- Kasumin (Kasugamycin): (hình 1.32) C14H28ClN3O 10 là chất kháng sinh của Streptomyces kasugaensis Thuốc ở dạng tinh chế, tan trong nước Thuốc
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.
2.1. Vật liệu:
2.1.1. Các chủng vi sinh vật:
- Streptomyces dicklowii (do phịng thí nghiệm bộ mơn vi sinh trường Đại học sư phạm tp.HCM cung cấp).
- Vi sinh vật kiểm định: nhận từ trường Đại học Y tp.HCM. ● Bacillus subtilis.(hình 2.1)
● Streptococcus sp.(hình 2.1) ● Echerichia coli (hình 2.1)
Bacillus subtilis Echerichia coli Streptococcus sp.
Hình 2.1: Các vi khuẩn kiểm định
- Các chủng nấm gây bệnh cây trồng: nhận từ trung tâm nghiên cứu sản xuất hĩa chất nơng dược, thành phố HCM.
● Rhizoctonia solani. ● Fusarium oxysporum. ● Pythium sp. ● Sclerotium sp. ● Colletotrichum sp. 2.1.2. Các thiết bị: ● Máy lắc trịn – Gerhardt ● Cân điện – Sartorius. ● Máy đo pH – Hanna.
● Tủ ấm – Memmert. ● Máy ly tâm – Hettich.
● Máy cơ chân khơng – Heidolph (Germany) ● Nồi cách thủy.
2.1.3. Các mơi trường sử dụng trong đề tài: Mơi trường Gauze – 1(g/l) – MT1:
Tinh bột tan 20g K2HPO4 0,5g
MgSO4.7H2O 0,5g KNO3 1,0g
NaCl 0,5g FeSO4.7H2O 0,1g
Agar 20g H2O 1000ml
Mơi trường Gauze – 2(g/l) – MT2:
Peptone 5g Glucose 10g
Cao thịt 5g NaCl 5g
Agar 20g H2O 1000ml
Mơi trường khoai tây (g/l) – MT3:
khoai tây 300g Glucose 50g
H2O 1000ml
Cách làm : khoai tây cắt hạt lựu nấu vớinước cất sau đĩ lọc lấy dịch trong ; bổ sung nước cho đủ 1000ml.
Mơi trường Czapek – dox (g/l) – MT4:
Saccarose 30g NaNO3 3,5g
K2HPO4 1,5g MgSO4.7H2O 0,5g
KCl 0,5g FeSO4.7H2O 0,1g
Agar 20g H2O 1000ml
Peptone 5g MgSO4.7H2O 5g
Agar 20g H2O 1000ml
Mơi trường phân giải Protein – mơi trường Frazie (g/l) – MT6:
Gelatin 20g NaCl 3g
K2HPO4 1,5g KH2PO4 1,5g
Saccarose 0,05g Peptone 0,25g
Agar 20g H2O 1000ml
Mơi trường phân giải Cellulose (g/l) – MT7:
CMC 20g MgSO4.7H2O 0,5g
KCl 0,5g NaNO3 3,5g
Cao nấm men 0,1g K2HPO4 1,5g
FeSO4.7H2O 0,1g Agar 20g
H2O 1000ml
Mơi trường ISP1 (g/l) – MT8:
Trypton 5g Cao nấm men 3g
Agar 20g H2O 1000ml
Mơi trường ISP4 (g/l) – MT9:
Tinh bột tan 10g CaCO3 2g
K2HPO4 1g FeSO4.7H2O 0,001g
MgSO4.7H2O 1g NaCl 1g
(NH4)2SO4 2g ZnSO4.7H2O 0,001g
MnCl2.7H2O 0,001g Agar 20g
H2O 1000ml
Dung dịch muối cơ sở: K2HPO4 1,5g MgSO4.7H2O 1,5g NaCl 1,5g CaCO3 3g H2O 450ml Dung dịch muối vết: CuSO4 0,064g FeSO4.7H2O 0,11g MnCl2.7H2O 0,79g ZnSO4.7H2O 0,15g H2O 100ml
Cách pha lấy 0,1ml dung dịch muối vết vào 30ml dung dịch muối cơ sở, sau đĩ bổ sung nước cất cho đủ 50ml.
