KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii. CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH -Nguyễn Hồng Minh Huy KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẨN KHOA HỌC: TS TRẦN THỊ THANH Tp HCM, 2006 LỜI CÁM ƠN Trên hết, xin chân thành biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ TRẦN THỊ THANH, người tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ suốt thời gian làm đề tài; với tất tinh thần tình thương trách nhiệm giúp tơi hồn thành luận văn, bên cạnh tơi học hỏi nhiều kiến thức q báu nơi phương pháp nghiên cứu khoa học Tôi chân thành cám ơn thầy khoa sinh, khoa hóa - trường đại học sư phạm HCM, thầy cô môn sinh hóa - trường đại học khoa học tự nhiên, tận tình giúp đỡ tơi thời gian thực đề tài luận văn thầy cô công tác phịng thí nghiệm vi sinh - sinh hóa, phịng thí nghiệm sinh lý thực - trường đại học sư phạm HCM giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian làm đề tài Tp HCM, tháng năm 2006 NGUYỄN HOÀNG MINH HUY MỤC LỤC Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 1.1.1 Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa xạ khuẩn: 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái 1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa xạ khuẩn 1.1.2 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn: 1.1.2.1 Khái niệm chất kháng sinh 1.1.2.2 Những nghiên cứu giới nước ta kháng sinh 1.1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 1.1.2.4 Sự hình thành đường sinh tổng hợp chất kháng sinh 1.1.2.5 Cơ chế tác động chất kháng sinh 1.1.3 Tách chiết tinh chế chất kháng sinh 1.1.3.1 Tách chiết kháng sinh từ sinh khối 1.1.3.2 Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc 1.1.3.3 Tinh chất kháng sinh 1.2 Các nhóm chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn: 1.2.1 Phân loại chất kháng sinh từ xạ khuẩn 1.2.2 Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn 1.3 Vai trò xạ khuẩn chất kháng sinh phòng chống nấm bệnh tuyến trùng hại trồng: 1.3.1 Thực trạng bệnh hại trồng 1.3.2 Vai trò xạ khuẩn, chất kháng sinh phòng chống bệnh tuyến trùng hại trồng Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu: 2.2 Phương pháp: 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 2.2.1.1 Phương pháp làm phòng ẩm quan sát hình thái vi thể xạ khuẩn 2.2.1.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh – phương pháp khuếch tán thạch 2.2.1.3 Phương pháp xác định sinh khối vi sinh vật 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 2.2.2.1 Phương pháp xác định khả phân giải hợp chất cao phân tử xạ khuẩn 2.2.2.2 Phương pháp xác định khả sinh chất kích Trang 3 3 10 10 11 13 15 16 19 21 21 22 22 22 30 31 31 40 47 52 52 52 53 53 54 54 thích sinh trưởng thực vật 2.2.3 Phương pháp hóa lý 2.2.3.1 Phương pháp khảo sát khả bền nhiệt chất kháng sinh 2.2.3.2 Phương pháp tách chiết tinh kháng sinh 2.2.3.3 Phương pháp xác định nhóm chức cấu trúc hóa học chất kháng sinh 2.2.3.4 Phương pháp xác định khả hoà tan dung môi chất kháng sinh 2.2.4 Phương pháp khác 2.2.4.1 Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng từ rể bị nhiễm bệnh 2.2.4.2 Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng khỏi đất 2.2.4.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên khả nảy mầm hạt 2.2.4.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên phát triển Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 3.1.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 3.1.2 Đặc điểm sinh trưởng phát triển môi trường nuôi cấy khác 3.1.3 Đặc điểm sinh lý sinh hóa xạ khuẩn 3.2 Nghiên cứu khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 3.2.1 Thử họat tính kháng sinh 3.2.2 Lựa chọn mơi trường thích hợp cho việc tạo kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 3.3 Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 3.3.1 Ảnh hưởng pH ban đầu: 3.3.2 Ảnh hưởng chế độ thơng khí: 3.3.3 Xác định thời gian sinh kháng sinh tối ưu: 3.3.4 Ảnh hưởng nguồn hydratcacbon: 3.3.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ: 3.4 Tách chiết tinh chất kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 3.4.1 Lựa chọn dung mơi thích hợp 3.4.2 Tách chiết tinh kháng sinh: 3.4.3 Tìm hiểu tính chất chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 55 57 57 57 60 61 61 61 62 62 62 63 63 64 66 72 72 73 76 76 78 80 83 85 89 89 92 95 3.5 Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii lên tác nhân gây hại trồng 3.5.1 Khảo sát khả ức chế chất kháng sinh lên nấm bệnh hại trồng: 3.5.2 Khảo sát khả ức chế chất kháng sinh lên tuyến trùng hại trồng 3.6 Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii đến hoạt động sinh lý trồng 3.6.1 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên khả nảy mầm hạt: 3.6.2 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên phát triển con: Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 98 98 101 107 107 108 111 Ở ĐẦU Thiệt hại kinh tế bệnh điều thấy rõ: làm giảm suất trồng, giảm phẩm chất nông sản thu hoạch bảo quản, ảnh hưởng xấu đến đất trồng cấu trồng Từ kỷ 18 Anton De Bary đặt móng mơn khoa học bệnh (1853) Để khắc phục thiệt hại bệnh gây ra, người ta sử dụng nhiều biện pháp như: kỹ thuật canh tác, thuốc hóa học, … sử dụng thuốc hóa học để phòng ngừa ngăn chặn bệnh hại trồng nhiều người ưa chuộng tính dễ sử dụng, hiệu cao kết hợp với biện pháp canh tác việc phịng bệnh cho đạt hiệu lớn Tuy nhiên, sau thời gian dài sử dụng thuốc hóa học phân hóa học người ta nhận thấy chúng ảnh hưởng đến môi trường sống lớn Chúng tác động xấu đến cân sinh thái, gây ô nhiễm môi trường đất, nước làm cho người gia súc bị ngộ độc Đáng ngại hơn, số thuốc trừ sâu chậm phân hủy lưu tồn lâu đất (DDT lưu tồn 25 năm) lưu tồn lâu đất chất hoá học làm nồng độ chúng tăng dần theo thời gian Đồng thời việc sử dụng tuỳ tiện liều lượng, thời gian phun thuốc hóa học tạo nên dư lượng lớn không cho phép rau màu lương thực, gây nên vụ ngộ độc thực phẩm lớn mà người mà biết thời gian qua Để khắc phục nhược điểm thuốc hóa học bảo vệ mơi sinh, người ta tìm kiếm biện pháp phát vai trò vi sinh vật việc điều chỉnh cân sinh học hệ sinh thái Bằng biện pháp khống chế sinh học, người ta bước sản xuất nhiều chế phẩm vi sinh vật qui mô lớn sử dụng công tác phòng trừ sâu bệnh Càng ngày người ta sử dụng rộng rãi chế phẩm kháng sinh từ chủng xạ khuẩn đối kháng, mà đặc tính chất kháng sinh thoả mãn tính chất cần thiết để sử dụng bảo vệ thực vật, như: - Không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển Ở số nồng độ thích hợp chúng cịn kích thích khả nảy mầm hạt sinh trưởng - Không gây hại cho người gia súc - Có hiệu lực thời gian định ngồi mơi trường tự nhiên - Có tác dụng tiêu diệt cách có chọn lọc vi khuẩn gram dương, vi khuẩn gram âm, kháng nấm mạnh Dicklow.M.B cộng vào năm 1996 công bố patent số 5549889 lồi Streptomyces