Đồ án tốt nghiệp ngành Công nghệ chế biến thủy sản "Tìm hiểu về các loài Sao biển ở Việt Nam: Đặc điểm, phân loại, phân bố, ứng dụng và công nghệ sản xuất các sản phẩm từ Sao biển"

Đồ án tốt nghiệp ngành Công nghệ chế biến thủy sản Tìm hiểu về các loài Sao biển ở Việt Nam: Đặc điểm, phân loại, phân bố, ứng dụng và công nghệ sản xuất các sản phẩm từ Sao biển trình bày về tìm hiểu các loài Sao biển ở Việt Nam, tìm hiểu các quy trình công nghệ sản xuất các sản phẩm từ Sao biển, kết luận & đề nghị. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết tài liệu.

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA THỦY SẢN  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CƠNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN TÌM HIỂU VỀ CÁC LOÀI SAO BIỂN Ở VIỆT NAM: ĐẶC ĐIỂM, PHÂN LOẠI, PHÂN BỐ, ỨNG DỤNG VÀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC SẢN PHẨM TỪ SAO BIỂN HỌ & TÊN SVTH GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN HỌ & TÊN GVHD Tp Hồ Chí Minh, tháng… năm… Đồ án tốt nghiệp GVHD LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin chân thành cám ơn quý thầy, quý cô khoa Thủy Sản tận tâm truyền đạt cho chúng em kiến thức chuyên ngành q báu Và thầy hết lịng bảo chúng em suốt trình học tập trường, thầy cô tạo điều kiện cho chúng em nắm vững lý thuyết bước tiếp cận thực tế Đặc biệt, em xin cảm ơn cô Nguyễn Thị Mỹ Lệ, người tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành tốt đồ án Trong trình hồn thành đề tài em cố gắng nhiều, thời gian có hạn nên đề tài em tránh khỏi sai sót Vì vậy, em mong thầy bạn đóng góp ý kiến để đề tài em hoàn thành tốt Xin chân thành cảm ơn Tp.HCM, tháng… năm… SVTH II Đồ án tốt nghiệp GVHD DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình dạng ngồi biển Hình 1.2 Sao biển Asterias forbesi Hình 1.3 Sao biển nướng Hình 1.4 Sao biển Asterias rubens Hình 1.5 Sao biển Pisaster ochraceus Hình 1.6 Sao biển Pisaster giganteus, Sao biển Pisaster brevispinus, Sao biển Evasterias troscheli Hình 1.7 Sao biển Archaster typicus Hình 1.8 Sao biển làm khô dùng ngâm rượu Hình 1.9 Sao biển Archaster typicus ngâm rượu Hình 1.10 Sao biển Linckia laevigata màu xanh 10 Hình 1.11 Sao biển Linckia laevigata màu xanh nhạt cam 10 Hình 1.12 Sao biển Acanthaster planci 11 Hình 1.13 Sao biển Culcita novaeguineae 13 Hình 1.14 Sao biển Protoreaster nodosus 14 Hình 1.15 Sao biển chocolate chip khơ 15 Hình 1.16 Sao biển Astropecten polyacanthus 16 Hình 1.17 Sao biển Echinaster luzonicus 17 SVTH III Đồ án tốt nghiệp GVHD LỜI MỞ ĐẦU Nước ta có bờ biển tiếp liền với Biển Đơng Đường bờ biển dài 3260 km chạy dài từ bắc tới nam Với vùng thềm lục địa rộng lớn khoảng triệu km2, thuộc vùng biển nhiệt đới nên nguồn nguyên liệu đa dạng có bốn mùa Bên cạnh loài hải sản khai thác, đánh bắt lâu nay, nguồn động vật đáy, đặc biệt nhóm động vật da gai (Echinodermata) hệ sinh thái biển đảo nguồn thực phẩm có chất lượng cung cấp trực tiếp cho người, giá trị thương mại, du lịch phục vụ cho chế biến thủy, hải sản y học Hiện nay, nghiên cứu động vật đáy nói chung lồi biển nói riêng tiến hành nghiên cứu nhiều nước Tuy nhiên, nước ta thơng tin lồi biển khơng theo hệ thống nhiều thơng tin cịn thiếu q trình thu thập, tạo sở liệu phục vụ cho mục đích quy hoạch, bảo vệ giá trị đa dạng loài phân bố giá trị kinh tế với mục tiêu bảo tồn khai thác nguồn lại lâu dài, bền vững Bài đồ án dựa thống kê tài liệu liên quan đến đặc trưng đặc điểm, phân loại, phân bố ứng dụng loài biển nước ta tìm hiểu số quy trình sản xuất sản phẩm từ biển áp dụng thực