khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn streptomyces dicklowii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Hoàng Minh Huy KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii. CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẨN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ THANH Tp. HCM, 2006 LỜI CÁM ƠN Trên hết, tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ TRẦN THỊ THANH, người đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài; với tất cả tinh thần tình thương và trách nhiệm cô đã giúp tôi hoàn thành luận văn, bên cạnh đó tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức quí báu nơi cô cũng như phương pháp nghiên cứu khoa học. Tôi chân thành cám ơn thầy cô ở khoa sinh, khoa hóa - trường đạ i học sư phạm tp HCM, thầy cô ở bộ môn sinh hóa - trường đại học khoa học tự nhiên, đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài luận văn cũng như thầy cô công tác tại phòng thí nghiệm vi sinh - sinh hóa, phòng thí nghiệm sinh lý thực - trường đại học sư phạm tp HCM đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian làm đề tài. Tp HCM, tháng 3 năm 2006 NGUYỄN HOÀNG MINH HUY MỤC LỤC Trang Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 1.1.1. Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn: 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái. 1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn. 1.1.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn: 1.1.2.1. Khái niệm về chất kháng sinh. 1.1.2.2. Những nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta về kháng sinh. 1.1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. 1.1.2.4. Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh. 1.1.2.5. Cơ chế tác động của chất kháng sinh. 1.1.3. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh. 1.1.3.1. Tách chiết kháng sinh từ sinh khối. 1.1.3.2. Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc. 1.1.3.3. Tinh sạch chất kháng sinh. 1.2. Các nhóm chất kháng sinh chính có nguồn gốc từ xạ khuẩn: 1.2.1. Phân lo ại các chất kháng sinh từ xạ khuẩn. 1.2.2. Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn. 1.3. Vai trò của xạ khuẩn và chất kháng sinh trong phòng chống nấm bệnh và tuyến trùng hại cây trồng: 1.3.1. Thực trạng về bệnh hại cây trồng. 1.3.2. Vai trò của xạ khuẩn, chất kháng sinh trong phòng chống bệnh và tuyến trùng hại cây trồng. Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. 2.1. Vật liệ u: 2.2. Phương pháp: 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật. 2.2.1.1. Phương pháp làm phòng ẩm quan sát hình thái vi thể của xạ khuẩn. 2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh – phương pháp khuếch tán trên thạch. 2.2.1.3. Phương pháp xác định sinh khối vi sinh vật. 2.2.2. Phương pháp hóa sinh. 2.2.2.1. Phương pháp xác định khả năng phân giải các hợp chất cao phân tử của xạ khuẩn. 2.2.2.2. Phương pháp xác định khả năng sinh chất kích 3 3 3 3 6 10 10 11 13 15 16 19 21 21 22 22 22 30 31 31 40 47 52 52 52 53 53 54 54 thích sinh trưởng thực vật. 2.2.3. Phương pháp hóa lý. 2.2.3.1. Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh. 2.2.3.2. Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh. 2.2.3.3. Phương pháp xác định các nhóm chức trong cấu trúc hóa học của chất kháng sinh. 2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng hoà tan trong các dung môi của chất kháng sinh. 2.2.4. Phương pháp khác. 2.2.4.1. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng từ rể bị nhiễm bệ nh. 2.2.4.2. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng ra khỏi đất. 2.2.4.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên khả năng nảy mầm của hạt. 2.2.4.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên sự phát triển của cây con. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN. 3.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học củ a chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn. 3.1.2. Đặc điểm sinh trưởng phát triển trên các môi trường nuôi cấy khác nhau. 3.1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn. 3.2. Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.2.1. Thử họat tính kháng sinh. 3.2.2. Lựa chọn môi trường thích hợp cho việc tạo kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.3. Nghiên cứ u các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.3.1. Ảnh hưởng pH ban đầu: 3.3.2. Ảnh hưởng chế độ thông khí: 3.3.3. Xác định thời gian sinh kháng sinh tối ưu: 3.3.4. Ảnh hưởng nguồn hydratcacbon: 3.3.5. Ảnh hưởng nguồn nitơ: 3.4. Tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.4.1. Lựa chọn dung môi thích hợ p. 3.4.2. Tách chiết và tinh sạch kháng sinh: 3.4.3. Tìm hiểu tính chất của chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 55 57 57 57 60 61 61 61 62 62 62 63 63 64 66 72 72 73 76 76 78 80 83 85 89 89 92 95 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii lên các tác nhân gây hại cây trồng. 3.5.1. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên nấm bệnh hại cây trồng: 3.5.2. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên tuyến trùng hại cây trồng. 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii đến hoạt động sinh lý củ a cây trồng. 3.6.1. Ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên khả năng nảy mầm của hạt: 3.6.2. Ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên sự phát triển của cây con: Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 98 98 101 107 107 108 111 1 Ở ĐẦU Thiệt hại kinh tế của bệnh cây là điều thấy rất rõ: làm giảm năng suất cây trồng, giảm phẩm chất nông sản khi thu hoạch và bảo quản, ảnh hưởng xấu đến đất trồng và cơ cấu cây trồng. Từ thế kỷ 18 Anton De Bary đã đặt nền móng môn khoa học bệnh cây (1853). Để khắc phục những thiệt hại do bệnh cây gây ra, người ta đã sử dụng nhi ều biện pháp như: kỹ thuật canh tác, thuốc hóa học, … trong đó sử dụng thuốc hóa học để phòng ngừa và ngăn chặn bệnh hại cây trồng là được nhiều người ưa chuộng do tính dễ sử dụng, hiệu quả cao nếu kết hợp với biện pháp canh tác thì việc phòng bệnh cho cây đạt hiệu quả lớn. Tuy nhiên, sau thời gian dài sử dụng thuốc hóa học cũng như phân hóa họ c người ta đã nhận thấy chúng ảnh hưởng đến môi trường sống rất lớn. Chúng tác động xấu đến cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm môi trường đất, nước làm cho người và gia súc bị ngộ độc. Đáng ngại hơn, một số thuốc trừ sâu chậm phân hủy đã lưu tồn lâu trong đất (DDT lưu tồn được 25 năm) sự lưu tồn lâu trong đất của các chất hoá học này làm nồng độ của chúng tăng dần theo thời gian. Đồng thời việc sử dụng tuỳ tiện liều lượng, thời gian phun thuốc hóa học đã tạo nên dư lượng lớn không cho phép trong rau màu và lương thực, gây nên những vụ ngộ độc thực phẩm lớn mà con người mà chúng ta từng biết trong thời gian qua. Để khắc phục nhược điểm này của thuốc hóa học cũng như bảo vệ môi sinh, người ta đã tìm kiếm các biện pháp và phát hiện vai trò của vi sinh vật trong việc điều chỉnh cân bằng sinh học của hệ sinh thái. Bằng các biện pháp khống chế sinh học, người ta đã từng bước sản xuất ra nhiều chế phẩm vi sinh vật ở qui mô lớn và được sử dụng trong công tác phòng trừ sâu bệnh. Càng ngày người ta càng sử dụng rộng rãi những chế phẩm kháng sinh từ các chủng xạ khuẩ n đối kháng, mà đặc tính của những chất kháng sinh 2 đó đã thoả mãn được những tính chất cần thiết để có thể sử dụng trong bảo vệ thực vật, như: - Không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây. Ở một số nồng độ thích hợp chúng còn kích thích khả năng nảy mầm của hạt và sinh trưởng của cây. - Không gây hại cho người và gia súc. - Có hiệu lực trong một thời gian nhất định ở ngoài môi trường tự nhiên. - Có tác dụng tiêu diệt một cách có chọn lọc vi khuẩn gram dương, hoặc vi khuẩn gram âm, kháng nấm mạnh. Dicklow.M.B cùng cộng sự vào năm 1996 đã công bố patent số 5549889 về loài Streptomyces dicklowii , loài có khả năng kháng nấm và tuyến trùng hại cây trồng, rất thích hợp sử dụng làm vi sinh vật khống chế sinh học trong nông nghiệp. Chúng tôi nhận được chủng Streptomyces dicklowii từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm Tp Hồ Chí Minh, chủng xạ khuẩn này được nhập từ Mỹ. Để tiến tới sử dụng có hiệu quả chủng xạ khuẩn này trong điều kiện môi trường Vi ệt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii” 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 1.1.1. Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn: 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái: Xạ khuẩn sống rất phổ biến trong tự nhiên cũng như trong đất, chúng có nhiều đặc điểm giống vi khuẩn và khác với nấm mốc như kích thước tế bào nhỏ, thành tế bào không chứa cenllulose hay kitin, phân chia tế bào theo kiểu vô ti (Amytoz), không phân biệt giới tính; tuy nhiên, xạ khuẩn cũng có những đặc điểm giống nấm mốc hơn như có hệ sợi khuẩn ty phân nhánh, nhưng ở xạ khuẩn hệ sợi không có vách ngăn. Sự phân hoá của khuẩn ty khí sinh bắt đầu từ những mấu lồi xuất hiện trên bề mặt của sợi khuẩn ty sau đó mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi phát triển dài ra thành sợi, cuối cùng tạo thành hệ sợi dầy đặc. Đường kính mỗi sợi khuẩn ty là 0,5µm – 1,5µm. (R.E. Buchanan, 1998). Khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bên ngoài không khí trên bề mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn dạng hình tròn do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm (xem hình 1.1), khác với khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc và vi khuẩn, khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt có mấu lồi, có nếp nhăn hoặc sần sùi. Theo Procofieva Bengopxkaia (1936), cho rằng khuẩn lạc của xạ khuẩn có 3 lớp: lớp ngoài gồm các sợi bện chặt lạ i với nhau, lớp trong tương đối xốp hơn, và lớp giữa thì có cấu trúc tổ ong. Khuẩn lạc của xạ khuẩn có thể mang các màu sắc khác nhau như: màu đỏ, màu lam, màu xám, màu tím. 4 Hình 1.1: Các dạng khuẩn lạc của xạ khuẩn Các khuẩn ty mọc phía dưới khuẩn lạc và cắm sâu vào trong môi trường là khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty cơ chất có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng để cung cấp dinh dưỡng cho toàn bộ cơ thể nên còn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng. Đường kính khuẩn ty cơ chất thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty không có vách ngăn và không bị đứt đoạn. Tuỳ loạ i môi trường mà khuẩn ty cơ chất có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố trong đó có sắc tố hòa tan được trong nước có sắc tố hòa tan được trong dung môi hữu cơ. Sau thời gian phát triển, trên đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên những sợi phân hóa gọi là cuống sinh bào tử; tuỳ theo từng loài mà cuống sinh bào tử có thể thẳng hay uốn cong, xoắn lò so hay xoắn ốc; chúng có thể mọc đơn, mọc đối, mọ c vòng, mọc thành chùm, số vòng xoắn của cuống sinh 5 bào tử có thể từ 5 – 10 vòng, đường kính vòng xoắn có thể thay đổi từ 5 – 7nm. (xem hình 1.2) Hình 1.2: Các dạng cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn Bào tử của xạ khuẩn được hình thành từ cuống sinh bào tử, thường có hình cầu, hình ovan, hình que … bề mặt bào tử có các dạng như: dạng nhẵn (hình 1.4), dạng xù xì, dạng gai (hình 1.3), dạng tóc. [...]... Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh: Có nhiều quan điểm về chất kháng sinh, có quan điểm cho rằng chất kháng sinh là sản phẩm thải của quá trình trao đổi chất của xạ khuẩn, cũng có quan điểm cho rằng chất kháng sinh là chất tham gia cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trường sống tự nhiên Dù theo quan điểm nào đi nữa thì các con đường sinh ra chất kháng sinh từ xạ khuẩn được tóm... 1.1.1.2.3 Khả năng sinh vitamin của xạ khuẩn: - Vitamin B12: Cũng như vi khuẩn, xạ khuẩn có khả năng tổng hợp tốt vitamin B12, là loại vitamin mà ở động vật và thực vật không có khả năng tổng hợp Nên trong công nghệ tổng hợp vitamin B12 thì con đường sản xuất chủ yếu là con đường sinh học mà xạ khuẩn và vi khuẩn là hai loài vi sinh vật người ta quan tâm nhất – các loài xạ khuẩn đó là: Actinomyces olivaceus,... rộng rãi trong tự nhiên, trong môi trường đất - xạ khuẩn chiếm 20 – 40% tổng số vi sinh vật trong đất, tập trung nhiều ở lớp đất 6 trên bề mặt (sâu xuống khoảng 40cm) Hầu như trong các loại đất đều có mặt của xạ khuẩn, đa số xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số xạ khuẩn ưa nhiệt Xạ khuẩn thường sống tốt trong môi trường có pH trung tính Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng nên nguồn hydratcacbon... kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn: Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn phải kể sớm nhất là chất kháng sinh Nistatin được thu nhận từ dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces noursei (do Hansen và Brown, 1942) để chữa trị bệnh nấm cho người; về sau người ta đã thu nhận được nhiều chất kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật phần lớn từ môi trường nuôi cấy xạ khuẩn thuộc chủng Streptomyces; các kháng sinh...Hình 1.3: Bào tử dạng gai ở Streptomyces africanus chủng CPJVR-HT (hình chụp dưới kính hiển vi điện tử theo ijs.sgmjournals.org/ / medium/frontcover.gif ) Hình 1.4: Bào tử dạng nhẵn ở Streptomyces violazeoruber (hình chụp dưới kính hiển vi điện tử theo www.ncl.ac.uk/biol/ assets/MSc-IB.jpg ) 1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn: 1.1.1.2.1 Đặc điểm sinh lý nuôi cấy: Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong... Actinomyces autibioticus, …Đáng kể nhất là xạ khuẩn Actinomyces olivaceus và loài vi khuẩn Propionibacterium shermanii là những chủng vi sinh vật được sử dụng trong công nghiệp sản xuất vitamin B12 - Caroten (tiền vitamin A): khi vào cơ thể người và động vật sẽ chuyển thành vitamin A Các chủng xạ khuẩn được quan tâm là: Blakeslea trispora, Mycobacterium smegmatis, Streptomyces chrestomyceticus … 8 1.1.1.2.4... phép: cô lập, tinh chế, cô đặc sản phẩm cần thu nhận Trong các phòng thí nghiệm và trong sản xuất công nghiệp, người ta sử dụng các chất hấp thụ như than hoạt tính có ưu điểm là ít tính đặc hiệu, ít nhạy cảm với pH và có diện tích tiếp xúc lớn, thường đối với xạ khuẩn người ta sử dụng 2% than hoạt tính trong dịch nuôi cấy xạ khuẩn đã loại bỏ sinh khối và pH = 7 khuấy 1 giờ và lọc qua giấy lọc Than hoạt... vách tế bào trở nên đàn hồi hơn và những vật liệu mới được chen vào Auxin có vai trò chính trong cả hai quá trình trên Trong các auxin, β – indole acetic acid (IAA) là một kích thích tố sinh trưởng thực vật được người ta quan tâm nhiều Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh IAA của xạ khuẩn: Các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp IAA có thể kể như: Streptomyces olivochromoferus 1/247... khí nên độ thông khí để đạt hiệu suất cực đại đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng khả năng sinh kháng sinh; lượng không khí cung cấp vào môi trường nuôi cấy là lưu lượng thổi khí 1 thể tích môi trường /1 phút - Nhiệt độ: có những loài xạ khuẩn ưa nhiệt hay sống tốt khi nhiệt độ của môi trường cao nhưng đa số các xạ khuẩn sinh kháng sinh mà chúng ta khảo sát thường phát triển tốt ở nhiệt độ 28OC – 30OC... kitinaza: thu nhận từ Streptomyces griseus, … Trong đó enzym proteaza của xạ khuẩn được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm – có tác dụng làm mềm thịt Các chế phẩm được bán trên thị trường như: PRONAZA của Nhật (thu nhận từ Streptomyces griseus); M – zim của Mỹ (thu nhận từ Streptomyces fradiae) (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998) 7 Ngoài ra người ta còn chú ý một loại enzym quí ở xạ khuẩn là glucoza izomeraza, . “KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ. 1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 1.1.1. Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn: 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái. 1.1.1.2. Đặc điểm