dicklowii, lồi có khả kháng nấm tuyến trùng hại trồng, thích hợp sử dụng làm vi sinh vật khống chế sinh học nông nghiệp Chúng nhận chủng Streptomyces dicklowii từ phịng thí nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm Tp Hồ Chí Minh, chủng xạ khuẩn nhập từ Mỹ Để tiến tới sử dụng có hiệu chủng xạ khuẩn điều kiện môi trường Việt Nam, tiến hành thực đề tài: “KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii” Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 1.1.1 Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa xạ khuẩn: 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái: Xạ khuẩn sống phổ biến tự nhiên đất, chúng có nhiều đặc điểm giống vi khuẩn khác với nấm mốc kích thước tế bào nhỏ, thành tế bào không chứa cenllulose hay kitin, phân chia tế bào theo kiểu vô ti (Amytoz), không phân biệt giới tính; nhiên, xạ khuẩn có đặc điểm giống nấm mốc có hệ sợi khuẩn ty phân nhánh, xạ khuẩn hệ sợi vách ngăn Sự phân hố khuẩn ty khí sinh mấu lồi xuất bề mặt sợi khuẩn ty sau mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi phát triển dài thành sợi, cuối tạo thành hệ sợi dầy đặc Đường kính sợi khuẩn ty 0,5µm – 1,5µm (R.E Buchanan, 1998) Khuẩn ty khí sinh xạ khuẩn phát triển bên ngồi khơng khí bề mặt mơi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn dạng hình trịn khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vịng trịn đồng tâm (xem hình 1.1), khác với khuẩn lạc nấm men, nấm mốc vi khuẩn, khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt có mấu lồi, có nếp nhăn sần sùi Theo Procofieva Bengopxkaia (1936), cho khuẩn lạc xạ khuẩn có lớp: lớp gồm sợi bện chặt lại với nhau, lớp tương đối xốp hơn, lớp có cấu trúc tổ ong Khuẩn lạc xạ khuẩn mang màu sắc khác như: màu đỏ, màu lam, màu xám, màu tím Hình 1.1: Các dạng khuẩn lạc xạ khuẩn Các khuẩn ty mọc phía khuẩn lạc cắm sâu vào môi trường khuẩn ty chất, khuẩn ty chất có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng để cung cấp dinh dưỡng cho tồn thể nên cịn gọi khuẩn ty dinh dưỡng Đường kính khuẩn ty chất thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty khơng có vách ngăn khơng bị đứt đoạn Tuỳ loại mơi trường mà khuẩn ty chất tiết môi trường số loại sắc tố có sắc tố hịa tan nước có sắc tố hịa tan dung mơi hữu Sau thời gian phát triển, đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên sợi phân hóa gọi cuống sinh bào tử; tuỳ theo loài mà cuống sinh bào tử thẳng hay uốn cong, xoắn lị so hay xoắn ốc; chúng mọc đơn, mọc đối, mọc vòng, mọc thành chùm, số vòng xoắn cuống sinh bào tử từ – 10 vịng, đường kính vịng xoắn thay đổi từ – 7nm (xem hình 1.2) Hình 1.2: Các dạng cuống sinh bào tử xạ khuẩn Bào tử xạ khuẩn hình thành từ cuống sinh bào tử, thường có hình cầu, hình ovan, hình que … bề mặt bào tử có dạng như: dạng nhẵn (hình 1.4), dạng xù xì, dạng gai (hình 1.3), dạng tóc Hình 1.3: Bào tử dạng gai Streptomyces africanus chủng CPJVR-HT (hình chụp kính hiển vi điện tử theo ijs.sgmjournals.org/ / medium/frontcover.gif ) Hình 1.4: Bào tử dạng nhẵn Streptomyces violazeoruber (hình chụp kính hiển vi điện tử theo www.ncl.ac.uk/biol/ assets/MSc-IB.jpg ) 1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa xạ khuẩn: 1.1.1.2.1 Đặc điểm sinh lý nuôi cấy: Xạ khuẩn phân bố rộng rãi tự nhiên, môi trường đất - xạ khuẩn chiếm 20 – 40% tổng số vi sinh vật đất, tập trung nhiều lớp đất bề mặt (sâu xuống khoảng 40cm) Hầu loại đất có