việc tạo sản phẩm có lợi từ biển để đáp ứng nhu cầu người Nên xem hướng phát triển đầy tiềm cần khai thác ngành thủy sản SVTH IV Đồ án tốt nghiệp GVHD MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN I DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH III LỜI MỞ ĐẦU IV MỤC LỤC V Chƣơng TÌM HIỂU CÁC LỒI SAO BIỂN Ở VIỆT NAM 1.1 Giới thiệu chung biển 1.2 Các loài biển Việt Nam 1.2.1 Bộ Forcipulatida 1.2.1.1 Asterias forbesi 1.2.1.2 Asterias rubens 1.2.1.3 Pisaster ochraceus (Sao biển tía) 1.2.2 Bộ Valvatida 1.2.2.1 Archaster typicus 1.2.2.2 Linckia laevigata (Sao biển xanh) 10 1.2.2.3 Acanthaster planci (Sao biển gai) 11 1.2.2.4 Culcita novaeguineae (Sao biển gối) 13 1.2.2.5 Protoreaster nodosus (Sao biển chocolate chip) 14 1.2.3 Bộ Paxillosida 16 1.2.3.1 1.2.4 Astropecten polyacanthus 16 Bộ Spinulosida 17 1.2.4.1 Echinaster luzonicus 17 Chƣơng TÌM HIỂU CÁC QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC SẢN PHẨM TỪ SAO BIỂN 19 2.1 Tìm hiểu quy trình sản xuất biển khô 20 2.1.1 Sơ đồ quy trình sản xuất 20 2.1.2 Thuyết minh quy trình sản xuất 21 SVTH 2.1.2.1 Nguyên liệu 21 2.1.2.2 Rửa 21 2.1.2.3 Làm khô 21 2.1.2.4 Ngâm rƣợu 21 V Đồ án tốt nghiệp 2.1.2.5 GVHD Làm khô ( Bảo quản) 22 2.2 Tìm hiểu quy trình chiết tách sàng lọc hoạt tính sinh học hợp chất sinh học từ biển 23 2.2.1 Trình tự thực 23 2.2.2 Thao tác thực 23 2.2.2.1 Sơ đồ thực thao tác xử lý mẫu tạo dịch chiết 23 2.2.2.2 Xử lý mẫu 24 2.2.2.3 Tạo dịch chiết 24 2.2.2.4 Sàng lọc hoạt tính sinh học 26 Chƣơng KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 SVTH VI Đồ án tốt nghiệp GVHD Chƣơng TÌM HIỂU CÁC LỒI SAO BIỂN Ở VIỆT NAM SVTH Đồ án tốt nghiệp GVHD 1.1 Giới thiệu chung biển  Việt Nam có bờ biển tiếp liền với Biển Đông Đường bờ biển dài 3260 km chạy dài từ bắc tới nam Với vùng thềm lục địa rộng lớn khoảng triệu km2, thuộc vùng biển nhiệt đới nên nguồn nguyên liệu đa dạng có bốn mùa Trữ lượng cá vùng biển Việt Nam phong phú (theo dự tính sơ có khoảng 2000 lồi, 40 lồi cá có giá trị kinh tế lớn) với vơ số lồi hải sản khác tơm, cua, trai, tảo, … Bên cạnh lồi hải sản khai thác, đánh bắt lâu nay, nguồn hải sản biển loài quan tâm đến, với đa dạng chủng loại Nên xem hướng phát triển đầy tiềm cần khai thác ngành thủy sản  Sao biển loài động vật không xương sống, thuộc ngành Da gai (Echinodermata), lớp Asteroidea  Đặc điểm phân bố: Phân bố rộng tập trung nhiều khu vực Bắc Thái Bình Dương Chúng sống đáy biển, thích nghi với đáy cát, bùn cát, đá nhỏ, san hơ Chúng di động, nhạy cảm với ánh sáng độ mặn nước biển  Đặc điểm cấu tạo: Là nhóm động vật có cấu tạo điển hình động vật da gai Hình dạng động vật biển hình sao, thể dẹp theo chiều lưng bụng có đối xứng tỏa tròn bậc năm, gồm đĩa trung tâm hay nhiều cánh (có thể tới 45 cánh) xếp xung quanh, cánh biển dài từ – 1,5 cm, có lên tới 80 cm Lỗ miệng có màu sặc sỡ, bị giá thể lỗ miệng hướng phía dưới, cịn hậu mơn phía đối diện Bên quanh miệng ống nước vịng, từ phát năm ống nước phóng xạ tỏa tới tận đỉnh năm cánh, ống nước phóng xạ có hai dãy chân ống Sao biển khơng có đầu việc di chuyển thực nhờ hoạt động hai hàng chân ống nằm phía cánh tay Tốc độ di chuyển biển chậm từ đến 10 cm phút Hình 1.1 Hình dạng ngồi biển A.Mặt lưng SVTH B.Mặt bụng Đồ án tốt nghiệp GVHD  Phân loại: Lớp Sao biển (Asteroidea) chia thành (order): Brisingida, Forcipulatida, Notomyotida, Paxillosida, Spinulosida, Valvatida Velatida Đến thống kê khoảng 1.700 loài biển phân bố tất đại dương giới Những nơi có nhiều biển phải kể đến vùng biển Australia, Đơng Thái Bình Dương Bắc Mỹ Đặc