Mơi trường vi khuẩn kiểm định – MPA (g/l) – MT11:
Cao thịt 3g Peptone 10g
NaCl 5g Agar 20g
H2O 1000ml
Mơi trường A – 4 (g/l) – MT12:
Glucose 10g NaCl 5g
Bột đậu tương 10g CaCO3 1g
Agar 20g H2O 1000ml
Mơi trường A – 4H (g/l) – MT13:
Glucose 15g Bột đậu tương 15g
NaCl 5g CaCO3 1g
Agar 20g H2O 1000ml
Bột đậu tương 10g K2HPO4 2g
CaCO3 1g NaCl 5g
Agar 20g H2O 1000ml
Mơi trường khoai tây glucose agar – PGA (g/l) – MT15:
Khoai tây 300g Glucose 50g
Agar 20g H2O 1000ml
Nước muối sinh lý 0,8% - MT16:
H2O 1000ml NaCl 8g
Mơi trường nước chiết khoai tây – MT17:
Khoai tây 300g Glucose 50g
Nước cất 1000ml Dung dịch lugol: Iot 2,5g KI 5g H2O 1000ml Thuốc thử Salkowski: FeCl3 0,5M 15ml H2SO4 98% 300ml H2O 500ml
Mơi trường khảo sát khả năng sinh IAA: sử dụng mơi trường ISP4 bổ sung 0,1g/l L-Triptophan.
Thuốc thử Ninhydrin:
Ninhydrin 0,1g Nước cất 100ml
Thuốc thử fehling: - Dung dịch A: CuSO4 35g H2SO4đđ 6ml Thêm nước đến 1000 ml - Dung dịch B: NaOH 33% 375ml C4H4O6KNa 200g Thêm nước cất đến 1000 ml
- Pha dung dịch A và dung dịch B theo tỉ lệ 1:1
2.2. Phương pháp:
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật:
2.2.1.1. Phương pháp làm phịng ẩm quan sát hình thái vi thể của xạ khuẩn:
Đặt vào đĩa petri một miếng giấy lọc đã tẩm ẩm nước cất vơ trùng, để miếng lam vơ trùng lên đĩa petri sau đĩ đặt miếng thạch cĩ kích thước 5mm x 5mm (mơi trường MT1) cuối cùng dùng que cấy đầu trịn cấy xạ khuẩn (lấy từ ống giống thạch nghiêng) lên 4 cạnh đứng của miếng thạch, xong, đậy miếng lamen lên miếng thạch nuơi ở nhiệt độ phịng sau 2 – 3 ngày đem quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x100, thị kính x10.
2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh – phương pháp khuếch tán trên thạch:
Nguyên tắc:
Để xác định hoạt tính kháng sinh người ta dựa vào sự khuếch tán kháng sinh trong thạch. Chổ nào cĩ chất kháng sinh khuếch tán thì nơi đĩ vi khuẩn kiểm định bị ức chế bởi chất kháng sinh sẽ khơng mọc được và sẽ tạo thành vịng vơ khuẩn. Hoạt tính kháng sinh được xác định bằng hiệu số giữa
D: đường kính vịng vơ khuẩn. d: đường kính lổ đục (d = 8mm) Phương pháp:
Mơi trường MT11 sau khi hấp khử trùng để nguội khoảng 45OC cho
dịch nuơi cấy vi khuẩn kiểm định vào (với lượng 2ml giống/200ml mơi
trường) lắc đều và đổ ra đĩa petri (15ml/đĩa).
Dùng khoang lá đục lỗ thạch, xong nhỏ dịch nuơi cấy xạ khuẩn vào lổ thạch; giữ đĩa thạch ở nhiệt độ thấp 4OC trong 3 – 5 giờ, lấy ra để ở nhiệt độ phịng, sau 24 giờ, thu kết quả.
2.2.1.3. Phương pháp xác định sinh khối sinh vật:
Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov [3], sinh khối được xác định dựa vào trọng lượng khơ tuyệt đối. Lấy 100ml dịch lên men lọc qua giấy lọc sấy khơ đến trọng lượng khơng đổi, rửa sạch hệ sợi xạ khuẩn lần lượt bằng dung dịch HCl 1N và nước cất. Sấy khơ ở 80 - 100oC tới trọng lượng khơng đổi. Sinh khối được tính bằng sự chênh lệch giữa trọng lượng tờ giấy lọc cĩ sinh khối và trọng lượng tờ giấy lọc khơ đã cân trước đĩ.
