NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ DI TRUYỀN CỦA HEO RỪNG TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ DI TRUYỀN CỦA HEO RỪNG TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Tp HCM, năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ DI TRUYỀN CỦA HEO RỪNG TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 62.42.01.20 Cán hướng dẫn: PGS.TS Hoàng Nghĩa Sơn PGS.TS Bùi Văn Lai Tp HCM, năm 2017 i LỜI CAM ĐOAN Các số liệu luận án kết nghiên cứu tơi nhóm đồng tác giả nghiên cứu từ năm 2012 Các đồng tác giả có cam kết đồng ý cho tơi sử dụng kết nghiên cứu chung luận án Các số liệu luận án chưa công bố tác giả khác Đà Lạt, ngày tháng năm 2017 Người cam đoan Nguyễn Thị Phương Mai ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án này, tơi xin trân trọng cảm ơn: PGS.TS Hoàng Nghĩa Sơn Cố PGS.TS Bùi Văn Lai, hướng dẫn khoa học, bảo kinh nghiệm quý báu, tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu để hoàn thành luận án Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập trình thực đề tài Các anh, chị, em đồng nghiệp Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên đồng hành tạo điều kiện thuận lợi TS Lê Thành Long anh chị em phịng Cơng nghệ sinh học động vật, Viện Sinh học nhiệt đới thực nghiên cứu công bố Bố, Mẹ, Chồng, toàn thể thành viên gia đình ln nguồn động viên, an ủi, giúp đỡ dành tình cảm thiêng liêng Đề tài thuộc Chương trình Tây Nguyên mã số TN3/C06 đề tài cấp sở Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên hỗ trợ kinh phí thực nghiên cứu Đà Lạt, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Nguyễn Thị Phương Mai iii MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ .1 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI .2 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu heo rừng 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Sự phân bố của heo rừng 1.1.3 Đặc điểm chung của heo rừng 1.1.4 Phương thức tìm kiếm thức ăn 1.1.5 Phạm vi sống mật độ quần thể của heo rừng 1.1.6 Đặc điểm heo rừng Việt Nam 11 1.2 Tiến hóa phát sinh loài 12 1.2.1 Chọn lọc nhân tạo tiến hóa 12 1.2.2 Phát sinh lồi tiến hóa 13 1.2.3 Các khái niệm phát sinh loài 15 1.3 Một số marker phân tử .18 1.3.1 ADN ty thể (mtADN) 18 1.3.2 Gen cytochrome b 19 1.3.3 Vùng kiểm soát (control region) .20 1.3.4 Gen 16S rRNA 21 1.3.5 Intron vùng nhân .22 1.3.6 Protein kinase C 22 1.3.7 Các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài phân tử heo rừng 23 1.4 Bảo tồn heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên 24 1.4.1 Bảo tồn giao tử heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên 25 1.4.2 Bảo tồn tế bào sinh dưỡng .29 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu .32 iv 2.2 Phương pháp .32 2.2.1 Điều tra giống heo rừng nuôi khu vực Tây Nguyên 32 2.2.2 Phân tích ADN, đánh giá hình thái 33 2.2.3 Thu thập, nuôi dưỡng heo rừng Tây Nguyên thu nhận 38 2.2.4 Bảo tồn nguồn gen heo rừng Tây Nguyên 39 2.2.5 Phương pháp thống kê 46 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .47 3.1 Điều tra giống heo rừng nuôi khu vực Tây Nguyên .47 3.2 Phân tích ADN, đánh