biệt, vùng biển nhiệt đới Ấn Độ Dương  Thái Bình Dương nơi tập trung đại đa số loài biển  Bộ Brisingida: Là lớp biển sống đáy biển sâu, chiều dài thể khoảng  16 cm, cánh tay mỏng dùng để kiếm thức ăn Bộ Brisingida có khoảng 100 lồi với 17 chi họ  Bộ Forrcipulatida: Các loài biển thuộc nhận biết cánh tay dạng kìm nhỏ, đặc điểm dễ nhận thể chúng Bộ Forrcipulatida chứa khoảng 300 loài số 68 chi họ  Bộ Notomyotida: Là loài biển sống biển sâu với cánh tay linh hoạt sợi dài dọc theo bề mặt hông bên thể Bộ Notomyotida gồm khoảng 75 loài số 12 chi họ  Bộ Paxillosida: Đây loài biển xem động vật sống nước, chúng vùi thể lớp bùn cát Chúng nhận số nét đặc trưng cánh tay nhọn Bộ Paxillosida chứa khoảng 255 loài số 46 chi họ  Bộ Spinulosida: Đây loài biển với khung mỏng manh chân dạng kìm nhỏ Bộ Spinulosida chứa khoảng 120 loài số chi họ  Bộ Valvatida: Đây loài biển đa dạng thường nhận xương mép nhỏ Việc xác định đặc điểm lồi thuộc có nhiều thay đổi gây nhiều tranh cãi Bộ Valvatida có khoảng 695 loài số 165 chi 14 họ  Bộ Velatida: Các loài biển thuộc thường có thân mỏng với vịng trịn trung tâm lớn chỗ lõm với đường kính lớn Có số mối quan hệ tương đồng họ Velatid họ Valvatid Bộ Velatida có khoảng 200 lồi số 25 chi họ SVTH Đồ án tốt nghiệp GVHD 1.2 Các loài biển Việt Nam  Ở Việt Nam có khoảng 60 lồi biển khác nhau, phân bố dọc bờ biển từ bắc đến nam, riêng vịnh Nha Trang phát 20 loài biển thuộc 16 chi, 11 họ Còn bãi Vạn Bội  Cát Bà – Hải Phịng có bãi biển với diện tích rộng 5ha, nơi tập trung loài biển rãnh nông biển rãnh sâu (Astropecten polyacanthus, A.monacanthus) với mật độ cao (khoảng 20 con/m2) Đa phần biển nước ta thuộc sau:  Bộ Spinulosida có họ Echinasteridae  Bộ Valvatida có họ Oreasteridae, Ophidiasteridae, Archasteridae  Bộ Paxillosida có họ Astropectinidae  Bộ Forcipulatida có họ Asteridae 1.2.1 Bộ Forcipulatida 1.2.1.1 Asterias forbesi Hình 1.2 Sao biển Asterias forbesi Asterias forbesi thường gọi biển Forbes, loài biển họ Asteriidae a) Phân bố: Chúng thường tìm thấy vùng nước nơng phía tây bắc Đại Tây Dương vùng biển Caribê Ở Việt Nam, Asterias forbesi khai thác từ vùng biển Hải Phịng, Nha Trang (Khánh Hịa), Phan Thiết (Bình Thuận), Kiên Giang, b) Đặc điểm: Asterias forbesi thường có cánh đơi cánh Giống nhiều loài biển khác, bề mặt lưng bao phủ nốt gò mềm Các cánh tay đầy đặn, rộng từ phần đĩa trung tâm nhỏ dần đến đầu cánh tay Sao biển Asterias forbesi phát triển có đường kính lên đến khoảng 15 cm (5,9 in) có chiều dài cánh tay khoảng cm (2,4 in) Có hàng chân ống mặt bụng, hai bên rãnh rãnh cánh tay Màu sắc mặt lưng Asterias forbesi khác nhau, từ màu nâu đến màu đỏ tía mặt bụng thường có màu nâu nhạt Tại chóp cánh tay có đốm mắt nhỏ SVTH Đồ án tốt nghiệp GVHD 2.1 Tìm hiểu quy trình sản xuất biển khơ 2.1.1 Sơ đồ quy trình sản xuất Ngun liệu Rửa Làm khô Ngâm rƣợu Làm khô Thành phẩm SVTH 20 Đồ án tốt nghiệp GVHD 2.1.2 Thuyết minh quy trình sản xuất 2.1.2.1 Nguyên liệu  Nguyên liệu biển sống biển chết, tốt bạn nên chọn chết dù biển cịn sống hay chết sản phẩm làm  Để phân biệt biển chết biển sống cần quan tâm đến vài dấu hiệu nhận biết sau:  Sao biển lồi di chuyển chậm Vì bắt gặp biển bãi biển, bạn cần bỏ vài phút để quan sát xem biển có di chuyển hay khơng có bọt xung quanh khơng Nếu khơng ta đốn phần chết  Nếu muốn chắn Hãy chạm vào biển xem thể có giịn, cứng hay khơng, có biển chết 2.1.2.2 Rửa  Chuẩn bị: Thau, thuốc tẩy, nước  Thực hiện:  Trước thực công đoạn ngâm rượu làm khô, ta cần làm biển Pha thuốc tẩy: nước với tỉ lệ 1:3, cho dung dịch rửa cho biển vào ngâm