2.2.2. Phương pháp hĩa sinh.
2.2.2.1. Phương pháp xác định khả năng phân giải các hợp chất cao phân tử của xạ khuẩn:
- Phương pháp xác định khả năng sinh enzym phân giải tinh bột:
Nguyên tắc: tinh bột khi gặp thuốc thử Lugol (cĩ thành phần Iot) sẽ bắt màu xanh đậm. Nên chủng xạ khuẩn cĩ khả năng sinh enzym phân giải tinh bột sẽ làm cho mơi trường khơng bắt màu nơi tinh bột bị phân giải và ngược lại sẽ cĩ màu xanh đậm khi enzym chưa khuếnh tán đến phân hủy tinh bột.
Phương pháp: cho 3ml nước cất vào ống thạch nghiêng lắc nhẹ cho bào tử trộn đều với nước tạo dịch huyền phù. Dùng que cấy thẳng nhúng vào dịch huyền phù sau đĩ chấm một điểm ở giữa đĩa petri cĩ chứa mơi trường MT5, sau 5 ngày nuơi cấy trong nhiệt độ phịng ta dùng Lugol nhỏ vào xung
quanh khuẩn lạc xạ khuẩn và tráng đều trên bề mặt mơi trường để yên trong vài phút; quan sát và đo đường kính vịng phân giải, đường kính khuẩn lạc.
Hiệu suất phân giải tinh bột được tính bằng hiệu số của đường kính vịng phân giải và đường kính khuẩn lạc.
- Phương pháp xác định khả năng sinh enzym phân giải Cellulose:
Nguyên tắc: Cellulose khi tác dụng với thuốc thử Lugol sẽ bắt màu đỏ huyết. Nên chủng xạ khuẩn cĩ khả năng sinh enzym phân giải Cellulose sẽ làm cho mơi trường khơng bắt màu với thuốc thử Lugol nơi Cellulose bị phân giải và chổ cĩ sự hiện diện của Cellulose sẽ bắt màu với Lugol và cĩ màu đỏ huyết.
Phương pháp: cho 3ml nước cất vào ống thạch nghiêng lắc nhẹ cho bào tử trộn đều với nước tạo dịch huyền phù. Dùng que cấy thẳng nhúng vào dịch huyền phù sau đĩ chấm một điểm ở giữa đĩa petri cĩ chứa mơi trường MT7, sau 6 ngày nuơi cấy trong nhiệt độ phịng ta dùng Lugol nhỏ vào xung quanh khuẩn lạc xạ khuẩn và tráng đều trên bề mặt mơi trường để yên trong vài phút; quan sát và đo đường kính vịng phân giải, đường kính khuẩn lạc.
Hiệu suất phân giải Cellulose được tính bằng hiệu số của đường kính vịng phân giải và đường kính khuẩn lạc.
- Phương pháp xác định khả năng sinh enzym phân giải Protein:
Nguyên tắc: Protein (gelatin) sẽ bị kết tủa khi tác dụng với acid TCA 10% làm cho mơi trường hĩa đục. Nên khi xạ khuẩn cĩ khả năng phân giải được protein thì khi nhỏ TCA 10% thì nơi khơng cĩ hiện diện Protein sẽ khơng tủa và ngược lại nơi cĩ sự hiện diện Protein sẽ tạo tủa làm cho mơi trường cĩ màu trắng đục.
Phương pháp: cho 3ml nước cất vào ống thạch nghiêng lắc nhẹ cho bào tử trộn đều với nước tạo dịch huyền phù. Dùng que cấy thẳng nhúng vào dịch huyền phù sau đĩ chấm một điểm ở giữa đĩa petri cĩ chứa mơi trường
trong vài phút; quan sát và đo đường kính vịng phân giải, đường kính khuẩn lạc.
Hiệu suất phân giải Protein được tính bằng hiệu số của đường kính vịng phân giải và đường kính khuẩn lạc.
2.2.2.2. Phương pháp xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật (ß – indole acetic acid (IAA)):
IAA là một kích thích tố sinh trưởng đối với thực vật thuộc nhĩm auxin.
Dựa vào đặc điểm tryptophan là tiền chất để tổng hợp nên IAA, người ta đã đưa ra nhiều phương pháp nhằm xác định sự hiện diện cũng như hàm lượng IAA được tổng hợp. Chúng tơi chọn phươngpháp hĩa học để phát hiện IAA thơng qua thuốc thử Salkowski cải tiến (IAA cho màu hồng nhạt với FeCl3 - mộtthành phần của thuốc thử Salkowski cải tiến).
2.2.2.2.1. Định tính IAA: hay phương pháp xác định nhanh khuẩn lạc sinh IAA.
