Nghiên cứu thành phần hóa học theo hướng tác dụng sinh học của rễ vân mộc hương (radix saussureae lappae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỮU PHÚC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA RỄ VÂN MỘC HƯƠNG (Radix Saussureae lappae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỮU PHÚC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA RỄ VÂN MỘC HƯƠNG (Radix Saussureae lappae) Ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Huỳnh Ngọc Thụy Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Nguyễn Hữu Phúc Luận văn thạc sĩ dược học Nguyễn Hữu Phúc MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC SƠ ĐỒ viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC .2 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm chi Saussurea 1.1.3 Đặc điểm Vân mộc hương 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Tinh dầu .4 1.2.2 Sesquiterpen lacton 1.2.3 Flavonoid .7 1.2.4 Triterpen .8 1.2.5 Anthranoid 1.2.6 Các shikokiol .8 1.2.7 Acid chlorogenic 1.3 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC 1.3.1 Kết nghiên cứu đại 1.3.2 Công dụng theo y học cổ truyền 12 1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG 14 1.4.1 Định tính 14 1.4.2 Định lượng 14 1.5 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP THỬ KHÁNG KHUẨN 16 1.5.1 Một số phương pháp thử kháng khuẩn 16 1.5.2 Xác định MIC chất thử 18 1.6 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP THỬ CHỐNG OXY HÓA 18 i Luận văn thạc sĩ dược học Nguyễn Hữu Phúc 1.7 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO 19 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .21 2.2.1 Dung mơi, hóa chất 21 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị .22 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.3.1 Xác định nguyên liệu 23 2.3.2 Xác định tinh khiết .23 2.3.3 Khảo sát thành phần hóa học .23 2.3.4 Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn chống oxy hóa 23 2.3.5 Phân lập hợp chất theo hướng kết sàng lọc 27 2.3.6 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập 27 2.3.7 Thử tác dụng sinh học các hợp chất phân lập 27 2.3.8 Xây dựng phương pháp định lượng 28 2.3.9 Đánh giá hàm lượng costunolid dehydrocostus lacton các mẫu dược liệu chế phẩm 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 XÁC ĐỊNH NGUYÊN LIỆU 32 3.1.1 Đặc điểm hình thái .32 3.1.2 Đặc điểm vi học 33 3.1.2 Định danh bằng phương pháp giải trình tự ADN 36 3.1.3 Phân biệt Vân mộc hương với các loài khác .38 3.1.4 So sánh các mẫu rễ VMH 39 3.2 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT 41 3.2.1 Định lượng tinh dầu 41 3.2.2 Xác định độ ẩm 41 3.2.3 Độ tro 42 i Luận văn thạc sĩ dược học Nguyễn Hữu Phúc 3.2.4 Hàm lượng chất chiết 42 3.3 Khảo sát hóa học 43 3.3.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 43 3.3.2 Định tính tinh dầu VMH bằng sắc ký lớp mỏng 44 3.3.3 Phân tích tinh dầu Vân mộc hương bằng GC-MS .44 3.4 KẾT QUẢ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH SINH HỌC 46 3.4.1 Kết thử kháng khuẩn 46 3.4.2 Kết sàng lọc chống oxy hóa bằng DPPH 49 3.4.3 Kết sàng lọc hoạt tính ức chế xanthin oxidase 50 3.5 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP .50 3.5.1 Chiết xuất cao toàn phần cao phân đoạn .50 3.5.2 