ngập biển ngâm rửa khoảng phút  Trong q trình ngâm rửa dùng tay nhẹ dàng làm cát đất, tạp chất thân biển Không thực thao tác mạnh tay lên biển làm trầy rách da biển (do da biển mỏng) 2.1.2.3 Làm khô  Sau ngâm rửa, ta cần làm khô biển cách phơi ánh nắng mặt trời Sao biển phải làm khơ hồn tồn Trong q trình phơi khơ, cánh tay biển có xu hướng cong lên tương tự việc phơi khô loại hải sản khác Nên dùng số vật có trọng lượng đủ để giữ cánh tay khơng bị cong 2.1.2.4 Ngâm rƣợu  Chuẩn bị: + thau (hoặc chậu, khay, …) có diện tích lớn đường kính biển Vì vậy, khơng cần phải ấn cánh tay biển xuống cho phẳng  Rượu có nồng độ 70  Thực hiện:  Đầu tiên, ta đổ rượu tràn phần đáy thau để chắn mặt bụng biển tiếp xúc hết với rượu Sau đó, đặt biển vào, điều chỉnh cánh tay theo kiểu dáng mong muốn đổ từ từ rượu vào ngập hết mặt lưng biển Ở cánh tay nên dùng đá nặng đặt lên để SVTH 21 Đồ án tốt nghiệp GVHD tránh trình ngâm rượu cánh tay bị cong lên Sau thực xong, ta mang thau biển trời phơi từ 30 – 48  Một số trường hợp, người ta sử dụng formaldehyde thay cho rượu Formaldehyde pha với nước có tỉ lệ 1:5 Với cách làm có nhược điểm biển sau ngâm xong mùi formaldehyde nồng cần phải khoảng thời gian để mùi nhẹ dần 2.1.2.5 Làm khô ( Bảo quản) Cách 1: Phơi nắng  Sao biển sau ngâm rượu, ta lấy biển đem phơi khô nắng để bảo quản Phải đảm bảo sau phơi biển phải khơ hồn tồn từ ngồi Nếu bên biển chưa khơ q trình sử dụng biển có mùi khơng sử dụng lâu dài bị thối Kiểm tra biển thường xuyên để đảm bảo trình phơi khơ hình dạng biển với u cầu bạn Cách 2: Ướp muối  Ngoài cách làm khô cách phơi ánh nắng Một phương pháp khác đơn giản, làm khơ muối  Đặt biển lên khay phủ kín lớp muối biển lên biển Sử dụng vật nặng (hòn đá) đặt lên cánh tay biển để tránh bị cong lên q trình làm khơ Muối có khả hút ẩm cao, giúp hút ẩm bên biển Đây cách bảo quản độc đáo dễ thực Khi làm khô muối, tốt nên để khay biển ngồi trời nơi có ánh nắng để tránh mùi q trình làm khơ giúp việc làm khơ thực nhanh chóng SVTH 22 Đồ án tốt nghiệp GVHD 2.2 Tìm hiểu quy trình chiết tách sàng lọc hoạt tính sinh học hợp chất sinh học từ biển 2.2.1 Trình tự thực Mẫu nguyên liệu Xử lý mẫu Tạo dịch chiết Sàng lọc hoạt tính sinh học 2.2.2 Thao tác thực 2.2.2.1 Sơ đồ thực thao tác xử lý mẫu tạo dịch chiết Sao biển Archaster typicus Thái nhỏ, chiết siêu âm MeOH, cất loại dung môi Dịch chiết MeOH Bổ sung nước Bổ sung BuOH Chiết CHCl3/H2O 1:1 Chiết CHCl3/H2O 1:1 Cặn CHCl3 SVTH Cặn BuOH Cặn pha nƣớc 23 Đồ án tốt nghiệp GVHD 2.2.2.2 Xử lý mẫu Các mẫu biển sau thu tiến hành bảo quản theo quy trình thống sau:  Rửa nhiều lần nước cất để loại muối tạp bẩn  Để nước nhiệt độ phòng, ép nhẹ giấy lọc để thấm  Cho mẫu vào túi nilon sạch, kèm theo kí hiệu mẫu ghi bút chì giấy nến để tránh bị mờ rách nát tiếp xúc với nước điều kiện lạnh âm sâu  Các túi mẫu lưu giữ tủ lạnh sâu -200C để đảm bảo mẫu không bị phân hủy vi sinh vật 2.2.2.3 Tạo dịch chiết Các mẫu biển chiết theo quy trình sau: Bước 1: Lấy mẫu khỏi tủ lạnh Trong trình lấy mẫu phải cẩn thận tủ lạnh âm sâu có tạo tuyết nên túi mẫu bị dính vào dễ bị rách lấy mẫu Nếu túi bị rách làm kí hiệu mẫu gây cố nhầm lẫn trình thực kết Bước 2: Rã đông – Rửa mẫu Mẫu lấy để rã đông nhiệt độ phịng sau rửa lại nước cất trước tiến hành cắt nhỏ xay mẫu Bước 3: Cắt nhỏ xay mẫu Mẫu sau rửa cân cắt nhỏ xay mẫu Bước 4: Tách chiết dung môi MeOH Mẫu xay tiến hành chiết lần MeOH (metanol) thiết bị siêu âm (Ultrasonic 2010, 950W) nhiệt độ 40 – 500C, thời gian chiết lần tối thiểu 60 phút Bước 5: Lọc & Chưng cất Dịch chiết lần chiết lọc qua