KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI THUỘC CHI ASPERGILLUS VÀ PENICILLIUM TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Võ Thị Bích Viên KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI THUỘC CHI ASPERGILLUS VÀ PENICILLIUM TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ TP HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Chuyên ngành : Vi Sinh Vật Mã số: 60 42 40 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THANH THUỶ Thành phố Hồ Chí Minh - 2009 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thanh Thủy hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Sở Giáo dục đào tạo tỉnh Khánh Hồ, Trường THPT Ngơ Gia Tự - Khánh Hồ giúp đỡ, động viên tơi suốt thời gian học Tôi xin chân thành cám ơn Thầy Cô môn Vi sinh, quý Thầy Cô khoa Sinh học, tồn thể q Thầy Cơ tận tình giảng dạy suốt khố học Tơi xin chân thành cám ơn phòng KHCN – SĐH Trường ĐH Sư phạm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt khóa học Tơi xin chân thành cám ơn người thân gia đình, bạn bè động viên tạo điều kiện thuân lợi cho suốt thời gian qua Cuối cùng, xin gởi lời cám ơn đến bạn khố, học viên SĐH Khóa 18 chun ngành Vi sinh vật tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2009 Võ Thị Bích Viên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BT Bào tử BTT Bào tử trần CMC Carboxyl methyl cellulose CN Công nghiệp ĐK Đối kháng ĐV Động vật HST Hệ sinh thái KL Khuẩn lạc KS Kháng sinh MT Môi trường NXB Nhà xuất RNM Rừng ngập mặn SV Sinh vật TV Thực vật VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định MỞ ĐẦU Nấm sợi hay gọi nấm mốc, phát triển nhanh nhiều nguồn chất hữu gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm Trong tự nhiên, nấm sợi phân bố rộng rải tham gia tích cực vào vịng tuần hồn vật chất, q trình phân giải chất hữu hình thành chất mùn Ngồi ra, có nhiều loài nấm sợi sử dụng rộng rải CN chế biến thực phẩm (làm tương, nước chấm…), CN enzim (sản xuất amilaza, proteaza, cellulaza…), CN dược phẩm (sản xuất KS, steroid…), sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng TV, sản xuất sinh khối nấm sợi để phục vụ chăn nuôi dinh dưỡng cho người (mycoprotein), dùng nấm sợi để xử lý nhiễm MT [4] Bên cạnh cịn có nhiều loài nấm sợi ký sinh người, ĐV, TV gây nhiều bệnh nguy hiểm Nhiều nấm sợi sinh độc tố nấm gây bệnh ung thư nhiều bệnh khác Nấm mốc phát triển, sinh axít làm mờ vật liệu vơ (thấu kính ống nhịm, kính hiển vi số dụng cụ quang học khác) Để tận dụng tối đa nguồn lợi to lớn từ nấm sợi đồng thời hạn chế tác hại nấm sợi gây ra, người tập trung nghiên cứu vấn đề liên quan đến nấm sợi Trước đây, nhà nghiên cứu thường tập trung tìm hiểu nấm sợi phân bố đất liền Những năm gần đây, người nhận thấy hết tầm quan trọng hệ sinh thái RNM - HST có suất sinh học cao HST Với điều kiện sinh thái RNM người nghiên cứu khả chịu đựng phục hồi tổ hợp gen Có thể tìm chủng nấm sợi có hệ gen bền vững mang nhiều đặc tính có lợi cho người Nhiều lồi thuộc chi Aspergillus Penicillium phân bố rộng rải nhiều loại chất tự nhiên, phổ biến khắp nơi trái đất Theo E Kister, M Morelet (2000) ước tính số lượng lồi biết chi Penicillium khoảng 233 loài, chi Aspergillus khoảng 185 loài.