Phân lập hợp chất từ cao ethyl acetat (SL-B) 51 3.5.3 Phân lập hợp chất từ phân đoạn hexan (SL-A1) 52 3.5.4 Tinh chế, kiểm tra độ tinh khiết các hợp chất 53 3.6 BIỆN GIẢI CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT 57 3.6.1 Hợp chất E1 .57 3.6.2 Hợp chất SL1 .60 3.6.3 Hợp chất SL2 .62 3.7 THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC TRÊN CAO PHÂN ĐOẠN VÀ HỢP CHẤT TINH KHIẾT 64 3.7.1 Kết thử kháng khuẩn 64 3.7.2 Kết xác định nồng độ ức chế xanthin oxidase 50% (IC50) 65 3.8 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 67 3.8.1 Khảo sát phương pháp chiết, chuẩn bị mẫu .67 3.8.2 Khảo sát điều kiện phân tích đồng thời COS DHC bằng UPLC 70 3.8.3 Đề xuất quy trình thẩm định cho phương pháp định lượng .76 3.8.4 Ứng dụng quy trình xây dựng để đánh giá hàm lượng COS DHC các mẫu rễ VMH chế phẩm .84 3.9 DỰ THẢO NÂNG CAO TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU VÂN MỘC HƯƠNG 85 v Luận văn thạc sĩ dược học Nguyễn Hữu Phúc CHƯƠNG BÀN LUẬN 89 4.1 XÁC ĐỊNH NGUỒN NGUYÊN LIỆU 89 4.2 KIỂM TINH KHIẾT 89 4.3 KHẢO SÁT HÓA HỌC 90 4.4 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN .91 4.5 HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA VÀ ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE .92 4.6 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 92 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 94 5.1 KẾT LUẬN 94 5.2 ĐỀ NGHỊ 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO 97 PHỤ LỤC… 103 v Luận văn thạc sĩ dược học Nguyễn Hữu Phúc DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tồn hoa Vân mộc hương .3 Hình 1.2 Rễ khơ thái lát Vân mộc hươngg .4 Hình 1.3 Phổ UV acid uric 20 Hình 3.1 Tồn Vân mộc hương 32 Hình 3.2 Lá Vân mộc hương .32 Hình 3.3 Cụm hoa hoa Vân mộc hương 33 Hình 3.4 Vi phẫu lá Vân mộc hương .34 Hình 3.5 Vi phẫu thân Vân mộc hương 34 Hình 3.6 Vi phẫu rễ Vân mộc hương .35 Hình 3.7 Soi bột rễ Vân mộc hương 36 Hình 3.8 Kết BLAST NCBI giữa hai mẫu 37 Hình 3.9 Một số lồi có cùng tên gọi Mộc hương 38 Hình 3.10 Hình thái rễ khơ loài Mộc hương [68] 39 Hình 3.11 Hình dạng các mẫu rễ khơ .40 Hình 3.12 Sắc ký đồ các mẫu VMH 41 Hình 3.13 Sắc ký đờ tinh dầu VMH 44 Hình 3.14 Sắc ký đờ các phân đoạn chiết rắn – lỏng từ cao CHCl3 49 Hình 3.15 Sắc ký đờ các phân đoạn phân bố lỏng – lỏng 49 Hình 3.16 Sắc ký đờ các phân đoạn cao ethyl acetat .52 Hình 3.17 Sắc ký đồ các phân đoạn cao hexan (SL-A1) 53 Hình 3.18 Sắc ký lớp mỏng hợp chất E1 53 Hình 3.19 Sắc ký lớp mỏng hợp chất SL1 SL2 55 Hình 3.20 Sắc ký đờ kiểm tinh khiết chất SL1 56 Hình 3.21 Sắc ký đồ kiểm tinh khiết chất SL2 57 Hình 3.22 Các tương tác chính phổ COSY HMBC hợp chất E1 60 Hình 3.23 Các tương tác chính phổ COSY HMBC hợp chất SL1 62 Hình 3.24 Các tương tác chính phổ COSY HMBC hợp chất SL2 64 Hình 3.25 So sánh hiệu chiết hai dung môi MeOH ACN 67 i Luận văn thạc sĩ dược học Nguyễn Hữu Phúc Hình 3.26 So sánh hiệu hai phương pháp chiết 69 Hình 3.27 SKĐ với hệ pha động MeOH – H2O (50:50) 70 Hình 3.28 SKĐ với hệ pha động ACN – H2O (50:50) 70 Hình 3.29 Sắc ký đồ với tốc độ dòng 0,1 ml/phút 72 Hình 3.30 Sắc ký đờ với tốc độ dòng 0,15 ml/phút 72 Hình 3.31 Sắc ký đờ với tốc độ dòng 0,2 ml/phút 72 Hình 3.32 Sắc ký đờ với tốc độ dòng 0,25 ml/phút 73 Hình 3.33 