giấy lọc (Sử dụng giấy lọc Whatman đường kính 240 nm, N0 1) để loại sinh khối, gộp lại tiến cất loại dung môi áp suât giảm nhiệt độ 500C thu dịch cô MeOH Bước 6: Loại muối khỏi dịch cô MeOH thô  Dịch cô MeOH thô tiến hành rửa loại muối qua cột nhồi nhựa trao đổi ion Dianion HP-20 với kích thước cột: đường kính = 30 nm chiều dài l= 0.5 m  Dịch cô MeOH thô đưa lên cột Dianion, tiến hành rửa loại muối nước cất với thể tích khoảng – lit/mẫu  Rửa toàn chất cột Dianion HP-20 MeOH dịch khỏi cột khơng cịn chứa chất hòa tan cặn dịch chiết ban đầu (Khoảng – lit MeOH/mẫu) SVTH 24 Đồ án tốt nghiệp GVHD Bước 7: Loại dung môi khỏi dịch MeOH  Dịch MeOH rửa cột Dianion tiến hành cất loại dung môi áp suất giảm nhiệt độ 500C đến khối lượng không đổi  Dịch chiết thô MeOH sau loại muối lấy từ dịch tổng Dịch chiết sau sấy khô cho vào bình chiết có dung tích phù hợp Dịch hòa tan nước cất Cho vào dịch chiết dung mơi n-Hexane, bình chiết đặt bể siêu âm (Ultrasonic 2010, 950W) siêu âm nhiệt độ 400C 10 phút Chiết phân bố liên tục ba lần n-Hexane theo tỉ lệ 1:1 thể tích Dịch chiết nHexane cho vào bình cầu đáy trịn bốc dung mơi chân khơng (11 mmHg) máy cô quay nhiệt độ 400C Cặn thu cân hòa tan Cặn thu cho vào lọ nhỏ dán nhãn đánh kí hiệu mẫu gửi thử hoạt tính  Lớp nước thu từ chiết phân bố tiếp tục chiết phân bố ba lần CHCl3 theo tỉ lệ 1:1 thể tích Lớp CHCl3 cho vào bình cầu đáy trịn bốc dung mơi chân khơng (11 mmHg) máy cô quay nhiệt độ 400C Cặn thu cân hòa tan Cặn thu cho vào lọ nhỏ dán nhãn đánh kí hiệu mẫu gửi thử hoạt tính  Lớp nước thu từ chiết phân bố tiếp tục chiết phân bố ba lần Butanol theo tỉ lệ 1:1 thể tích Lớp Butanol cho vào bình cầu đáy trịn bốc dung mơi chân khơng (11 mmHg) máy cô quay nhiệt độ 400C Cặn thu cân hòa tan Cặn thu cho vào lọ nhỏ dán nhãn đánh kí hiệu mẫu gửi thử hoạt tính  Lớp nước cịn lại cho vào bình cầu đáy trịn làm bốc dung môi chân không (11 mmHg) máy cô quay nhiệt độ 400C lưu trữ  Các mẫu chiết dung môi MeOH kí hiệu là: KC-001-M Sau loại muối tiến hành phân đoạn dung môi n-Hexane (H), CHCl3 (C), Butano (B), Nước (N) kí hiệu sau: KC-001-H: Phân đoạn n-Hexane KC-001-C: Phân đoạn CHCl3 KC-001-B: Phân đoạn Butanol KC-001-N: Phân đoạn nước Bước 8: Chuyển toàn lượng cặn dịch chiết thu vào lọ đựng cặn dịch chiết cân dán kí hiệu mẫu (Lọ phải đảm bảo sạch, chịu dung môi không bị ảnh hưởng bới điều kiện lạnh âm sâu) Ví dụ: Mẫu dán nhãn theo quy ước đánh ký hiệu mẫu KC 09.09/06-10 KC-001-B Ngày…tháng…năm… SVTH 25 Đồ án tốt nghiệp GVHD Bước 9: Cân lọ chứa cặn dịch chiết tính lượng cặn dịch chiết thu cách trừ khối lượng ban đầu Bước 10: Bảo quản lọ đựng cặn dịch chiết tủ lạnh âm sâu (-200C) để tránh bị vi sinh vật phân hủy 2.2.2.4 Sàng lọc hoạt tính sinh học Trong sàng lọc hoạt tính sinh học tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học thơng qua loại hoạt tính sau:  Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial Activity assay)  Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay)  Hoạt tính chống oxy hóa mẫu sinh vật biển thông qua phản ứng bao vây gốc tự DPPH (Antioxidant activity assay – DPPH free radical scavenging)  Hoạt tính chống lỗng xương thơng qua chế kích thích khác biệt hóa ngun bào xương MC3T3-E1  Hoạt tính kháng NF-B Nhưng đồ án thời gian thực có giới hạn nên nói đến hai quy trình: Quy trình đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial Activity assay) Quy trình đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay) Quy trình đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật (Antimicrobial Activity assay)  