mặt xạ khuẩn, đa số xạ khuẩn vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, số xạ khuẩn ưa nhiệt Xạ khuẩn thường sống tốt mơi trường có pH trung tính Xạ khuẩn thuộc thể dị dưỡng nên nguồn hydratcacbon mà chúng sử dụng tinh bột, đường, polysaccaric… nguồn nitơ mà xạ khuẩn sử dụng bao gồm: muối amon, muối nitrat (nguồn nitơ vô cơ); protein, pepton, cao ngô, …(nguồn nitơ hữu cơ) 1.1.1.2.2 Khả sinh enzym xạ khuẩn: Enzym chất xúc tác sinh học tạo thành tế bào vi sinh vật, đóng vai trị quan trọng trao đổi chất vi sinh vật Enzym hoạt động xúc tác phản ứng chuyển hóa thể mà cịn xúc tác chuyển hóa bên ngồi mơi trường – điều có ý nghĩa lớn việc ứng dụng enzym vi sinh vật vào công nghiệp, nông nghiệp,… Ở xạ khuẩn, người ta thu nhận loại enzym như: - Enzym amylaza: thu nhận từ loài Streptomyces aureofaciens, Streptomyces diastochromogens, … - Enzym cenllulaza: thu nhận từ loài Streptomyces antibioticus, Streptomyces sp 0143, … - Enzym proteaza: thu nhận từ Streptomyces kinoluteus, Streptomyces verticillatus var zynogenes, Actinomyces fradiae, … - Enzym kitinaza: thu nhận từ Streptomyces griseus, … Trong enzym proteaza xạ khuẩn ứng dụng nhiều công nghệ thực phẩm – có tác dụng làm mềm thịt Các chế phẩm bán thị trường như: PRONAZA Nhật (thu nhận từ Streptomyces griseus); M – zim Mỹ (thu nhận từ Streptomyces fradiae) (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998) Ngoài người ta cịn ý loại enzym q xạ khuẩn glucoza izomeraza, enzym giúp biến đổi đường glucose thành đường fructose với độ cao (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998) CH2OH CHO (CHOH)4 GLUCOSE IZOMERAZA C=O (CHOH)3 CH2OH CH2OH Glucose Fructose Để thu enzym người ta thường thu canh trường nuôi cấy chúng Thành phần dinh dưỡng môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng tổng hợp enzym, nên để tăng tổng hợp enzym mơi trường ni cấy phải có đầy đủ thành phẩn dinh dưỡng đặc biệt cần bổ sung “chất cảm ứng” tổng hợp enzym, thường chất tương ứng enzym cần tổng hợp Thí dụ: tổng hợp proteaza Actinomyces cần chất cảm ứng protein đậu nành hay protein động vật 1.1.1.2.3 Khả sinh vitamin xạ khuẩn: - Vitamin B12: Cũng vi khuẩn, xạ khuẩn có khả tổng hợp tốt vitamin B12, loại vitamin mà động vật thực vật khơng có khả tổng hợp Nên cơng nghệ tổng hợp vitamin B12 đường sản xuất chủ yếu đường sinh học mà xạ khuẩn vi khuẩn hai loài vi sinh vật người ta quan tâm – lồi xạ khuẩn là: Actinomyces olivaceus, Actinomyces griseus, Actinomyces aureopacieus, Actinomyces pradiae, Actinomyces autibioticus, …Đáng kể xạ khuẩn Actinomyces olivaceus loài vi khuẩn Propionibacterium shermanii chủng vi sinh vật sử dụng công nghiệp sản xuất vitamin B12 - Caroten (tiền vitamin A): vào thể người động vật chuyển thành vitamin A Các chủng xạ khuẩn quan tâm là: Blakeslea trispora, Mycobacterium smegmatis, Streptomyces chrestomyceticus … 1.1.1.2.4 Khả sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật xạ khuẩn: Khả sinh chất kích thích sinh trưởng vi sinh vật phát từ sớm Năm 1925, Saubert phát auxin môi trường ni cấy nấm Rhizopus suinus, Kurosawa (1926) trích ly Gibberellin (GA) từ nấm Fusarium moniliforme Năm 1926 E.Kurosawa (người Nhật) tìm thấy lồi nấm mốc tên Gibberella fugikuroi Ơng chứng minh nấm nhiễm vào con, chúng làm tăng trưởng với tốc độ cao Năm 1930 người ta phân lập kết tinh chất từ Gibberella gọi gibberellin Trong vòng 30 năm trở lại có 70 chất khác