giá hình thái .47 3.2.1 Kết phân tích trình tự D-loop 52 3.2.2 Kết phân tích trình tự cytochrome b 57 3.2.3 Kết phân tích trình tự 16S 62 3.2.4 Đánh giá hình thái heo rừng Tây nguyên 48 3.3 Thuần dưỡng heo rừng Tây Nguyên Việt Nam thu nhận .65 3.3.1 Mô tả đặc điểm sinh học heo rừng Tây Nguyên 65 3.3.2 Thuần hóa heo rừng Tây Nguyên 66 3.4 Bảo tồn nguồn gen heo rừng Tây Nguyên- Việt Nam 70 3.4.1 Tinh trùng heo rừng 70 3.4.2 Đông lạnh tế bào .76 KẾT LUẬN .79 ĐỀ NGHỊ 80 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic bp : base pair CPA : Cryoprotectant agents ĐDSH : Đa dạng Sinh học DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO : Dimethyl Sulfoxide EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FBS : Fetal Bovine Serum GEYC : Glycerol Egg Yolk Citrate HST : Hệ sinh thái IIF : Intracellular Ice Formation NIH : National Institutes of Healthn PBS : Phosphate-Buffered Saline PCR : Polymerase Chain Reaction ROS : Reactive Oxygen Species SNP : Single Nucleotide Polymorphisms TAE : Tris-Acetate-EDTA TBT : Tế bào trứng UV : Ultra Violet YBP : Year Before Present vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Heo rừng điều kiện tự nhiên Hình 1.2 Phân loại phát sinh loài theo Page Holmes 16 Hình 1.3 Cấu trúc ADN ty thể 18 Hình 1.4 Cấu trúc protein cytochrome b 20 Hình 1.5 Cấu trúc vùng kiểm sốt ty thể động vật có vú .21 Hình 2.1 Các thơng số đo bên thể heo rừng 33 Hình 2.2 Các số hộp sọ phân tích 34 Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt q trình phân tích ADN ty thể 35 Hình 2.4 Sơ đồ tóm tắt q trình hóa 38 Hình 2.5 Heo rừng nguồn gốc Tây Nguyên 39 Hình 2.6 Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm bảo tồn nguồn gen heo rừng .40 Hình 2.7 Buồng đếm Neubauer 41 Hình 2.8 Các dạng kì hình tinh trùng 43 Hin ̀ h 2.9 Thu nhâ ̣n tinh từ mào tinh 44 Hình 3.1 Các vị trí biến đổi vùng D-loop ty thể cá thể heo rừng 53 Hình 3.2 Cây phát sinh lồi thiết lập dựa trình tự D-loop 55 Hình 3.3 Các vị trí biến đổi vùng cytochrome b 58 Hình 3.4 Cây phát sinh lồi thiết lập dựa trình tự cytochrom b 61 Hình 3.5 Các vị trí biến đổi trình tự 16S 63 Hình 3.6 Cây phát sinh lồi thiết lập dựa trình tự 16S 64 Hình 3.7 Heo rừng Sus scrofa khu vực Tây Nguyên 66 Hình 3.8 Heo rừng hóa .67 Hình 3.9 Tinh trùng nhuộm Eosin-Nigrosin .72 Hình 3.10 Sự kết dính tinh trùng 73 Hình 3.11 Kỳ hình tinh trùng heo rừng Tây Nguyên .74 Hin ̀ h 3.12 Tế bào heo rừng Tây Nguyên nuôi cấ y sơ cấ p 77 Hin ̀ h 3.13 Tế bào heo rừng Tây Nguyên ni cấ y chù n phòng thí nghiệm 77 Hình 3.14 Tế bào heo rừng Tây Nguyên sau giải đông 78 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng PCR giải trình tự .36 Bảng 2.2.Thành phần phản ứng 36 Bảng 2.3 Chu kì phản ứng 37 Bảng 2.4 Nhiệt độ phản ứng đoạn mồi 37 Bảng 3.1 Nguồ n gố c giố ng heo rừng nuôi điạ bàn Tây Nguyên .47 Bảng 3.2 Thông số đo thể heo 49 Bảng 3.3 Thông số đo hộp sọ heo 51 Bảng 3.4 Ma trận khoảng cách di truyền Tamura-Nei quần thể heo rừng dựa trình tự D-loop .54 Bảng 3.5 Ma trận khoảng cách di truyền Tamura-Nei quần thể heo rừng dựa trình tự cytochrome b .59 Bảng 3.6 Điạ điể m và số lươ ̣ng heo rừng thu nhâ ̣n tự nhiên 67 Bảng 3.7 Tỷ lê ̣ thuầ n hóa thành công .68 Bảng 3.8 Một số đặc điểm sinh sản heo rừng Tây Nguyên giai đoạn sinh .69 Bảng 3.9 Một số đặc điểm sinh sản heo rừng Tây Nguyên sau giai đoạn sinh .70 Bảng 3.10 Các thông số tinh dịch 71 Bảng 3.11 Tỉ lệ tinh trùng sống sau giải đông nghiệm thức khác 75 Bảng 3.12 Tỷ lê ̣ số ng của tinh trùng thu từ mào tinh đông la ̣nh .76 PHẦN MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nơi đánh giá có mức độ đa dạng sinh học cao giới Hai lồi heo rừng xác định có tồn Việt Nam Sus bucculentus Sus scrofa Tuy nhiên, lồi Sus bucculentus khó tìm thấy cịn sống tự nhiên; loài Sus scrofa cho phân bố rộng, đặc biệt có nhiều vùng rừng núi khu vực Tây Nguyên Các nghiên cứu đặc điểm hình thái di truyền quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Ngun cịn hạn chế Ở khu vực Tây Nguyên, giống heo rừng mà người dân địa phương nuôi hầu hết heo lai nhập từ nước Thái Lan, Malaysia… Các dịng heo lai có đặc điểm di truyền khơng rõ ràng, khơng có lý lịch nguồn gốc cụ thể Việc phát triển chăn nuôi tự phát giống heo rừng lai làm tăng nguy đe dọa tới bảo tồn nguồn gen quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Ngun Thêm vào đó, tình hình săn bắt bừa bãi, nạn chặt phá rừng… nguyên nhân làm cho số lượng heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên bị giảm sút nhanh có nguy đe dọa tới tồn vong chúng Do đó, nghiên cứu việc thu nhận, hóa nhân rộng quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên có vai trị quan trọng việc bảo tồn lồi heo rừng Việt Nam nói chung khu vực Tây Nguyên nói riêng Sự phân biệt nhóm heo rừng khác việc dựa vào đặc điểm hình thái người ta cịn dựa vào kiểu gen, đặc biệt trình tự đặc trưng vùng bảo tồn ADN nhân ADN ty thể Các lồi heo rừng khác có vị trí đa hình nucleotide đơn (single nucleotide polymorphism) tạo nên haplotype đặc trưng cho lồi heo Trên sở xây dựng phát sinh lồi để xác định nguồn gốc khác biệt heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên với giống heo rừng khác Xuất phát từ tình hình trên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học di truyền heo rừng Tây Nguyên” PL-50 Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks Data source: Data in Notebook2 Group Col Col Col N 5 Missing 0 Median 40.894 45.695 42.810 25% 40.176 42.164 41.508 75% 42.335 49.225 44.435 H = 2.662 with degrees of freedom P(est.)= 0.264 P(exact)= 0.292 The differences in the median values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0.292) PL-51 Phụ lục Đơng lạnh tinh trùng 4.1 Ảnh hưởng tiến trình hạ nhiệt Tổng số tinh trùng sống 200 tinh trùng đếm Lần Lần Lần nt1 46 49 47 Nghiệm thức nt3 nt4 48 74 50 78 50 75 nt2 63 59 62 nt5 71 72 69 nt6 82 80 82 One Way Analysis of Variance Data source: Data in Notebook1 Normality Test: Passed (P = 0.471) Equal Variance Test: Passed (P = 0.926) Group Name Col Col Col Col Col N 3 3 Source of Variation Between Groups Residual Total Missing 0 0 DF 10 14 Mean 23.667 30.667 24.667 37.833 35.333 Std Dev 0.764 1.041 0.577 1.041 0.764 SS 473.600 7.333 480.933 MS 118.400 0.733 SEM 0.441 0.601 0.333 0.601 0.441 F 161.455 P