[52] Sự phong phú đa dạng thành phần loài chúng mang lại lợi ích sinh thái kinh tế vơ to lớn Bên cạnh tác hại khơng nhỏ, với khó khăn công tác phân loại, hệ thống hai chi nấm Trong hệ sinh thái RNM Cần Giờ hai chi Aspergillus Penicillium có vai trị quan trọng, tham gia vào phân huỷ nhanh xác TV, ĐV, góp phần khép kín chu trình vật chất nhờ có khả sinh enzim cellulaza, proteaza, amilaza, kitinaza để phân giải hợp chất hữu MT Ngoài ra, nấm sợi cịn có khả phân giải hợp chất hydrocacbon giúp bảo vệ MT, nấm sợi cịn có khả sinh KS Trên giới, cơng trình nghiên cứu phân loại, ứng dụng chi Aspergillus Penicillium nhiều tập trung đất liền Rất có nghiên cứu hai chi biển hay RNM Cho đến nay, chưa có cơng trình khoa học thức có hệ thống VSV, đặc biệt khu hệ nấm sợi RNM Việt Nam nói chung, RNM Cần Giờ nói riêng Để góp phần nâng cao hiểu biết giá trị tài nguyên sinh học từ RNM, đặc biệt khu hệ nấm sợi tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát đặc điểm sinh học số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh” Mục tiêu đề tài nhằm tìm hiểu tính đa dạng vai trò số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium RNM Cần Giờ Tp Hồ Chí Minh Nhiệm vụ đề tài + Phân lập chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium RNM Cần Giờ + Khảo sát số đặc điểm sinh học chủng nấm sợi phân lập + Từ chủng phân lập tuyển chọn chủng có đặc điểm bật Bước đầu nhận xét sơ đặc điểm sinh học chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium Đề tài tiến hành từ tháng năm 2008 đến tháng năm 2009 phịng thí nghiệm Sinh hố – Vi sinh, khoa Sinh, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Rừng ngập mặn Cần Giờ Rừng ngập mặn (RNM) HST quan trọng hệ thống đất ngập nước RNM HST đặc biệt với điều kiện sinh thái đặc trưng khí hậu nóng, đất mặn ngập nước quanh năm, có thuỷ triều lên xuống, thường xuyên thiếu khí oxy ngập nước, đất chưa ổn định Với MT đó, quần hợp TV khơng họ hàng với có đặc tính sinh lý giống nhau, thích nghi sinh thái giống tạo nên kiểu rừng gọi RNM Ở miền Nam, Việt Nam RNM gọi Rừng sát, tiếng Anh gọi Mangrove Danh từ Mangrove thông dụng giới Trên giới, RNM thường gặp vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Ở Việt Nam, RNM bao phủ diện tích khoảng 400,000 vào năm 1943 (Maurand, 1943) Tuy nhiên, nhiều nguyên nhân khác chiến tranh, chuyển đổi mục đích sử dụng, đốn củi, làm cho diện tích RNM ngày thu hẹp Hơn 60 năm qua, 80% diện tích RNM bị tàn phá suy giảm chất lượng (worldbank, 2003) Đặc biệt năm 1995 trở lại đây, RNM bị thu hẹp cách nhanh chóng nguyên nhân người phá RNM để nuôi tôm.[10] Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ hình thành hạ lưu sơng Đồng Nai – Sài Gịn nằm cửa ngõ Đơng Nam Thành phố Hồ Chí Minh: RNM Cần Giờ giới hạn đoạn sơng, rạch, tắc: sơng Sồi Rạp, sơng Vàm Sát- rạch Đơn- tắc An Nghĩa- sơng Lịng tàu, tắc Rổi- sông Đồng Tranh- tắc Nước Hội- sông Thị Vải- sơng Gị Gia- sơng Cái Mép biển Đông, từ bắc xuống Nam dài 28km, từ Đông sang Tây dài 30km Thổ nhưỡng phát triển đầm mặn mới, phù sa sơng Sài Gịn sơng Đồng Nai mang đến lắng đọng tạo thành đất Đất Cần Giờ cấu tạo trình trầm tích sét, q trình phèn hố q trình nhiễm mặn Khí hậu Cần Giờ nóng ẩm chịu chi phối qui luật gió mùa cận xích đạo với hai mùa mưa nắng rõ rệt Lượng mưa: thấp TP Hồ Chí Minh, trung bình 1300 – 1400mm/năm, mùa mưa thường tháng kết thúc vào tháng 10, lượng mưa thường tập trung vào tháng tháng [35] - Chế độ nhiệt: Biên độ nhiệt ngày từ – 70C, nhiệt độ trung bình 25,80C, nhiệt độ thấp tuyệt đối 18,80C, nhiệt độ cao tuyệt đối 350C [35] - Độ ẩm khơng khí: cao nơi khác TP Hồ Chí Minh, mùa mưa độ ẩm từ 79 – 83%, mùa khô độ ẩm từ 74 – 77%, ẩm vào tháng 9, khô vào tháng [36] - Chế độ thuỷ triều: chế độ bán nhật triều không đều, hai lần nước lớn hai lần nước ròng ngày Các tháng có đỉnh triều cực đại tháng 10 tháng 11, đỉnh triều thấp tháng tháng [36] - Độ mặn: trung bình từ 1,5 – 2,5% , tùy theo khu vực lên đến 18% [13], lớn triều cường nhỏ triều kém, nước mặn xâm nhập sâu vào tháng bị đẩy xa vào tháng tháng 10 * Khu hệ thực vật Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ có 150 loài TV, loài chủ yếu bần trắng, mấm trắng, quần hợp đước đôi - bần trắng sú, ổi, trang, đưng v.v… loại nước lợ bần chua, quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng, v.v… Thảm cỏ biển với loài ưu Halophyla sp., Halodule sp., Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, loại đậu, dừa v.v…; vườn ăn trái [34] * Khu hệ động vật Theo khảo sát sơ dự án khả thi khu bảo tồn tự nhiên RNM Cần Giờ năm 1999, kết quả: + Khu hệ ĐV thuỷ sinh khơng xương sống cạn có lồi lưỡng thê, 31 lồi bị sát, lồi hữu nhũ Trong có 11 lồi bị sát có tên sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (gekko gekko), kỳ đà nước (varanus salvator), trăn đất (python molurus), trăn gấm (python reticulatus), rắn cạp nong (bungarus fasciatus), rắn hổ mang (naja naja), rắn hổ chúa (ophiophagus hannah), vích (chelonia mydas), cá sấu hoa cà (crocodylus porosus)… [34] + Khu hệ chim có khoảng 130 lồi thuộc 47 họ, 17 Trong có 51 lồi chim nước 79 lồi khơng phải chim nước sống nhiều sinh cảnh khác [35] Phân vùng khu dự trữ sinh Cần Giờ: Tổng diện tích Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ 75.740 ha, đó: vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, vùng chuyển tiếp 29.880 [35] * Khu hệ VSV - Vi khuẩn VK với nấm tạo nên thành phần quan trọng hệ sinh thái RNM Là SV phân huỷ, chúng đóng vai trị trung tâm mặt chức HST Số lượng VK RNM chiếm tỉ lệ cao, đặc biệt trầm tích quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước mặt, quần thể bùn lớn gấp vài lần cát [34] Nhiều loài sống giá thể bề mặt rắn chất nhầy dính bám Do đó, VK tạo nên bề mặt mỏng mặt bùn tạo điều kiện cho loài tảo, cỏ biển ngập mặn phát triển - Nấm Khu hệ nấm RNM nhiều đa dạng Phần lớn vi nấm, có số lồi có kích thước lớn Nấm đóng vai trị quan trọng RNM, với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh xác TV (Fell cộng 1975) Người ta phân loại nấm dựa môi trường RNM: tán cây, thân, rễ hơ hấp đất, có số lồi sống từ hai MT trở lên [33] Ở Ấn Độ, muời loài nấm phân lập từ RNM Pichavaram Aspergillus flavus, A ochraceus, Alternaria alternata, A tenuissima, Rhizopus nigricans, Penicillum funiculosum, P expansum, Humicola fuscoatra, Mucor racemosa Fusarium oxysporum Aspergillus Penicillium chiếm số lượng nhiều tất RNM lọai Alternaria alternata Rhizopus nigricans (Sivakumar and Kathiresan, 1990) Số nấm đếm mục RNM nhiều tươi [41] Người ta tìm thấy ngập mặn có lồi nấm ký sinh hoại sinh như: Ascomycetes, Bacidiomycetes Deuteromycetes Người ta tìm thấy chi nấm có mặt Đước đỏ (R mangle): Cladosporium, Pestalotia, Alternaria, Zygosporium, Penicillium Aureobacidium [34] Các chi nấm ký sinh hoại sinh sống ngập mặn thường gây bệnh cho chủ như: Pestalotia, Phyllosticta, Cladosporium, Nigrospora Cercospora Hầu hết lồi nấm đất liền có ngập mặn, cịn lồi nấm biển có rễ phần gỗ ngâm nước mặn Khi chết gỗ phân huỷ tạo điều kiện thuận lợi cho loại nấm phân huỷ phát triển Các mẫu gỗ để ngâm nước biển có tỉ lệ phân huỷ cao vùng ngập triều cao [34] Nấm đất RNM phân loại nấm đất loại nấm sống mảnh vụn mặt đất Cả hai loại phụ thuộc vào lượng chất hữu có bề mặt đất Một vài loài, đặc biệt Aspergillus candidus cho thấy khả tạo hợp chất phosphate tan từ chất phosphorus không tan cho SV khác sử dụng Vì vậy, nấm đóng vai trị tạo chất dinh dưỡng HST (Prabhakaran et al., 1987) [41] Đối với ngập mặn nấm SV phân huỷ đầu tiên, nhờ khả phân giải cellulose lignin Đa số loại nấm phân lập lá, gỗ thường nấm hoại sinh góp phần phân huỷ xác TV Chúng góp phần phân huỷ cỏ biển, bùn đầm lầy mặn [46] Nấm đóng vai trò quan trọng HST Cùng với VK, nấm SV phân hủy hầu hết HST Bởi vậy, nấm sợi có vai trị quan trọng chu trình sinh địa hóa nhiều lưới thức ăn Khi sống hoại sinh hay cộng sinh, chúng phân hủy vật chất hữu thành phân tử vơ cơ, sau chất đồng hóa TV hay SV khác [46] Bản thân nấm sợi RNM trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài ĐV nhỏ ấu trùng số loài (Odum, 1980; Alongi, 1989) Tuy nhiên, hoạt động sống nấm sợi RNM lại làm giảm lượng oxi đất, bùn RNM trình hô hấp, gây bệnh cho động thực vật thải vào MT số chất độc amoniac, sunfuahidrô…[13] VSV RNM ngồi VK nấm sợi cịn có nấm men, xạ khuẩn… chúng đóng vai trị quan trọng chu trình tuần hồn vật chất hệ sinh thái RNM Có vai trị bảo vệ MT sinh thái RNM nói riêng MT sinh thái nói chung, vai trò to lớn mối quan hệ sinh học lồi SV Từ đó, đóng góp vào việc giữ cân cho HST đặc biệt  Vai trò RNM kinh tế Một số lồi TV RNM xếp vào nhóm cơng dụng chủ yếu: 30 lồi cho gỗ, than, củi, 14 loài cho tannin, 24 loài làm phân xanh, 21 loài dùng làm thuốc, loài chủ thả kiến cánh đỏ, 21 loài cho mật ni ong, lồi cho nhựa để sản xuất nước giải khát [2] Ngoài ra, RNM cịn có nguồn tài ngun ĐV phong phú lồi lưỡng cư, 22 lồi bị sát, 67 lồi chim, 21 loài thú… SV nước phong phú gồm 64 lồi cá thuộc 35 họ, 25 lồi tơm, 66 lồi TV phiêu sinh, 26 loài ĐV phiêu sinh 22 loài ĐV đáy [2] Trong hệ sinh thái RNM, loài động thực vật, VSV đất MT tự nhiên liên kết với thơng qua q trình trao đổi đồng hóa lượng Các q trình nội cố định lượng, tích lũy sinh khối, phân hủy vật chất hữu chu trình dinh dưỡng chịu ảnh hưởng mạnh mẽ nhân tố bên gồm nước, thủy triều, nhiệt độ lượng mưa RNM phát triển tốt nước có nồng độ muối 15 - 25‰ [2]  Vai trò RNM MT Bên cạnh giá trị lâm sản than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc… RNM cịn đóng vai trị quan trọng việc điều hịa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi, hạn chế xói lở q trình xâm thực bờ biển RNM cung cấp chất hữu để tăng suất cho vùng ven biển, nơi sinh sản ươm ni nhiều lồi hải sản có giá trị kinh tế cao tơm, cua, cá,… Mặt khác, RNM cịn có tác dụng làm chậm dịng chảy phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao sóng triều cường Hạn chế tác hại sóng thần bão lớn, hạn chế xâm nhập mặn bảo vệ nước ngầm RNM bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối MT, làm MT nước có lũ lụt, lũ quét, sạt lở đất.[4][18] 1.2 Sơ lược nấm sợi 1.2.1 Phân loại nấm sợi Nấm phân bố toàn giới phát triển nhiều dạng MT sống khác nhau, kể sa mạc Đa phần nấm sống cạn, số lồi lại tìm thấy MT nước Nấm VK SV phân huỷ chính, có vai trị quan trọng HST cạn Dựa theo tỉ lệ số loài nấm với số loài TV MT, người ta ước tính giới Nấm có khoảng 1,5 triệu lồi [38] Theo G.C.Ainsworth (1973): Hệ thống giới nấm bao gồm hai ngành: Myxomycota Eumycota Eumycota bao gồm ngành phụ: Mastigomycotina, Deuteromycotina, Zygomycotina, Ascomycotina Basidiomycotina [49] Ngành phụ Deuteromycotina chia theo lớp: [50] + Khuẩn ty không phát triển phát triển yếu; dạng thể giống nấm men có nảy chồi: Blastomycetes + Khuẩn ty thật, không nảy chồi; sợi nấm bất dục sinh BT cuống, khơng có tập trung thành túi BT hay cụm cuống BT: Hyphomycetes + Khuẩn ty thật, BT tập trung túi BT cụm cuống BT: Coelomycetes Lớp Hyphomycetes chia thành bộ: Moniliales, Melanconiales Sphaeropsidales Có thể tóm tắt phần phân loại nấm sơ đồ (xem phần phụ lục 12) Theo C J Alexopoulos (2002), nấm có phần giới nấm, giới Stramenopila (một giới bao gồm SV có cấu trúc lơng roi tách từ protista) giới Protista Giới nấm có ngành: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota Phần nấm giới Stramenopila có ngành: Oomycota, Hyphochytriomycota, Labryrinthulomycota Bốn ngành khác nấm xem SV nguyên sinh giới protista: Plasmodiomycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota, Myxomycota Lý phân chia từ chứng nghiên cứu rRNA hoá sinh học Các chứng chứng minh tồn nhóm nấm khác Gần đây, sau hệ thống phân loại giới xuất hiện, giới nấm tái cấu trúc xếp lại Tất phần giới khác tập hợp lại giới nấm Các nhà nấm học phân chia giới thành hai phần: nấm giả, bao gồm ngành: Oomycota, Hyphochytridiomycota, Labyrinthulomycota, Plasmodiophoromycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota Myxomycota nấm thật phần cịn lại [49] 1.2.2 Hình thái cấu tạo chung nấm sợi Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bên chứa chất ngun sinh chuyển động Có đường kính 1-30µm (thơng thường 5-10 µm) Đỉnh sợi nấm có hình chóp nón khơng tăng trưởng, có tác dụng bảo vệ phần sợi nấm Phần chất nguyên sinh khơng có nhân chứa quan tử Tiếp đến phần tăng trưởng chứa nhiều nhân, nhiều quan tử nhiều enzim Đây phần định tăng trưởng phân nhánh sợi nấm Dưới phần thành cứng - phần thành thục sợi nấm Bắt đầu từ phần trở xuống chấm dứt tăng trưởng sợi nấm (xem hình 1a) [4] [50] Nhân tế bào bao bọc màng nhân, màng nhân có nhiều lỗ nhỏ, nhân có hạch nhân (nucleolus) Trong tế bào nấm cịn có ty thể (mitochondrion), mạng nội chất (endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), ribosome, bào nang (vesicle) , thể golgi [4], giọt lipid (lipid droplet), tinh thể (chrystal) vi thể đường kính 0,5-1,5 nm (microbody), thể vơrơnin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể Chitơ đường kính 40- 70nm(chitosome)… Ngồi tế bào chất cịn có vi quản rỗng ruột, đường kính 25nm (microtubule), vi sợi đường kính 5-8nm (microfilament), thể màng biên (plasmalemmasome) (xem hình 1b) [50] Khơng bào Nhân Vách tế bào Màng tế bào Thể golgi Ti thể Luới nội chất (a) Cấu tạo phần sợi nấm [51] Nhân (b) Cấu trúc sợi nấm [51] Hình 1.1: Cấu tạo phần cấu trúc sợi nấm Ribosome nấm thuộc loại 80S (S đơn vị hệ số lắng Svedberg) có đường kính khoảng 20-25nm, gồm tiểu phần: tiểu phần lớn 60S tiểu phần nhỏ 40S [51] Phần lớn sợi nấm có dạng suốt, số nấm có sợi mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ Sắc tố số nấm tiết ngồi MT làm đổi màu khu vực có nấm phát triển Một số nấm tiết chất hữu tạo nên tinh thể bề mặt KL Vì BT nấm thường có màu nên KL thường có màu Các nấm bậc thấp thường có sợi nấm khơng vách ngăn Ngược lại, nấm bậc cao thường mang sợi nấm có vách ngăn (xem hình 2) Sợi nấm khơng vách ngăn mang nhiều nhân gọi đơn bào Ở nấm khơng vách ngăn vách ngăn hình thành thể sinh sản, phận bị thương tổn sợi nấm hình thành vách ngăn Đó loại vách ngăn liền, khơng có lỗ thủng, có tác dụng bảo vệ thể [5] Sợi nấm có vách ngăn thể đa bào Mỗi tế bào có nhân nhiều nhân Tuy nhiên, sợi nấm nhiều tế bào hợp thành mà vách ngăn tách sợi nấm thành nhiều tế bào Hình 1.2: Sợi nấm có vách ngăn sợi nấm khơng có vách ngăn Vách ngăn ngang hình thành từ thành tế bào Lúc đầu gờ nhỏ hình khuyên tiến dần vào lấp kín lại Tuy nhiên, vách ngăn thường có hay nhiều lỗ thủng Các lỗ có kích thước hay có lỗ lớn nhiều lỗ nhỏ xung quanh Ngồi đặc điểm chung nấm sợi RNM cịn có đặc trưng riêng đáng quan tâm cần có nhiều cơng trình nghiên cứu đối tượng lý sau: Ở MT sống khắc nghiệt, kiểu trao đổi chất chúng khác biệt so với nấm đất liền Do đó, sản phẩm trao đổi chất, đặc biệt chất KS mang tính chất khác lạ [14] Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả thích nghi nấm sợi RNM Do đó, phần lớn nấm sợi RNM có khả sinh hợp chất có hoạt tính sinh học nhằm giúp chúng thích ứng với điều kiện sống Điển hình khả sinh nhiều loại enzim, ezim ngoại bào có chức phân giải xác động thực vật thành phần hữu RNM, chất KS độc tố giúp làm tăng khả ĐK nấm sợi trình cạnh tranh MT sống Gần đây, người ta phát nấm biển nấm sợi RNM nguồn VSV có tiềm sinh chất KS mới, chống lại VSV nhờn thuốc Sống MT biến động, MT chịu ảnh hưởng chất thải từ đất liền, ô nhiễm tràn dầu…đã tạo cho nấm sợi RNM có chế phản ứng lại với tác động này, khả phân giải chất thải độc hại nhờ sinh tổng hợp hệ enzim phân giải RNM HST chịu nhiều tác động gió bão Sau tác động trên, vấn đề ô nhiễm điều tránh khỏi, ô nhiễm VSV gây bệnh [13] Nhờ có đặc tính sinh học đáng quí khả sinh sản phẩm giúp khống chế VSV có hại Từ đó, cải thiện MT sống giúp người nâng cao khả điều trị bệnh tật Đa số nấm sợi RNM có khả chịu mặn cao Chúng sinh trưởng nồng độ muối từ 2% - 20% Thậm chí, số nấm sợi RNM cịn sinh trưởng nồng độ muối 30% [13] Đây đặc điểm có ý nghĩa sinh thái RNM Nấm sợi RNM có đặc tính sinh học đáng quí cần khai thác nhằm phục vụ nhu cầu lợi ích người Tuy nhiên, nghiên cứu nấm sợi RNM khiêm tốn, chưa tương xứng với qui mơ tiềm chúng, 1.2.4 Tình hình nghiên cứu nấm sợi RNM giới Việt Nam Hiện nay, có khoảng 800 – 1000 lồi nấm biển định loại (Hawkswworth et al., 1995; Jones, 1995), có số lượng lớn lồi nấm đất liền phân loại Sự hiểu biết lồi người nấm RNM vai trị chúng khu HST cịn q chưa đầy đủ (Agate A.D., Subramania, C.V Anuci, V.1998) Sự nghiên cứu nấm RNM nhà nấm học quan tâm từ năm 1950 Theo sở liệu (chưa đầy đủ) mạng nấm RNM tồn cầu thấy nhiều nước tích cực nghiên cứu phân loại hệ thống hố lồi nấm biển có mặt vùng RNM họ Cụ thể: Ấn Độ phân loại 170 lồi, Hồng Kơng: 170 lồi, Đài Loan: lồi, Trung Quốc: loài, Singapore: 116 loài, Nhật: 26 loài, Úc: 67 loài, Mỹ: 18 loài, Malaysia: 164 loài, Indonesia: loài, Thái Lan: 83 loài, Brasil: 48 loài, Mexico: 94 lồi, Kuwait: 14 lồi, Đức: lồi Qua đó, thấy phân loại nấm biển RNM cịn chưa đáp ứng đủ yêu cầu cấp bách cho tiến ngành VSV học [51] Năm 1988, Agate A.D., Subramania C.V Vanuci M., nêu tám lĩnh vực nghiên cứu cấp bách VSV học RNM cần nhà khoa học giải Trong đó, có lĩnh vực phân loại hệ thống hố loài VSV RNM giới Năm 1979, Kohlmeyer người đánh giá vai trò quan trọng nấm chu trình tuần hồn vật chất hệ sinh thái RNM Đã nhận dạng 43 loài nấm bậc cao, bao gồm 23 loài Ascomycetes, 17 loài Deuteromycetes loài Basidiomycetes Năm 1990, Hyde liệt kê 120 loài nấm RNM tồn giới Trong đó, bao gồm 87 loài Ascomycetes, 31 loài Deuteromycetes loài Basidiomycetes Những nghiên cứu gần phát số lượng lớn lồi mới, chí chi Bộ sưu tập nấm RNM Macau Hồng Kơng tìm 45 loài mới, 28 loài số tìm Macau 21 lồi tìm thấy Hồng Kông (Vrijmoed et al., 1994) Năm 1990, Sivakumar Kathiresan phân lập 10 loài nấm từ bề mặt loài ngập mặn Trong số đó, lồi chiếm ưu bề mặt loài Alternaria alternate, Rhizopus nigricans, Aspergillus spp.[41] Một số nấm sợi cịn có hoạt tính diệt trùng mạnh, sử dụng để sản xuất chế phẩm diệt trùng cách an tồn Đây nguồn gen q, có giá trị sinh học y học (theo Mai Thị Hằng cộng sự) [11] Theo nghiên cứu Khưu Phương Yến Anh (2007) phân lập, tuyển chọn chủng nấm sợi có hoạt tính cellulaza cao, có khả đường hoá giấy in, giấy báo cũ, chuyển hoá nhanh rơm rạ thành mùn làm phân bón cho trồng Với đặc tính nấm sợi góp phần phân giải xác TV RNM Cần Giờ [1] Bên cạnh đó, cơng trình nghiên cứu Phạm Thị Thanh Thuý (2007) tuyển chọn chủng nấm sợi có khả phân giải dầu, góp phần làm phong phú thêm nhóm VSV phân giải dầu, xử lý ô nhiễm MT dầu ngày nay.[30] Nấm sợi RNM có vai trị lớn việc làm MT sống với việc phân giải chất độc hại MT dầu mỏ, chất hóa học có cấu trúc mạch vịng [13] Bên cạnh vai trị làm MT sống nói chung, nấm sợi RNM cịn có vai trị làm MT sinh vật với chức tác nhân kiểm soát sinh học hữu hiệu việc giữ cân sinh thái Ngoài ra, nghiên cứu Phan Thanh Phương (2007) tuyển chọn chủng có hoạt tính ĐK với VSV gây bệnh, hoạt tính phân giải phốt phát khó tan, lại thêm hoạt tính chịu mặn Điều này, có ý nghĩa quan trọng chu trình photpho RNM Cần Giờ [27] 1.3 Đặc điểm Aspergillus 1.3.1 Vị trí phân loại chi Aspergillus hệ thống phân loại nấm - Năm 1729 P A Micheli lần mô tả chi Aspergillus (Maren A Klich, 2002) - Năm 1900, Lindau lại xếp Aspergillus vào trật tự: Lớp (Class) : Fungi imperfect Bộ (Order): Hyphomycetes Họ (Family): Mucedinaceae Họ phụ (Subfamily): Aspergillaceae Chi (Genus): Aspergillus - Năm 1950, Bessey xếp Aspergillus vào hai lớp khác nhau: Lớp (Class): Ascomycetes Lớp (Class): Ascomycetes Bộ (Order): Aspergillaces Bộ (Order): Moniliales (Hyphomycetes) Họ (Family): Aspergillaceae Họ (Family): Moniliaceae Chi (Genus): Eurotium Chi (Genus): Aspergillus - Năm 1962, Alexopoulos “Introductory Mycology” xếp Aspergillus vào hai lớp: Ascomycetes (khi người ta tìm thấy hình thức sinh sản nó) vào Form class: Deuteromycetes (ở trường hợp ngược lại) Lớp (Class) : Ascomycetes Lớp (Class) : Deuteromycetes Dưới lớp (Subclass) : Euroascomycetidae Bộ (Order) : Moniliales (series: Plectomycetes ) Họ (Family) : Moniliaceae Bộ (Order): Eurotiales Chi (Genus) : Aspergillus Họ (Family) : Eurotiaceae Chi (Genus) : Eurotium, Sartorya, Emerycella (hình thức vơ tính Aspergillus ) - Năm 1973, Ainsworth xếp Aspergillus thuộc tổ chi Phialoconidiae lớp Hyphomycetes, ngành phụ nấm bất toàn Deuteromycotina [51] - Năm 1977, Bùi Xuân Đồng vào đặc điểm hình thái phát sinh BTT Deuteromycota xếp chi Aspergillus vào tổ chi Phialocolidiae, lớp phụ Euhiphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Nấm bất toàn (Deuteromycotina) (Bùi Xuân Đồng, 2001 ) - Năm 2000, Robert K Noyd, lại xếp Aspergillus thuộc họ Monilaceae, Moniliales, lớp Hyphomycetes, ngành Deuteromycota [50] 1.3.2 Hình thái Aspegillus Chi Aspergillus Micheli ex Fries đặc trưng đặc điểm sau: Hệ sợi nấm gồm sợi vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt trở thành nâu hay màu sẫm khác vùng định KL Sinh sản vơ tính BTT (conidia) Hình thái quan sinh BTT đặc điểm chủ yếu đặc