Tuyến, Nguyễn Thị Hồng, Nguyễn Đức Tuấn cộng (2012), “Nhiễm khuẩn răng/viêm mô tế bào: vi khuẩn mức độ kháng kháng sinh TP Hồ Chí Minh năm 2010”, Tạp chí y học TP HCM, 16 (2), 162–169 Đoàn Nguyên Vũ, Phạm Trần Hƣơng Trinh, Nguyễn Thị Nhật Uyên cộng (2011), “Nuôi cấy tế bào gốc từ tuỷ ngƣời”, Tạp chí cơng nghệ sinh học, (3), 297– 301 Tiếng Anh Abbaszadegan A., Dadolahi S., Gholami A et al (2016), “Antimicrobial and Cytotoxic Activity of Cinnamomum Zeylanicum, Calcium Hydroxide, and Triple Antibiotic Paste as Root Canal Dressing Materials”, The Journal of Contemporary Dental Practice, 17, 105–113 Andreasen J.O., Farik B., and Munksgaard E.C (2002), “Long-term calcium hydroxide as a root canal dressing may increase risk of root fracture”, Dental Traumatology, 18 (3), 134–137 Anila N., Murali H., Chranjeevi J et al (2014), “Lesion sterilization and tissue repair”, Cumhuriyet Dental Journal, 17 (4), 414–422 10 Araújo P.R de S., Silva L.B., Neto A.P dos S et al (2017), “Pulp Revascularization: A Literature Review”, The Open Dentistry Journal, 10 (1), 48–56 11 Bao Ha T.L., Nguyen Vu D., Quan T.M et al (2011), “Study on Culture of Human Dental Pulp Stem Cells to Apply in Tissue Engineering”, Journal of Biomimetics, Biomaterials and Tissue Engineering, 11, 13–20 12 Berkhoff J.A., Chen P.B., Teixeira F.B et al (2014), “Evaluation of Triple Antibiotic Paste Removal by Different Irrigation Procedures”, Journal of Endodontics, 40 (8), 1172–1177 13 Bogović A., Nižetić J., Galić N et al (2011), “The Effects of Hyaluronic Acid, Calcium Hydroxide, and Dentin Adhesive on Rat Odontoblasts and Fibroblasts” 14 Bottino M.C., Yassen G.H., Platt J.A et al (2015), “A novel three-dimensional scaffold for regenerative endodontics: materials and biological characterizations”, Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, (11), E116–E123 15 Bottino M., Kamocki K., Yassen G et al (2013), “Bioactive Nanofibrous Scaf-folds for Regenerative Endodontics”, Journal of Dental Research, 92 (11), 963–969 16 Casagrande L., Cordeiro M.M., Nör S.A et al (2011), “Dental pulp stem cells in regenerative dentistry”, Odontology, 99 (1), 1–7 17 Chen M.Y.H., Chen K.L., Chen C.A et al (2012), “Responses of immature permanent teeth with infected necrotic pulp tissue and apical periodontitis/abscess to revascularization procedures”, International Endodontic Journal, 45 (3), 294–305 18 Chuensombat S., Khemaleelakul S., Chattipakorn S et al (2013), “Cytotoxic effects and antibacterial efficacy of a 3-antibiotic combination: An in vitro study”, Journal of Endodontics, 39 (6), 813–819 19 Diogenes A., Henry M.A., Teixeira F.B et al (2013), “An update on clinical regenerative endodontics”, Endodontic Topics, 28 (1), 2–23 20 Gathani K.M and Raghavendra S.S (2016), “Scaffolds in regenerative endodontics: A review.”, Dental research journal, 13 (5), 379–386 21 Ghatole K., Gowdra R.H.G., Azher S et al (2016), “Enhancing the antibacterial activity of the gold standard intracanal medicament with incorporation of silver zeolite: An in vitro study.”, Journal of International Society of Preventive & Community Den-tistry, (1), 75–79 22 Gomes-Filho J.E., Duarte P.C.T., De Oliveira C.B et al (2012), “Tissue reaction to a triantibiotic paste used for endodontic tissue self-regeneration of nonvital immature permanent teeth”, Journal of Endodontics, 38 (1), 91–94 23 Ha T.L.B and Vu D.N (2015), “Human dental pulp stem cells cultured onto dentin derived scaffold can regenerate dentin-like tissue in vivo”, Cell and Tissue Bank-ing, 16 (4), 559–568 24 Hargreaves K.M., Diogenes A., and Teixeira F.B (2013), “Treatment options: Biological basis of regenerative endodontic procedures”, Journal of Endodontics, 39 (3 SUPPL.), S30–S43 25 Hirschman W.R., Wheater M.A., Bringas J.S et al (2012), “Cytotoxicity comparison of three current direct pulp-capping agents with a new bioceramic root repair putty” 26 Hoshino E., Kurihara-Ando N., Sato I et al (1996), “In-vitro antibacterial susceptibility of bacteria taken from infected root dentine to a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline.”, International endodontic journal, 29 (2), 125–130 27 Hosseini Matin M., Zare Jahromi M., Fesharaki M et al (2015), “Cytotoxicity of Triple Antibiotic Paste and Calcium Hydroxide against Cultured Human Dental Pulp Fibroblasts”, Journal of Dental School Shahid Beheshti University of Medical Sciences, 33 (3), 196–204 28 Huynh N.C.-N., Le S.H., Doan V.N et al (2017), “Simplified conditions for storing and cryopreservation of dental pulp stem cells”, Archives of Oral Biology, 84, 74–81 29 Keller L., Offner D., Schwinté P et al (2015), “Active Nanomaterials to Meet the Challenge of Dental Pulp Regeneration”, Materials, (11), 7461–7471 30 Khashaba R.M., Chutkan N.B., and Borke J.L (2009), “Comparative study of biocompatibility of newly developed calcium phosphate-based root canal sealers on fibroblasts derived from primary human gingiva and a mouse L929 cell line”, International Endodontic Journal, 42 (8), 711–718 31 Kobayashi M., Kagawa T., Takano R et al (2007), “Effect of medium pH on the cytotoxicity of hydrophilic statins.”, Journal of pharmacy & pharmaceutical sciences : a publication of the Canadian Society for Pharmaceutical Sciences, Societe canadienne des sciences pharmaceutiques, 10 (3), 332–339 32 Labban N., Yassen G.H., Windsor L.J et al (2014), “The direct cytotoxic effects of medicaments used in endodontic regeneration on human dental pulp cells”, Dental Traumatology, 30 (6), 429–434 33 Lee B.-N., Moon J.-W., Chang H.-S et al (2015), “A review of the regenerative endodontic treatment procedure.”, Restorative dentistry & endodontics, 40 (3), 179–187 34 Lin L.M and Rosenberg P.A (2011), “Repair and regeneration in endodontics” 35 Löfmark S., Edlund C., and Nord C.E (2010), “Metronidazole Is Still the Drug of Choice for Treatment of Anaerobic Infections”, Clinical Infectious Diseases, 50 (s1), S16– S23 35 Mohammadi Z., Jafarzadeh H., Shalavi S et al (2018), “A Review on Triple Antibiotic Paste as a Suitable Material Used in Regenerative Endodontics.”, Iranian endodontic journal, 13 (1), 1–6 36 Nerness A.Z., Ehrlich Y., Spolnik K et al (2016), “Effect of triple antibiotic paste with or without ethylenediaminetetraacetic acid on surface loss and surface roughness of radicular dentine”, Odontology, 104 (2), 170–175 37 Omori N., Kobayashi H., and Tsutsui T (1999), “Quantitative comparison of cytocidal effects of tetracyclines and fluoroquinolones on human periodontal ligament fibroblasts”, Journal of Periodontal Research, 34 (6), 290–295 39 Parhizkar A., Nojehdehian H., and Asgary S (2018), “Triple antibiotic paste: momentous roles and applications in endodontics: a review”, Restorative Dentistry & Endodontics, 43 (3), e28 40 Pereira M.S.S., Cardoso C.R., Da Silva J.S et al (2014), “Cellular and molecular tissue response to triple antibiotic intracanal dressing”, Journal of Endodontics, 40 (4), 499– 504 41 Peters O.A (2013), “Research that matters - biocompatibility and cytotoxicity screening”, International Endodontic Journal, 46 (3), 195–197 42 Pissiotis E and Spangberg L.S.W (1991), “Toxicity of Pulpispad using four different cell types”, International Endodontic Journal, 24 (5), 249–257 43 Riss T.L., Moravec R.A., Niles A.L et al (2017), “Cell Viability Assays”, Assay Guidance Manual tr.305–335, 305–335 44 Ritz C., Baty F., Streibig J.C et al (2015), “Dose-Response Analysis Using R”, 45 Ruparel N.B., Teixeira F.B., Ferraz C.C.R et al (2012), “Direct Effect of Intracanal Medicaments on Survival of Stem Cells of the Apical Papilla”, Journal of Endodontics, 38 (10), 1372–1375 46 Sabrah A.H., Yassen G.H., Liu W.C et al (2015), “The effect of diluted triple and double antibiotic pastes on dental pulp stem cells and established Enterococcus faecalis biofilm”, Clinical Oral Investigations, 19 (8), 2059–2066 47 Skoglund A and Tronstad L (1981), “Pulpal changes in replanted and autotransplanted immature teeth of dogs”, Journal of Endodontics, (7), 309–316 48 Sonoyama W., Liu Y., Yamaza T et al (2008), “Characterization of the Apical Papilla and Its Residing Stem Cells from Human Immature Permanent Teeth: A Pilot Study”, Journal of Endodontics, 34 (2), 166–171 49 Strober W (2001), “Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability”, Current Protocols in Immunology John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA, tr.Appendix 3:Appendix 3B, Appendix 3:Appendix 3B 50 Thibodeau B., Teixeira F., Yamauchi M et al (2007), “Pulp Revascularization of Immature Dog Teeth With Apical Periodontitis”, Journal of Endodontics, 33 (6), 680– 689 51 Trevino E.G., Patwardhan A.N., Henry M.A et al (2011), “Effect of Irrigants on the Survival of Human Stem Cells of the Apical Papilla in a Platelet-rich Plasma Scaffold in Human Root Tips”, Journal of Endodontics, 37 (8), 1109–1115 52 Trope M (2010), “Treatment of the Immature Tooth with a Non-Vital Pulp and Apical Periodontitis”, Dental Clinics of North America, 54 (2), 313–324 53 Tziafas D (2004), “The future role of a molecular approach to pulp-dentinal regeneration”, Caries Research, 314–320 54 Vojinović O and Vojinović J (1993), “Periodontal cell migration into the apical pulp during the repair process after pulpectomy in immature teeth: an autoradiographic study.”, Journal of oral rehabilitation, 20 (6), 637–652 55 Yadlapati M., Souza L.C., Dorn S et al (2014), “Deleterious effect of triple antibiotic paste on human periodontal ligament fibroblasts”, International Endodontic Journal, 47 (8), 769–775 56 Yassen G.H., Eckert G.J., and Platt J.A (2015), “Effect of intracanal medica-ments used in endodontic regeneration procedures on microhardness and chemical struc-ture of dentin”, Restorative Dentistry & Endodontics, 40 (2), 104–112 57 Zeichner-David M., Oishi K., Su Z et al (2003), “Role of Hertwig’s epithelial root sheath cells in tooth root development”, Developmental Dynamics, 228 (4), 651– 663 58 Žižka R and Šedý J (2017), “Paradigm Shift from Stem Cells to Cell-Free Regenerative Endodontic Procedures: A Critical Review”, Stem Cells and Development, 26 (3), 147–153 59 “ISO 10993-5 (2009) Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity”, International Standard, 3, 1–42  ... đánh giá độc tính với tế bào hỗn hợp ba kháng sinh, hỗn hợp hai kháng sinh calci hydorxide tế bào 3T3 DPSC, đề tài đƣa kết luận sau: Hỗn hợp ba kháng sinh (ciprofloxacin, metronidazole minocyclin). .. mức độ độc tính với tế bào của hỗn hợp kháng sinh ciprofloxacin, metronidazol minocyclin, với hỗn hợp kháng sinh ciprofloxacin metronidazol, calci hydroxide nguyên bào sợi 3T3 chuột tế bào gốc... tuỷ ngƣời ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thử nghiệm in vitro đánh giá độc tính hỗn hợp ba kháng sinh (ciprofloxacin, ciprofloxacin minocyclin), hỗn hợp hai kháng sinh (ciprofloxacin, metronidazol),