Sắc ký đồ với tốc độ dòng 0,30 ml/phút 73 Hình 3.34 Sắc ký đồ với tốc độ dòng 0,35 ml/phút 73 Hình 3.35 SKĐ với điều kiện chọn 75 Hình 3.36 Pic tinh khiết COS DHC với điều kiện chọn 75 Hình 3.37 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thử 77 Hình 3.38 Phổ UV tinh khiết pic mẫu thử 77 Hình 3.39 Pic tinh khiết phổ UV mẫu chuẩn 78 Hình 3.40 SKĐ tương thích hệ thống 79 Hình 3.41 Đường tuyến tính COS .80 Hình 3.42 Đường tuyến tính DHC 80 Hình 3.43 SKĐ tuyến tính COS DHC 81 Hình 3.44 SKĐ (LOD), (LOQ) COS DHC 81 Hình 3.45 SKĐ tổng thể khảo sát độ lặp lại 82 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số sesquiterpen lacton từ rễ Vân mộc hương Bảng 1.2 Các phương pháp định tính, định lượng VMH bằng sắc ký lỏng .15 Bảng 2.1 Các loại mẫu dùng cho thử nghiệm ức chế xan thin oxidase 27 Bảng 3.1 Mức độ tương đồng hai mẫu BLAST NCBI 37 Bảng 3.2 Một số đặc điểm phân biệt mặt hình thái thực vật .38 Bảng 3.3 Hàm lượng tinh dầu các mẫu Vân mộc hương .41 Bảng 3.4 Độ ẩm các mẫu dược liệu Vân mộc hương 42 ii Luận văn thạc sĩ dược học Nguyễn Hữu Phúc Bảng 3.5 Kết độ tro các mẫu dược liệu 42 Bảng 3.6 Hàm lượng chất chiết các mẫu dược liệu 42 Bảng 3.7 Kết phân tích sơ thành phần hóa học rễ VMH2.1 43 Bảng 3.8 Thành phần tinh dầu mẫu TD_SL 45 Bảng 3.9 Thành phần tinh dầu mẫu HEX_SL 46 Bảng 3.10 Kết thử kháng khuẩn tinh dầu bay các cao toàn phần 47 Bảng 3.11 Kết thử kháng khuẩn các cao chế phẩm 47 Bảng 3.12 Kết thử kháng khuẩn các cao phân đoạn 48 Bảng 3.13 Kết thử ức chế xanthin oxidase các mẫu cao chiết 50 Bảng 3.14 Kết tách phân đoạn cao SL-B 51 Bảng 3.15 Kết tách phân đoạn cao hexan 52 Bảng 3.16 Dữ liệu phổ 1H-NMR phần acid quinic E1 58 Bảng 3.17 So sánh dữ liệu phổ NMR E1 1,5-diCQA 59 Bảng 3.18 So sánh dữ liệu phổ NMR chất SL1 DHC 61 Bảng 3.19 So sánh dữ liệu phổ NMR chất SL2 COS 63 Bảng 3.20 Kết thử kháng khuẩn hợp chất 65 Bảng 3.21 Kết ức chế xanthin oxidase cao SL-B .65 Bảng 3.22 Kết ức chế xanthin oxidase cao SL-A5 .66 Bảng 3.23 Kết ức chế xanthin oxidase chất E1 66 Bảng 3.24 Kết ức chế xanthin oxidase allopurinol .66 Bảng 3.25 Hệ dung môi rửa giải 67 Bảng 3.26 Khảo sát với dung môi MeOH 68 Bảng 3.27 Khảo sát với dung môi ACN 68 Bảng 3.28 Khảo sát chiết bằng siêu âm với thể tích chiết khác 69 Bảng 3.29 Khảo sát chiết bằng đun hồi lưu với thể tích chiết khác 69 Bảng 3.30 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống COS 78 Bảng 3.31 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống DHC 78 Bảng 3.32 Tương quan nồng độ diện tích đỉnh COS DHC .79 Bảng 3.33 Kết khảo sát LOD LOQ chuẩn COS DHC 81 ... Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỮU PHÚC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA RỄ VÂN MỘC HƯƠNG (Radix Saussureae lappae) Ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền... những lý trên, đề tài ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học theo hướng tác dụng sinh học rễ Vân mộc hương? ?? thực nhằm khảo sát thành phần hóa học có hoạt tính rễ VMH Từ góp phần nâng cao tiêu chuẩn... dicaffeoylquinic góp phần vào tác dụng chống oxy hóa các họ Cúc [33] O OH HO O HO O OH OH HO 1.3 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC 1.3.1 Kết nghiên cứu đại Tác dụng kháng khuẩn Khi nghiên cứu tác dụng kháng