phân lập từ nấm mốc nhiều thực vật có hoa xếp vào nhóm gibberellin (GAs) Gibberellin thường sử dụng thí nghiệm GA3 hay acid gibberellic Có nhiều xạ khuẩn đất có khả sinh tổng hợp Auxin - dạng phytohoocmon có ý nghĩa trồng Auxin có vai trị quan trọng kiểm sốt tăng dài tế bào Vì tế bào thực vật có vách bao bọc, nên tế bào tăng trưởng vách kéo dài Vách cấu tạo phần lớn đường đa mà thành phần cellulose Ở vách sơ cấp, cellulose diện dạng sợi dài liên kết với đường đa khác để tạo mạng lưới Khi tăng trưởng liên kết bị đứt tạm thời, vách tế bào trở nên đàn hồi vật liệu chen vào Auxin có vai trị hai trình Trong auxin, β – indole acetic acid (IAA) kích thích tố sinh trưởng thực vật người ta quan tâm nhiều Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu khả sinh IAA xạ khuẩn: Các chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp IAA kể như: Streptomyces olivochromoferus 1/247 có khả tạo thành 33 μgIAA/ ml canh trường, Streptomyces olivochromoferus 1/294 có khả tạo thành 9μgIAA/ ml canh trường, …( Lê Thị Hoa, 1998) Qúa trình sinh tổng hợp IAA vi sinh vật diễn phức tạp, phương pháp đồng vị phóng xạ người ta xác định IAA có nguồn gốc từ Triptophan (hình 1.5) Hình 1.5: Các đường hình thành IAA vi sinh vật (theo Lê Thị Hoa,1998) 1.1.2 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn: 1.1.2.1 Khái niệm chất kháng sinh: Có nhiều lập luận khác theo nguồn gốc theo hướng điều trị bệnh nhìn chung hiểu chất kháng sinh (Antibiotic) chất có nguồn gốc vi sinh vật thực vật có tác dụng ức chế sinh trưởng tiêu diệt số vi sinh vật khác cách có chọn lọc nồng độ thấp Chất kháng sinh chất hóa học có hoạt tính kháng lại vi sinh vật như: vi khuẩn gây bệnh cho người động vật; nấm gây bệnh động vật 10 thực vật Các vi sinh vật mẫn cảm với chất kháng sinh mức độ khác nhau, đa số vi khuẩn gram dương mẫn cảm với chất kháng sinh vi khuẩn gram âm 1.1.2.2 Những nghiên cứu giới nước ta kháng sinh: - Trên giới: Kể từ Penicillin Alexander Fleming phát vào 1928, Abraham, Chain Florey tinh chế dạng ổn định có tác dụng chữa bệnh vào 1941 (www.vinachem.com.vn), kỷ qua, kháng sinh trở thành dược phẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu lĩnh vực dược phẩm giới, với kết ngày lạ, với nhu cầu ngày tăng với lượng sản xuất ngày lớn Hơn nữa, cạnh bên chất Penicillin đầu đàn, có thêm nhiều loại kháng sinh chiết xuất từ nấm, từ vi khuẩn, từ xạ khuẩn Những thành tựu tách chiết kháng sinh từ xạ khuẩn có minh chứng qua số patent: patent số 3968204 Hamill, 1976 tách chiết kháng sinh A-2315 từ Actinoplanes philippinensis NRRL 5462; patent số 4331658 Hamill, 1982 tách chiết kháng sinh A-32887 từ Streptomyces albus NRRL 11109; patent số 4537770 Michel, 1985 tách chiết kháng sinh A41030 từ Streptomyces virginiae NRRL 12525; patent số 4637981 Hershberger, 1987 tách chiết kháng sinh A-4696G từ Actinoplanes missouriensis; patent số 4659660 Hamill, 1987 tách chiết kháng sinh A47934 từ Streptomyces toyocaensis NRRL 15009; patent số 5229362 Kirst, 1993 tách chiết kháng sinh A10255 từ Streptomyces gardneri Đó patent Mỹ, Mỹ nước sản xuất kháng sinh hàng đầu giới, bên cạnh nước phát triển cơng nghiệp kháng sinh Hàn Quốc có cơng nghiệp sản xuất kháng sinh, kháng sinh tinh khiết dùng điều trị bệnh cịn có kháng sinh dạng chế phẩm sinh học Biocontrol dạng lỏng có thành phần bao gồm số chủng Streptomyces sp.; Trung Quốc nước trọng phát triển công nghiệp kháng sinh, nhà