Nguyên liệu: Mẫu biển chuẩn bị theo quy trình thống xây dựng khuôn khổ đề tài KC09.15 chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:  Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)  Vi khuẩn Gr(+): Bacilus subtillis (ATCC 27212) Staphylococcus aureus  Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum  Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae  Kháng sinh kiểm định:  Ampicilin vi khuẩn Gr (+)  Tetracylin vi khuẩn Gr (-)  Nystatin nấm sợi nấm men  Cách pha kháng sinh: Kháng sinh pha dung môi DMSO 100% với nồng độ: Ampicilin: 50 mM; Tetracylin: 10 mM; Nystatin: 0.04 mM  Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: SVTH 26 Đồ án tốt nghiệp GVHD  Mơi trường trì bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB) cho nấm men nấm mốc Thành phần mơi trường gồm có: Polypeptone Neopeptone: 10g; Dextrone: 40g; nước cất: 1000ml, pH= 5.8  Môi trường Trypcase Soya Broth (TSB) sử dụng để phục hồi chủng vi sinh Thành phần môi trường sau: Casein thuỷ phân 17,0 g/l, Đậu nành thuỷ phân 3,0 g/l, Sodium chloride g/l, Dipotassium phosphate 2,5 g/l, Dextrose 2,5 g/l, pH 7,3  Mơi trường thí nghiệm: Eugon Broth cho vi khuẩn Myco phil cho nấm  Phương pháp tiến hành đọc kết quả: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định để đánh giá hoạt tính kháng sinh mẫu chiết tiến hành phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp đại Vander Bergher Vlietlinck (1991), áp dụng trường đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ Bước 1: Sàng lọc sơ tìm mẫu (chất) có hoạt tính  Chuẩn bị vi sinh vật: Nấm trì mơi trường dinh dưỡng nêu phần nguyên liệu phương pháp Các chủng kiểm định hoạt hóa trước tiến hành thử nghiệm môi trường dinh dưỡng dịch thể đặc biệt (24 vi khuẩn, 48 nấm) Sau pha lỗng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland để tiến hành thí nghiệm  Chuẩn bị mẫu thử:  Hòa tan chiết phẩm dung dịch DMSO 100% máy Vortex với nồng độ – 10 mg/ml  Từ dung dịch gốc nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng, giếng 10 l mẫu  Nhỏ vào giếng có mẫu sẵn 190 l vi sinh vật hoạt hóa  Đối chứng dương: Dãy 1: Môi trường Dãy 2: Kháng sinh + vi sinh vật kiểm định  Đối chứng âm: có vi sinh vật kiểm định  Để tủ ẩm 370C/ 24 vi khuẩn 300C/ 48 nấm  Đọc kết quả: Mẫu dương tính nhìn mắt thường thấy suốt, khơng có vi sinh vật phát triển, giống hình ảnh giếng chứng âm tính Mẫu dương tính bước tiếp tục thử bước để tính giá trị MIC (Minimmum Inhibitory Concentration) SVTH 27 Đồ án tốt nghiệp GVHD Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimmum Inhibitory Concentration) mẫu (chất) có hoạt tính:  Các bước tiến hành bước 1: Riêng mẫu có biểu dương tính bước pha loãng theo thang nồng độ thấp dần, từ (5 – 10) thang nồng độ để tính giá trị ức chế tối thiểu mà vi sinh vật bị ức chế phát triển gần hoàn tồn  Đọc kết quả:  Nồng độ dương tính khơng có vi sinh phát triển Khi nuôi cấy lại nồng độ môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU (Colony Forming Unit) <  Mẫu thơ có MIC ≤ 200 g/ml, mẫu tinh có MIC ≤ 50 g/ml có hoạt tính Quy trình đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay)  Nguyên liệu:  Dòng tế bào  Dòng KB (Human epidemoid carcinoma – Ung thư biểu mơ) từ phịng thí nghiệm Bioassay trường Đại học Dược Illinois – USA  Dòng FL (Fibril sarcoma of Uteus – Ung thư màng tử cung)  Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma – Ung thư gan) từ Viện VSDT Trung ương  Môi trường nuôi cấy tế bào:  D’MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) môi trường Dullbecco cải tiến từ môi trường E’MEM (Eagle’s Minimal Essential Medium) sử dụng chủ yếu việc nuôi cấy tế bào, đặc biệt tế bào gốc Nó có nồng độ amino acid cao gấp đôi nồng độ vitamin cao gấp bốn môi trường E’MEM, tối ưu cho việc ni cấy tế bào có mật độ cao Chính mà D’MEM mơi trường thương phẩm thích hợp cho nuôi cấy nhiều loại tế bào động vật Hoặc thay mơi trường D’MEM mơi trường MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) Có bổ sung L-glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (PenixillinStreptomycin sulfate-Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum)  Tripsin  EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic Acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic  Các dụng cụ dùng lần: Bình ni cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, đầu tip cho micropipet,… SVTH 28 Đồ án tốt nghiệp GVHD  Chất chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả diệt tế bào: Elipticine Colchicine pha DMSO với nồng độ 0,01 mM  Mẫu sinh vật biển: Mẫu biển chuẩn bị theo quy trình thống xây dựng theo khn khổ đề tài KC09.15 KC09.09/06-10  Tủ ấm CO2, tủ lạnh sâu -840C, tủ lạnh thường, máy li tâm, máy đọc Eliasa; Box Laminar PII, bình Nitơ lỏng, cân phân tích, máy đo pH, buồng đếm tế bào, kính hiển vi soi ngược  Phương pháp tiến hành đọc kết quả:  Theo phương pháp Skehan & cộng (1990) Likhiwitayawuid cộng (1993) áp dụng Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ  Dòng tế bào giữ Nitơ lỏng, đánh thức trì mơi trường có bổ sung huyết bê tươi – 10% Hịa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% ( – 10 mg/ml) cho bước sàng lọc sơ  Pha 10 thang nồng độ cho bước để tính giá trị IC50  Tế bào nuôi cấy cho phát triển tới mức 60 – 70%, thay mơi trường để hoạt hóa tế bào từ 18 – 24 giờ, lúc tế bào sẵn sàng để thực thí nghiệm  Tế bào xử lý Tripsin 0,1% cho tách khỏi đáy bình Hịa dung dịch huyền phù tế bào mơi trường sạch, rửa đếm số lượng, pha tế bào nồng độ 3x104 tế bào/ml dòng KB, 4x104 tế bào/ml dòng FL  Thêm vào giếng có chất chuẩn bị sẵn 190 l dung dịch huyền phù tế bào  Phiến ủ tủ CO2 thêm ngày  Kết thúc thí nghiệm: Tế bào ủ ngày cố định dung dịch TCA lạnh (30 – 50%) Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% acid acetic 1% rửa lại acid acetic để lại mẫu thừa; để khô, hòa lại dung dịch đệm Tris base 10 mM  Đọc máy ELISA bước sóng 495 – 515 nm SVTH 29 Đồ án tốt nghiệp GVHD  Tính kết quả:  Giá trị CS: Là khả sống sót tế bào nồng độ chất thử tính theo % so với đối chứng Dựa kết đo chúng OD (ngày 0), DMSO 10% so sánh với giá trị mật độ quang OD (Optical Density) trộn để tìm giá trị CS (%) theo công thức: ( ) ( ( ) ) ( )  Giá trị CS% sau tính theo cơng thức trên, đưa vào tính tốn Excel để tìm % trung bình  độ lệch chuẩn phép thử lặp lại lần theo công thức Ducan sau: Độ lệch chuẩn  √ ∑( ̅)  Các mẫu có biểu hoạt tính (CS < 50%) chọn để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50  Giá trị IC50: Dùng giá trị CS 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table Curve theo thang giá trị logarit đường cong phát triển tế bào nồng độ chất thử để tính giá trị IC50 Giá trị IC50 ≤ 20 g/ml mẫu thô ≤ g/ml mẫu chất coi mẫu có hoạt tính Cơng thức: Trong đó: Y: Nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%) SVTH 30 Đồ án tốt nghiệp GVHD Chƣơng KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ SVTH 31 Đồ án tốt nghiệp GVHD KẾT LUẬN Qua thời gian thực đề tà tốt nghiệp, nội dung mà đồ án thực gồm: Tìm hiểu đặc điểm, phân loại, phân bố, ứng dụng số loài biển thuộc bốn phổ biến Việt Nam là: Bộ Forcipulatida có  Họ Asteridae có lồi biển: Asterias forbesi, Asterias rubens  Họ Pisasteridae có lồi biển Pisaster ochraceus (Sao biển tía) Bộ Valvatida có họ Oreasteridae, Ophidiasteridae, Archasteridae Acanthasteridae  Họ Archasteridae có lồi biển Archaster typicus  Họ Ophidiasteridae có lồi biển Linckia laevigata (Sao biển xanh)  Họ Acanthasteridae có lồi biển Acanthaster planci (Sao biển gai)  Họ Oreasteridae có lồi biển: Culcita novaeguineae (Sao biển gối), Protoreaster nodosus (Sao biển chocolate chip) Bộ Paxillosida có họ Astropectinidae  Lồi biển Astropecten polyacanthus Bộ Spinulosida có họ Echinasteridae  Lồi biển Echinaster luzonicus Tìm hiểu quy trình cơng nghệ sản xuất sản phẩm từ biển  Qua tìm hiểu quy trình sản xuất biển khơ Ngun liệu  Rửa  Làm khô  Ngâm rượu  Làm khô  Thành phẩm Sản phẩm làm thường dùng để làm quà lưu niệm hay trang trí nội thất,…  Cũng như, tìm hiểu quy trình chiết tách sàng lọc hoạt tính sinh học hợp chất sinh học từ biển Nắm bước để xử lấy mẫu chiết tách hợp chất từ mẫu biển nói riêng mẫu sinh vật biển nói chung Ngồi ra, cịn biết loại hoạt tính sinh học thường dùng để sàng lọc hoạt tính sinh học là:  Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial Activity assay)  Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay)  Hoạt tính chống oxy hóa mẫu sinh vật biển thông qua phản ứng bao vây gốc tự DPPH (Antioxidant activity assay – DPPH free radical scavenging)  Hoạt tính chống lỗng xương thơng qua chế kích thích khác biệt hóa ngun bào xương MC3T3-E1  Hoạt tính kháng NF-B SVTH 32 Đồ án tốt nghiệp GVHD Do thời gian thực hiện, tìm hiểu có giới hạn nên đồ án trình bày quy trình đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial Activity assay) quy tình đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay) ĐỀ NGHỊ Qua trình thực đề tài, em nhận thấy quan tâm nước đến lồi biển cịn Việc thống kê số lượng bộ, họ, lồi cịn tìm hiểu đặc điểm, phân loại, phân bố lồi Chỉ có vài nghiên cứu tập trung khai thác hợp chất từ biển để ứng dụng y học (sản xuất thực phẩm chức năng) Nguồn hải sản biển nguồn lợi mà thiên nhiên ban tặng cho nước với số lượng loài đa dạng (khoảng 60 lồi) Việc tìm hiểu sâu loài biển nước ta giúp biết lồi tốt để tìm hướng khai thác cịn lồi có ảnh hưởng khơng tốt đến sức khỏe người mơi trường sinh thái cần phải cảnh báo để người dân biết phịng tránh Bên cạnh đó, việc sử dụng biển dùng làm mặt hàng mỹ nghệ sử dụng biển theo cách dân gian ngâm rượu biển cịn sử dụng dạng thực phẩm vừa lạ, vừa tốt cho sức khỏe SVTH 33 Đồ án tốt nghiệp GVHD TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đào Tấn Hổ, 1994 Danh mục động vật da gai Việt Nam, Tập I, NXB Khoa học kỹ thuật [2] GS.TS Châu Văn Minh (2009), Nghiên cứu sàng lọc chất có hoạt tính sinh học theo định hướng kháng sinh, gây độc tế bào chống ơxy hóa từ sinh vật biển nhằm tạo sản phẩm có giá trị dược dụng, Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội SVTH 34 ... tốt nghiệp GVHD Chƣơng TÌM HIỂU CÁC QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC SẢN PHẨM TỪ SAO BIỂN SVTH 19 Đồ án tốt nghiệp GVHD 2.1 Tìm hiểu quy trình sản xuất biển khơ 2.1.1 Sơ đồ quy trình sản xuất. .. Bài đồ án dựa thống kê tài liệu liên quan đến đặc trưng đặc điểm, phân loại, phân bố ứng dụng loài biển nước ta tìm hiểu số quy trình sản xuất sản phẩm từ biển áp dụng thực việc tạo sản phẩm. .. SVTH VI Đồ án tốt nghiệp GVHD Chƣơng TÌM HIỂU CÁC LOÀI SAO BIỂN Ở VIỆT NAM SVTH Đồ án tốt nghiệp GVHD 1.1 Giới thiệu chung biển  Việt Nam có bờ biển tiếp liền với Biển Đông Đường bờ biển dài