trưng dùng phân loại chi Đặc điểm quan sinh BTT: D A C B E F Hình 1.3: Hệ bào tử trần chi Aspergillus A- Bọng; B- Bộ cuống đính BT đầu tiên; C- Bộ cuống đính BT thứ hai; D- Bào tử trần; E- Sợi cuống; F- Tế bào gốc ( Nguyễn Đức Lượng- Thí nghiệm VSV học) Bộ máy mang BTT phát triển từ tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày đoạn lân cận sợi nấm (tế bào chân – foot cell) Gíá BTT phát triển từ tế bào chân, nhánh sợi nấm, gần thẳng gốc với trục tế bào chân thường mặt chất (Hình1.3) Giá BTT khơng có nhánh, khơng có có vách ngang, có phần đỉnh to thành bọng hình chùy ( Hình 1.4k), hình bầu (Hình 1.4b ,d, g), hình bàn trang (phần đỉnh bọng giá thẳng-Hình 1.4a, c, e) hình nửa cầu (Hình 1.4l, m…) hình cầu (Hình 1.4q), bọng mang thể bình Các thể bình song song hợp thành cụm phần đỉnh bọng, xếp thành hình tia sát tồn bề mặt bọng [6] a d l h b c o e i g k m n p q Hình 1.4: Bọng đỉnh giá mang thể bình mang cuống thể bình thể bình số lồi thuộc chi Aspergillus Mich Ex Fr [6] a- A conicus Blochw; b- A clavatus Desm; c- A nidulans (Eid); d- A fumigatus Fres; e- A sersicolor (Vuill); g- A.malinus Lindt; h- A.sydowi (Bain.et Sart) Thom et Church; i- A.niveus Blochw; kA.vảaans Wehm; l- A.glaucus Link; ; m- A.citrispóu Hohn; n- A.terreus Thom; o- luchuensis Inui; p- A ustus (Bain) Thom et Church, q- A.sulphureus (Fres) Thon et Church ( M.A.Litimov 1967) Thể bình có tầng hai tầng Trong trường hợp sau, thể bình cấp (cũng gọi cuống thể bình, metula) mang cụm gồm hai ba (hoặc nhiều hơn) thể bình cấp hai (gọi thể bình) phần đỉnh Các BTT tạo thành nối tiếp miệng thể bình, thành chuỗi hướng góc (BT miệng thể bình BT non nhất, xa miệng thể bình già), không phân nhánh [6] BTT không vách ngăn, thay đổi hình dạng, kích thước, màu sắc, dấu vết mặt ngồi (nhẵn, có gai, có nốt sần) tuỳ loài Tất chuỗi BTT tạo thành từ thể bình bọng đỉnh giá hợp thành khối BTT đỉnh bọng – nấm (conidial head) Khối BTT đỉnh bọng có dạng hình cột (các chuỗi BTT song song, sát nhau), hình cầu hình tia toả trịn Một số lồi có BT túi (ascosporum) thể kín (cleitothecium) [6] 1.3.3 Các chất có hoạt tính sinh học Aspegillus Nhiều lồi thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rải chất tự nhiên, sản phẩm công nông nghệp, nhiều vùng địa lý khác giới Một số loài, đặc biệt A oryzae dùng rộng rãi công nghệ lên men truyền thống để chế biến thực phẩm nhiều nước châu Á Việt Nam (làm tương), Trung Quốc, Nhật Bản, Indonexia, Philipin… Hiện nay, công nghệ sinh học sử dụng số loài thuộc chi Aspergillus chủ yếu loài A niger, A oryzae CN sản xuất enzym (amylaza, glucoamylaza, pectinaza, proteaza, cellulaza), CN chế biến thực phẩm, CN sản xuất acid hữu acid citric, acid gluconic [6] Nhiều lồi thuộc chi nấm có hoạt tính biến đổi sinh học, số lồi tạo thành độc tố (mycotoxin), đặc biệt đáng ý loài tạo thành độc tố gây ung thư gan loài A flavus, A parasiticus tạo thành aflatoxin, A versicolor tạo thành sterigmatocystin [6] Ở Việt Nam, số chế phẩm enzim chế phẩm glucoamylaza từ A awamori, từ A niger Nghiên cứu chọn lọc chủng thuộc loài A awamori, A niger, A oryzae có hoạt tính amylaza glucoamylaza để phân giải tinh bột sắn Nghiên cứu thu nhận sử dụng proteaza từ A oryzae sản xuất nước chấm, để khử lông da súc vật Thu nhận sử dụng pectinaza, amylaza từ A niger để xử lý dược liệu nguồn gốc từ TV Nghiên cứu sử dụng số chủng thuộc loài A niger để nâng cao chất lượng thức ăn chăn nuôi Nghiên cứu khả sinh tổng