máy kháng sinh xây dựng Tứ Xuyên, Thượng Hải, 11 Trường Sa, Hắc Long Giang, Quảng Châu để sản xuất nguyên liệu thành phẩm kháng sinh từ vi sinh vật - Ở Việt Nam: có nhiều cố gắng việc tìm kiếm sản xuất chất kháng sinh phục vụ cho nhu cầu điều trị bệnh, tách chiết nổ lực hợp tác với nước để sản xuất kháng sinh kết chưa đáp ứng so với nhu cầu thực tế Những cố gắng tổng kết qua mốc thời gian sau: Năm 1950, kháng chiến chống Pháp, GS Ðặng Văn Ngữ nuôi cấy Pénicillum dùng dịch nuôi cấy để chữa vết thương cho thương binh; Năm 1962 - 1965, Liên Xô (cũ), theo yêu cầu ta, khảo sát thiết kế cho Việt Nam nhà máy sản xuất thuốc kháng sinh, dự định đặt Phú Thọ (Bắc bộ), sau phải ngưng lại chiến tranh mở rộng miền Bắc; Năm 1968, Trung Quốc giúp ta thiết kế xưởng Tetracyclin tấn/năm, trước dự định xây dựng Cao Bằng, sau chuyển Sơn Tây Việt Trì, quan hệ hai nước lúc có trục trặc nên cơng trình bỏ dở; Năm 1970, Ðơn vị nghiên cứu chuyên đề kháng sinh GS Trương Công Quyền làm chủ nhiệm đời, giáo sư cộng có nhiều cơng trình nghiên cứu kháng sinh: phân lập tập hợp lớn chủng vi sinh vật đặc biệt có xạ khuẩn sinh kháng sinh có nguồn gốc từ đất Việt Nam Đã tiến hành nghiên cứu sinh lý sinh hoá chủng vi sinh vật sinh kháng sinh tách chiết, định loại số kháng sinh Từ 1985 đến 1990, chương trình nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước mã số 64C, Bộ Y tế cho nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin Tetracyclin Cũng thời gian (từ 1985 – 1990), Liên Xô (cũ) thỏa thuận giúp ta xây dựng nhà máy kháng sinh tấn/năm Xí nghiệp Dược phẩm TW 24, TPHCM Cơng việc triển khai tình hình trị Liên Xô cũ chuyển biến không thuận lợi, nên cơng trình đình lại vào năm 1992 (theo Nguyễn Duy Cương, 2005) Đến nay, có số dây chuyền bào chế kháng sinh đạt tiêu chuẩn GMC Aseane nguyên liệu phải nhập từ nước như: 12 xí nghiệp dược 24 thành phố Hồ Chí Minh nguyên liệu Ampicinlin Amocillin từ nguyên liệu trung gian 6-APA nhập từ Belarut; bên cạnh vào 1999- 2000 tổng công ty dược Việt Nam chủ trì đề tài “Nghiên cứu cơng nghệ điều chế 6-APA, 7-ADCH cephalexin từ penicillin G” đề tài “Nghiên cứu áp dụng công nghệ sản xuất kháng sinh mới, hiệu nguyên liệu nước” Gần lãnh đạo Tổng cơng ty Hóa chất tổng cơng ty Dược có văn trình phủ hợp tác xây dựng nhà máy sản xuất 300 tấn/ năm cephalexin bán tổng hợp hệ hệ từ nguyên liệu trung gian 7-ADCA 7-ACA nhập Từ tình hình cho thấy sản xuất nguyên liệu kháng sinh nước nhu cầu cấp bách chiến lược quốc gia phát triển ngành dược Việt Nam Trong chiến lược phát triển khoa học công nghệ Việt Nam từ đến 2010 (do thủ tướng Phan Văn Khải ký) xác định Việt Nam phải sản xuất kháng sinh phải sản xuất tự túc 60% thuốc dùng nước.(theo www.vinachem.com.vn ) Với tiêu chí cho thấy cần cơng trình nghiên cứu tiến tới sử dụng chủng vi sinh vật đặc biệt xạ khuẩn để sản xuất kháng sinh dùng cho nhu cầu lớn đặt 1.1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh: 1.1.2.3.1 - Điều kiện nuôi cấy: Độ thơng khí: yếu tố thơng khí ảnh hưởng định đến sinh tổng hợp chất kháng sinh Các xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nên độ thơng khí để đạt hiệu suất cực đại đóng vai trị quan trọng ảnh hưởng khả sinh kháng sinh; lượng khơng khí cung cấp vào mơi trường ni cấy lưu lượng thổi khí thể tích mơi trường /1 phút - Nhiệt độ: có lồi xạ khuẩn ưa nhiệt hay sống tốt nhiệt độ môi trường cao đa số xạ khuẩn sinh kháng sinh mà