Chủng xạ khuẩn được cấy vạch trên mơi trường ISP4 cĩ bổ sung L- triptophan ( 0,1g/l). Đặt khoang giấy lọc vơ trùng lên trên vết cấy, sau đĩ nuơi cấy trong nhiệt độ phịng với thời gian là 5 ngày; đến ngày thứ 5 lấy khoang giấy lọc ra đặt lên mặt thạchmột khoang giấy lọc khác đã bảo hịa trong thuốc thử Salkowski cải tiến. Nếu vùng giấy lọc ứng với vết cấy xạ khuẩn chuyển sang màu hồng nhạt thì chủng xạ khuẩn đĩ cĩ khả năng sinh tổng hợp IAA.
2.2.2.2.2. Định lượng IAA: Xác định hàm lượng IAA thơ và các hợp chất tương tự - dựng đồ thị chuẩn IAA:
- Nguyên tắc: IAA và các hợp chất tương tự tác dụng với thuốc thử Salkowski cải tiến sẽ cho màu vàng nhạt đến hồng đậm phụ thuộc vào hàm lượng IAA thơ và các hợp chất tương tự mà bắt màu với thuốc thử.
- Dựng đường chuẩn:
Pha IAA tinh khiết ở các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50 μg/ml ở mơi trường kiềm. ở mỗi nồng độ IAA nĩi trên, lấy 2ml cho vào các ống nghiệm
chứa 8 ml thuốc thử Salkowski cải tiến, so màu ở bước sĩng 530 nm. Đối chứng là 2ml nước cất + 8ml thuốc thử. Dựa vào chỉ số OD và nồng độ IAA để vẽ đường chuẩn.
- Xác định hàm lượng IAA thơ trong dịch nuơi cấy:
Chủng xạ khuẩn được nuơi trong mơi trường ISP4 nuơi cấy lắc ở tốc độ 200 vịng/phút trong thời gian 5 ngày. Sau đĩ thu dịch nuơi cấy qua ly tâm ở tốc độ 4500 vịng/ phút trong 15 phút, lấy dịch trong.
Nhỏ 2ml dịch nuơi cấy sau ly tâm vào ống nghiệm chứa sẳn 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến, đối chứng là 2ml nước cất + 8ml thuốc thử. Lắc đều, để yên trong 20 phút. So màu trên máy đo quang phổ ở bước sĩng 530nm. Chỉ số OD được đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lượng IAA trong dịch nuơi cấy. Hàm lượng IAA tính theo đơn vị µmIAA/ml.
2.2.3. Phương pháp hĩa lý.
2.2.3.1. Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh: Xạ khuẩn được nuơi lắc (200 vịng/phút) trên mơi trường MT3 (pH = 7). Sau 96 giờ lấy dịch nuơi cấy ly tâm 3000 vịng/phút, trong 5 phút loại bỏ sinh khối đem đun ở các ngưỡng nhiệt độ: 40OC, 60OC, 80OC, 100OC kéo dài ở các khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 40 phút, 60 phút. Làm nguội và xác định hoạt tính kháng sinh.
2.2.3.2. Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh:
Ở đây, chúng tơi trình bày phương pháp tách chiết kháng sinh bằng dung mơi hữu cơ.
Chất kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp cĩ thể nằm trong sinh khối và trong dịch nuơi cấy; vì vậy để tách chiết các kháng sinh trong sinh khối và dịch nuơi cấy xạ khuẩn thì cần phải lựa chọn dung mơi thích hợp cho từng phương pháp tách chiết kháng sinh.
- Ở phương pháp tách chiết kháng sinh từ dịch nuơi cấy: khảo sát trên các dung mơi : n-Butanol, n-Probanol, Toluen, Clorofooc.
Trên cơ sở kiểm tra họat tính kháng khuẩn của kháng sinh thơ sau khi tách chiết bởi phương pháp khuếch tán trên thạch để đánh giá dung mơi nào cĩ khả năng tách chiết kháng sinh nhiều nhất sẽ được lựa chọn cho qui trình tách chiết kháng sinh, áp dụng cho cả 2 phương pháp tách chiết kháng sinh từ sinh khối và dịch thể.