khảo sát thường phát triển tốt nhiệt độ 28OC – 30OC (nhiệt độ phịng thí nghiệm) Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường nằm khoảng 18OC – 28OC 13 - pH: sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc đáng kể vào độ pH mơi trường Độ pH thích hợp để sinh tổng hợp chất kháng sinh pH trung tính, pH acid kiềm ức chế trình sinh tổng hợp chất kháng sinh - Nhân giống: Qua thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp chất kháng sinh không phụ thuộc vào điều kiện lên men mà phụ thuộc vào chất lượng bào tử giống sinh dưỡng, nghĩa tuổi khả đồng mặt di truyền hoạt tính trao đổi chất giống phản ánh điều kiện nuôi cấy Điều kiện môi trường nhân giống thời gian nhân giống khác tùy vào chủng tuổi bào tử giống - Hình thức lên men: sinh tổng hợp chất kháng sinh phương pháp nuôi cấy yếu tố định; Qui trình sản xuất chất kháng sinh thường ni cấy theo phương pháp ni cấy chìm nồi lên men có khuấy đảo sục khí 1.1.2.3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy: Sinh tổng hợp chất kháng sinh vi sinh vật phụ thuộc chặt chẽ vào môi trường lên men Trước hết nguồn C, N phosphat vô Các vi sinh vật phát triển môi trường nhân giống cấy truyền lên mơi trường lên men có nguồn gốc C, N thành phần môi trường khác dẫn đến khả sinh chất khác - Nguồn cacbon: trình sinh trưởng sinh tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng sâu sắc thông qua nguồn cacbon khác Tuỳ thuộc vào chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp; loại đường đơn: Glucose, Manitole, … hay loại đường kép: Saccarose, Lactose, … loại tinh bột chất có thành phần khơng xác định rỉ đường, đại mạch, …Đối với xạ khuẩn, nhiều chủng có hoạt tính amylaza cao nên nguồn cacbon thích hợp chúng tinh bột - Nguồn nitơ: nguồn nồng độ nitơ môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh Sự dư thừa ion amin nitơ chuyển hóa nhanh khác ức chế sinh tổng hợp chất kháng sinh 14 Erytromoxin, Leucomicin, Novobioxin, … Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn thường đòi hỏi có nguồn nitơ hữu vơ mơi trường nguồn nitơ hữu thích hợp hợp chất từ thực vật như: bột đậu tương, bột đậu xanh, cao ngô, … nguồn nitơ vô là: muối amon nitrat 1.1.2.4 Sự hình thành đường sinh tổng hợp chất kháng sinh: Có nhiều quan điểm chất kháng sinh, có quan điểm cho chất kháng sinh sản phẩm thải trình trao đổi chất xạ khuẩn, có quan điểm cho chất kháng sinh chất tham gia cạnh tranh xạ khuẩn môi trường sống tự nhiên Dù theo quan điểm đường sinh chất kháng sinh từ xạ khuẩn tóm tắt sau: - Chất kháng sinh tổng hợp từ chất trao đổi sơ cấp (như chất kháng sinh cloramphenicol, chất kháng sinh thuộc nhóm nucleozit) - Chất kháng sinh hình thành từ hai ba chất trao đổi bậc khác (như chất kháng sinh lincomicin, novobiocin) - Chất kháng sinh tổng hợp cách polyme hóa chất trao đổi bậc 1, sau tiếp tục biến đổi qua phản ứng enzym khác Có thể phân biệt thành dạng: + Chất kháng sinh nhóm polypeptit theo đường trùng hợp acid amin: bacitracin, polymycin + Chất kháng sinh tạo thành nhờ phản ứng polyme hóa đơn vị acetat, propionat: chất kháng sinh nhóm macrolit, tetracilin, rifamicin + Chất kháng sinh aminoglycozit tạo thành nhờ phản ứng trùng hợp polysacarit: neomicin, streptomycin + Chất kháng sinh hình thành theo đường tổng hợp hợp chất izopreonit từ đơn vị acetat… 1.1.2.5 Cơ chế tác động chất kháng sinh: 1.1.2.5.1 Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn: 15