Trong qui trình tách chiết kháng sinh cĩ những đặc điểm tách chiết như sau: Sau khi kết thúc quá trình nuơi cấy xạ khuẩn, các quá trình biến đổi vẫn tiếp tục xảy ra trong dịch nuơi cấy sẽ làm biến đổi những sản phẩm sau nuơi cấy thành những dẫn xuất, để tránh hiện tượng này chúng tơi bổ sung vào dịch nuơi cấy HCl 10% đến pH = 3,0 – 3,5 trong dịch nuơi cấy.
Sau đĩ tách sinh khối ra khỏi dịch nuơi cấy qua ly tâm 3000 vịng/phút trong 5 phút. Lúc bấy giờ, chúng ta sẽ tiến hành tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối và dịch thể như sau:
- Phương pháp tách kháng sinh từ sinh khối: phần sinh khối sau khi tách khỏi dịch nuơi cấy được tiến hành rữa bằng nước cất 2 lần, cho dung mơi vào khuấy đảo liên tục ở nhiệt độ 45OC kéo dài 30 phút – pH = 7,0 sau đĩ tách sinh khối bằng ly tâm (3000 vịng/phút trong 5 phút) thu dịch lọc. Dịch lọc được cơ chân khơng cịn lại 1/3 sau đĩ làm giảm sự hồ tan của chất kháng sinh ở điều kiện nhiệt độ = 4OC làm chất kháng sinh tủa, thu chất kháng sinh tủa bằng phương pháp ly tâm rồi đem thử họat tính kháng sinh.
- Phương pháp tách chiết kháng sinh từ dịch nuơi cấy: dịch chiết sau khi tách sinh khối được chỉnh pH = 7,0 – 8,0 bằng NaOH 1N rồi cho dung mơi dùng tách chiết kháng sinh vào với tỉ lệ 4: 6 (dung mơi : dịch nuơi cấy sau khi tách sinh khối), đưa tịan bộ vào bình lĩng để tách lớp, thu lớp dung mơi cĩ kháng sinh hịa tan đem cơ chân khơng cịn 1:15. Tương tự như phương pháp tách chiết kháng sinh từ sinh khối, kháng sinh tủa ở nhiệt độ = 4OC cĩ bổ sung thêm aceton, việc bổ sung aceton (hay etanol) nhằm làm giảm sức căng
bề mặt giữa chất hồ tan (chất kháng sinh) và dung mơi làm cho sự tủa chất hồ tan trở nên dễ dàng hơn. Kháng sinh thơ được đem kiểm tra họat tính kháng sinh.
- Tinh sạch kháng sinh: để lọai bỏ các tạp chất cĩ đặc tính hịa tan được trong dung mơi tách chiết giống như chất kháng sinh người ta dùng phương pháp: thay đổi dung mơi tách chiết. Cĩ thể hiểu chất kháng sinh thơ gồm: chất kháng sinh và một số tạp chất cĩ tích chất tương tự chất kháng sinh, hồ tan được trong butanol. Hồ chất kháng sinh thơ cần làm tinh sạch vào metanol (là dung mơi tách chiết tốt kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii) rồi thu kháng sinh bằng phương pháp tủa ở nhiệt độ thấp (4OC); cuối cùng hồ chất kháng sinh vào aceton (là dung mơi phân cực giống như metanol nhưng aceton cĩ độ phân cực thấp nhất và thu kháng sinh tinh khiết ở dạng tủa.
Hình 2.2: Sơ đồ tách chiết kháng sinh (Lê Gia Hy, 1995)
2.2.3.3. Phương pháp xác định các nhĩm chức trong cấu trúc hĩa học của chất kháng sinh:
Nguyên tắc: dùng những phản ứng hố học để phân biệt các nhĩm chức trong chất kháng sinh, việc xác định các nhĩm chức trong cấu trúc hố học của chất kháng sinh được tiến hành bằng cách dựa vào những phản ứng màu đặc trưng để xác định qua đĩ cĩ thể sơ bộ phân loại chất kháng sinh theo cấu trúc. (Lê Ngọc Thạch, 2002)
- Xác định vịng lacton trong cấu trúc của chất kháng sinh qua phản ứng với acid H2SO4đđ : cho chất kháng sinh vào ống nghiệm cĩ sẳn 4ml H2SO4đđ với sự hiện diện của vịng lacton sẽ làm cho dung dịch cĩ màu đỏ thẩm.
- Xác định nhĩm –OH bằng phản ứng màu với H3PO4đđ : nếu phản ứng cĩ màu chứng tỏ chất kháng sinh cĩ vịng macrolid.
- Xác định nhĩm chức amin bằng phản ứng màu đặc trưng với Ninhydrin: