Nghiên cứu triển khai phương pháp pcr phát hiện enterobacter sakazakii trong sữa công thức và các sản phẩm dinh dưỡng dành cho trẻ dưới 12 tháng tuổi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG THÙY LINH NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Enterobacter sakazakii TRONG SỮA CÔNG THỨC VÀ CÁC SẢN PHẨM DINH DƯỠNG DÀNH CHO TRẺ DƯỚI 12 THÁNG TUỔI LUẬN VĂN THẠC SĨ Y TẾ CƠNG CỘNG TP Hồ Chí Minh – Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG THÙY LINH NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Enterobacter sakazakii TRONG SỮA CÔNG THỨC VÀ CÁC SẢN PHẨM DINH DƯỠNG DÀNH CHO TRẺ DƯỚI 12 THÁNG TUỔI Chuyên ngành: Y tế Công cộng Mã số : 60720301 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y TẾ CÔNG CỘNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đặng Văn Chính TP Hồ Chí Minh – Năm 2017 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan số liệu luận văn đƣợc ghi nhận, nhập liệu phân tích cách trung thực Luận văn khơng có số liệu, văn bản, tài liệu đƣợc Đại học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh hay trƣờng đại học khác chấp nhận để cấp văn đại học, sau đại học Luận văn khơng có số liệu, văn bản, tài liệu đƣợc công bố trừ đƣợc công khai thừa nhận Học viên Đặng Thùy Linh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU DÀN Ý NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Y VĂN 1.1 Sơ lƣợc Enterobacter sakazakii 1.1.1 Lịch sử phát 1.1.2.1 Đặc điểm chung 1.1.2.2 Đặc điểm sinh vật hóa học 1.1.3 Cơ chế gây bệnh 1.2 Tình hình nhiễm E sakazakii 1.2.1 Thế giới 1.2.2 Việt Nam 10 1.3 Phƣơng pháp phát E sakazakii sản phẩm dinh dƣỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12 tháng tuổi 10 1.3.1 Phƣơng pháp nuôi cấy 10 1.3.2 Phƣơng pháp phát nhanh E.sakazakii 10 1.4 Sơ lƣợc phƣơng pháp PCR 16 1.4.1 PCR gì? 16 1.4.2 Nguyên tắc phƣơng pháp PCR 16 1.4.3 Vai trò mồi (primer) 17 1.4.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 18 1.4.5 Các nguyên tắc ứng dụng phƣơng pháp PCR để xét nghiệm vi sinh thực phẩm 19 1.4.6 Một số ứng dụng PCR y học 20 1.5 Xác định giá trị sử dụng phƣơng pháp 23 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1 Thiết kế nghiên cứu 25 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 25 2.2.1 Thời gian 25 2.2.2 Địa điểm 25 2.3 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.3.1 Số lƣợng mẫu dùng để khảo sát thông số theo ISO 16140: 2003 NordVal 2009 26 2.3.2 Phƣơng pháp chọn mẫu 26 2.3.3 Tiêu chuẩn chọn mẫu 27 2.4 Phƣơng pháp phát E sakazakii kỹ thuật nuôi cấy 27 2.4.1.Nguyên tắc 27 2.4.2 Tiến hành thử nghiệm 27 2.4.2.1 Chuẩn bị mẫu thử 28 2.4.2.2 Tiền tăng sinh 28 2.4.2.3 Tăng sinh chọn lọc 28 2.4.2.4 Phân lập E sakazakii giả định 28 2.4.2.5 Ðịnh danh 29 2.4.2.6 Xác định tính chất sinh vật hố học 31 2.4.2.7 Diễn giải kết thử nghiệm định danh 33 2.5 Phƣơng pháp PCR phát E sakazakii 34 2.5.1 Hóa chất 34 2.5.2 Thiết bị 35 2.5.3 Cách tiến hành 37 2.5.3.1 Tách chiết DNA vi khuẩn phƣơng pháp đun sôi 37 2.5.3.2 Phản ứng nhân gen PCR 37 2.5.4 Xác định giá trị sử dụng phƣơng pháp PCR 38 2.5.4.1 So sánh phƣơng pháp PCR so với phƣơng pháp nuôi cấy 38 2.5.4.2 Khảo sát LOD50 38 2.6 Phƣơng pháp xử lý phân tích số liệu 42 2.7 Cách hạn chế sai số 42 2.8 Y Đức 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43 3.1 Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi thông số phản ứng PCR 43 3.2 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp 44 3.3 Xác định giá trị phƣơng pháp PCR phát E sakazakii so sánh với phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống (ISO 16140: 2003) 45 3.3.1 Kết khảo sát giới hạn phát 50 (LOD50) phƣơng pháp PCR so với phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống 45 3.3.2 Kết khảo sát thông số kỹ thuật phƣơng pháp PCR so với phƣơng pháp nuôi cấy 50 3.4 Khảo sát xác định thời gian tăng sinh tối thiểu cần thiết cho việc phát vi khuẩn E sakazakii 59 3.5 Áp dụng phƣơng pháp PCR để phát E sakazakii số sản phẩm dinh dƣỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12 tháng tuổi bán thành phố Hồ Chí Minh 60 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 64 4.1 Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi 65 4.2 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp cặp mồi 66 4.3 Xác định giá trị phƣơng pháp PCR phát E sakazakii so sánh với phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống (ISO 16140: 2003) 66 4.3.1 Kết khảo sát giới hạn phát 50 (LOD50) phƣơng pháp PCR so với phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống 66 4.3.2 Kết khảo sát thông số kỹ thuật phƣơng pháp PCR so với phƣơng pháp nuôi cấy 66 KẾT LUẬN 69 ĐỀ XUẤT 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO i PHỤ LỤC I: TÓM TẮT SƠ ĐỒ PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRUYỀN THỐNG vii PHỤ LỤC II: TÓM TẮT SƠ ĐỒ PHƢƠNG PHÁP PCR viii PHỤ LỤC III: MÔI TRƢỜNG THUỐC THỬ ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADH Tiếng Anh Tiếng Việt Arginine DeHydrogenase Môi trƣờng canh thang L-Arginine dehydrolase ATTC American type culture colection Bộ chủng chuẩn nuôi cấy từ Mỹ AUC Area under the curve Diện tích dƣới đƣờng cong AC Accuracy Độ xác BHI Brain Heart Infusion broth Môi trƣờng canh thang BPW Buffered peptone water Môi trƣờng canh thang pepton đệm Bộ Y tế BYT CFU Colony Forming Unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc DNA Deoxyribonucleic Acid Phân tử acid nucleic mang thông tin di truyền DIF Môi trƣờng thạch chọn lọc Druggan-Forsythe-Iversen formulation FDA Food And Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Hoa Kỳ FISH Fluorescence in situ hybridization Lai tạo huỳnh quang chỗ FN False negatives Tỷ lệ âm tính giả FP False positives Tỷ lệ dƣơng tính giả HIV Human Immunodeficiency Virus Vi rút gây suy giảm miễn dịch ngƣời ISO International Organization Standardization For Tổ chức tiêu chuẩn hoá Quốc Tế Tiếng Anh Khuẩn lạc KL LDC Tiếng Việt Lysine Decarboxylase Môi trƣờng canh thang L-Lysine decarboxylase LOD Limits Of Detection Giới hạn phát ODC Ornithine Decarboxylase Môi trƣờng canh thang L-Ornithine decarboxylase ompA Outer membrane protein A Protein màng tế bào vi khuẩn PCR Polymerase Chain Reaction PNA Peptide nucleic acid Quy chuẩn Việt Nam QCVN ROC Receiver Operating Characteristic Sinh vật hóa học SVHH SC Phản ứng khuếch đại gen Simon Citrate Agar Môi trƣờng thạch Simon citrate SE Sensitivity Độ nhạy SP Specificity Độ đặc hiệu Tiêu Chuẩn Việt Nam TCVN TSA Tryptone Soya Agar Môi trƣờng thạch tryptone từ đậu nành WHO World Health Organization Tổ Chức Y Tế Thế Giới i TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y Tế (2012) Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia ô nhiễm vi sinh vật thực phẩm Sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12 tháng tuổi Trần Cao Sơn (2010) Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr 64-65 Đỗ Thị Thanh Thủy (2015) Ứng dụng sinh học phân tử bệnh lý nhiễm trùng (Sinh học phân tử bản), Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh, 112 Trần Linh Thƣớc (2010) Xây dựng quy trình chế tạo Kit PCR (Polymerse chain reaction) để xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh, gây ngộ độc thực phẩm Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh, 39-42 Văn phịng cơng nhận chất lƣợng (2016) u cầu bổ sung để cơng nhận phịng thử nghiệm lĩnh vực vi sinh Phạm Hùng Vân (2009) PCR real- time PCR Các vấn đề áp dụng thường gặp, Nhà xuất y học, 9-10 TIẾNG ANH Arseni A, Malamou-Ladas E, Koutsia C Xanthou M, Trikka E (1987) Outbreak of colonization of neonates with Enterobacter sakazakii Alispahic M, Hummel K, Jandreski-Cvetkovic D, Nöbauer K, RazzaziFazeli E, Hess M, Hess C (2010) "Species-specific identification and differentiation of Arcobacter, Helicobacter and Campylobacter by fullspectral matrix-associated laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry analysis" J Med Microbiol 59, 295-301 Almeida C., AzevedoN F., IversenC., FanningS., KeevilC W., and Vieira M J (2009) "Development and Application of a Novel Peptide Nucleic Acid Probe for the Specific Detection of Cronobacter Genomospecies (Enterobacter sakazakii) in Powdered Infant Formula" 75, (9), 29252930 10 Amann R, Fuchs BM (2008) "Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques" Nat Rev Microbiol., 6, 339-348 11 Bar -Oz B, Preminger A, Peleg O, Block C, Arad I (2001) "Enterobacter sakazakii infection in the newborn" Acta Pedia, 90, 356-358 ii 12 Baumgartner, A., M Grand, M Liniger, and C Iversen (2009) "Detection and frequency of Cronobacter spp (Enterobacter sakazakii) in different categories of ready-to-eat foods other than infant formula" Int J Food Microbiol, 136, 189-192 13 Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (2011), FDA and CDC Update: Investigation of Cronobacter bacteria illness in infants, https://www.cdc.gov/media/releases/2011/s1230_Cronobacter.html, 15/5/2017 14 Centers for Disease Control and Prevention (2001) Enterobacter sakazakii Infections Associated with the Use of Powdered Infant Formula 15 Fakruddin M, Rahaman MM, Ahmed MM, Hoque MM (2013) "Cronobacter sakazakii (Enterobacter sakazakii): An Emerging Food borne Pathogen" 16 FAO /WHO (2008) Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) in powdered follow-up formulae— Meeting Report Microbiological Risk Assessment 17 Farber JM (2004) "Enterobacter sakazakii- new foods for thought?" Lancet, 363, 5-6 18 Farmer JJI, Asbury MA, Hickmann FW, Brenner DJ (1980) " Enterobacter sakazakii: a new species of ―Enterobacteriaceae‖ isolated from clinical specimens" Int J Syst Bacteriol, 30, 569-84 19 FDA U S Food and Drug Administration (2002) Health Professionals Letter on Enterobacter sakazakii Infections Associated with Use of Powdered (Dry) Infant Formulas in Neonatal Intensive Care Units Silver Spring, MD: U.S Food and Drug Administration 20 Freiwald A, Sauer S (2009) "Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry" Nat Protoc 4, 732742 21 Friedemann M (2009) "Epidemiology of invasive neonatal Cronobacter (Enterobacter sakazakii) infections" Eur J Clin Microbiol Infect Dis 28, (11), 1297-1304 22 Gurtler JB, Kornacki JL, Beuchat LR (2005) "Enterobacter sakazakii: a coliform of increased concern to infant health" Int J Food Microbiol 104, 1-34 23 Holland RD, Wilkes JG, Rafii F, Sutherland JB (1996) "Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.Rapid Commun Mass Spectrom 10" 1227-1232 24 ICMSF International Commission on Microbiological specification for Foods (2002) Microbiological testing in food safety management.In: Microrganisms in foods New York: Kluwer cademic/Plenum Publishers iii 25 International Organization For Standardization (ISO 16140) (2003) Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods 26 Iversen C, Forsythe S (2004) "Isolation of Enterobacter sakazakii and other Enterobacteriaceae from powdered infant formula milk and related products." Food Microbiol 2004;21:771–777 27 Iversen C, Lehner A, Mullane N, Bidlas E, Cleenwerck I, Marugg J, Fanning S, Stephan R, Joosten H (2007) "The taxonomy of Enterobacter sakazakii: proposal of a new genus Cronobacter gen nov and descriptions of Cronobacter sakazakii comb nov Cronobacter sakazakii subsp sakazakii, comb nov., Cronobacter sakazakii subsp malonaticus subsp nov., Cronobacter turicensis sp nov., Cronobacter muytjensii sp nov., Cronobacter dublinensis sp nov and Cronobacter genomospecies 1" BMC Microbiol., Evol Biol 7, pp 64 28 Iversen C, et al (2004b) "The growth profile, thermotolerance and biofilm formation of Enterobacter sakazakii grown in infant formula milk." Letters in Applied Microbiology 38, 378–382 29 Iversen C, Forsythe S (2003) "Risk profile of Enterobacter sakazakii, an emergent pathogen associated with infant milk formula" Trends in Food Sci and Technol, 14, 443-454 30 Iversen C, Forsythe S.J (2004) "Isolation of Enterobacter sakazakii and other Enterobacteriaceae from powdered infant formula milk and related products" Food Microbiology 21, 771–776 31 Jackson EE, Flores JP, Fernández-Escartín E, Forsythe SJ (2015) "Reevaluation of a Suspected Cronobacter sakazakii Outbreak in Mexico" 32 Jalal Mardaneh, Mohammad Mehdi Soltan Dalla (2016) "Study of Cronobacter sakazakii Strains Isolated from Powdered Milk Infant Formula by Phenotypic and Molecular Methods in Iran" 33 Joseph S, Forsythe S (2012) "Insights into the emergent bacterial pathogen Cronobacter spp, generated by multilocus sequence typing and analysis" PMID, 3, (3) 34 Judy S Way, Karen l Josephson, Suresh D Pillai, Morteza abbaszadegan, Charles P Gerba, and Ian L Pepper (1993) "Specific detection of Salmonella spp by multiplex polymerase chain reaction" Appl Environ Microbiol., 59, (5), 1473-1479 35 Jung Beom Kim, et al (2008) Surveillance of Stool Samples for the Presence of Enterobacter sakazakii among Korean People Yonsei Med J 36 Keyser M, Witthuhn R C, Ronquest L C and Britz T J (2003) "Treatment of winery effluent with upflow anaerobic sludge blanket (UASB)granular sludges enriched with Enterobacter sakazakii." Biotechnology Letters 25, 1893–1898 iv 37 Krishnamurthy T, Ross PL, Rajamani U (1996) "Detection of pathogenic and non-pathogenic bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry Rapid Commun Mass Spectrom 10" 883-888 38 Kucerova E, Clifton S, Xia X-Q, Long F, Porwollik S, Fulton L, Fronick C, Minx P, Kyung K, Warren W, Fulton R, Feng D, Wollam A, Shan N, Bhonagiri V, Nash WE, Hallsworth (2010) "Genome sequence of Cronobacter sakazakii BAA-894 and comparative genomic hybridization analysis with other Cronobacter species" PLoS One 2010, 5, A51–A60 39 Lai KK (2001) "Enterobacter sakazakii infections among neonates, infants, children and adults" Medicine 2001, 80, 113–122 40 Lampel KA, Chen Y (2009) Method for the isolation and detection of Enterobacter sakazakii (Cronobacter) from powdered infant formula, pp 179-184 41 Li Zhen, Ge Wupeng, Li Keting, et al (2016) "Prevalence and Characterization of Cronobacter sakazakii in Retail Milk-Based Infant and Baby Foods in Shaanxi, China" Foodborne Pathogens and Disease, 13, (4), 221-227 42 Lin M C., A H Huang, H Y Tsen, H C Wong, and T C Chang (2005) "Use of Oligonucleotide Array for Identification of Six Foodborne Pathogens and Pseudomonas aeruginosa Grown on Selective Media" Journal of Food Protection, 68, (11), 2278-2286 43 Liu Y, Cai X, Zhang X, Gao Q, Yang X, et al (2006) "Real time PCR using TaqMan and SYBR Green for detection of Enterobacter sakazakii in infant formula" J Microbiol Meth 65, 21-31 44 Masaki H, Asoh N, Tao M, et al (2001) "Detection of gram-negative bacteria in patients and hospital environment at a room in geriatric wards under the infection control against MRSA [in Japanese] " Kansenshogaku Zasshi, 75:144–50 45 Mittal R, Wang Y, Hunter CJ, Gonzalez I, Prasadarao NV (2009) "Brain damage in newborn rat model of meningitis by Enterobacter sakazakii: a role for outer membrane protein A" Lab Invest, 89, 263–277 46 Mozrova´ V, Brˇenˇova´ N, Mra´zek J, Lukesˇova´ D, Marounek M (2014) "Surveillance and characterization of Cronobacter spp in Czech retail food and environmental samples" Folia Microbiol, 59, 63-68 47 Mullane NR, Murray J, Drudy D, Prentice N, Whyte P, Wall PG, Parton A, Fanning S (2006) "Detection of Enterobacter sakazakii in Dried Infant Milk Formula by Cationic-Magnetic-Bead Capture" 72, (9), 6325-6330 48 Muytjens, et al (1988) "Quality of powdered substitutes for breast milk with regard to members of the family Enterobacteriaceae." J Clin Microbiol, 26, 743–746 v 49 Manoj Kumar Mohan Nair, Kumar S Venkitanarayanan (2006) "Cloning and Sequencing of the ompA Gene of Enterobacter sakazakii and Development of an ompA-Targeted PCR for Rapid Detection of Enterobacter sakazakii in Infant Formula Applied and environmental microbiology" 72, (No.4), p 2539-2546 50 NordVal -NMKL (2009) Protocol for the validation of the alternative microbiological method 51 Osaili T, Forsythe S (2009) "Desiccation resistance and persistence of Cronobacter species in infant formula" Int J Food Microbiol 2007, 136, (2), 214–20 52 Ray P, Gautam V, Jain N, Narang A, Sharma M (2007) " Enterobacter sakazakii in infants: novel phenomenon in India " Indian J of Med Microbiol, 25, (4), 408-410 53 Riedel K, Lehner A (2007) " Identification of proteins involved in osmotic stress response in Enterobacter sakazakii by proteomics" Proteomics, 7, 1217-1231 54 Roger Stephan, Dominik Ziegler, Valentin Pfluăger, Guido Vogel, and Angelika Lehner (2010) "Rapid genus- and species-specific identification of Cronobacter spp by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry" J Clin Microbiol, 48, 2846-2851 55 Seo KH, Brackett RE (2005) "Rapid, specific detection of Enterobacter sakazakii in infant formula using a real-time PCR assay" J Food Prot 68, 59-63 56 Shruti Shukla, Gibaek Lee, Xinjie Song, Jung Hyun Park, Hyunjeong Cho, Eun Ju Lee, Myunghee Kim (2016) Detection of Cronobacter sakazakii in powdered infant formula using an immunoliposome-based immunomagnetic concentration and separation assay Scientific Reports 57 Shukla S, Lee G, X Song, Park S, & Kim M (2016) "Immunoliposomebased immunomagnetic concentration and separation assay for rapid detection of Cronobacter sakazakii" Biosens Bioelectron, 77, 986– 994 58 Stender H, Fiandaca M , Hyldig-Nielsen JJ , Coull J (2002) "PNA for rapid microbiology" J Microbiol Biotechnol., Methods 48, 1-17 59 Townsend S, Hurrell E, Forsythe S (2008) "Virulence studies of Enterobacter sakazakii isolates associated with a neonatal intensive care unit outbreak" BMC Microbiol , 8, 64 60 Urmenyi A.M.C, Franklin A.W (1961) "Neonatal death from pigmented coliform infection." Lancet 11, 313–315 61 Wanyi Chen, Lianzhong Ai, Jielin Yang, Jing Ren, Yunfei Li, Benheng Guo (2013) "Development of a PCR assay for detection of Cronobacter vi spp from food" Canadian Journal of Microbiology, 59, (No 10), pp 656-661 62 Xian Quan Cai, Hai-Qiong Yu, Zhou-Xi Ruan, Lei-Liang Yang, JianShan Bai, De-Yi Qiu, Zhi-Hua Jian, Yi-Qian Xiao, Jie-Yang Yang, Thanh Hoa Le, Xing-Quan Zhu (2013) "Rapid Detection and Simultaneous Genotyping of Cronobacter spp (formerly Enterobacter sakazakii) in Powdered Infant Formula Using Real-time PCR and High Resolution Melting (HRM) Analysis" 8, (6) 63 Yingli Chen, Xiaoyan Ma, Xunzhe Zhang, Yu Wang, Xianzhou Zhang, Wei Zhang, and Ning Yuan (2016) "Detection of Cronobacter sakazakii in Powdered Infant Formula using Real-time Fluorescence Single Primer Isothermal Amplification" Advance Journal of Food Science and Technology 12, (12), 688-697 vii PHỤ LỤC I TÓM TẮT SƠ ĐỒ PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRUYỀN THỐNG Sữa 10g/90 ml BPW 37oC±1/18±2h 0,1 ml+ 10 ml LST/vacomycin 44oC±0,5/24±2h ESIA: KL màu xanh Chọn cấy TSA ESIA 44oC±1/24±2h TSA TSA: KL màu vàng 25oC±1/44-48h Oxydase + Dừng - SVHH LDC (-) ODC (+) ADH (+) 30oC±1/24±2h Đƣờng: SC (+) D-sorbitol (-), L-rhamnose (+) D-sucrose (+), D-melibiose (+) Amygdaline (+) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn viii PHỤ LỤC II TĨM TẮT SƠ ĐỒ PHƢƠNG PHÁP PCR 10g sữa + 90 ml BPW 37oC/10h Thu 1ml dịch tăng sinh, Ly tâm 15.000v/5phút, Loại bỏ dịch Thêm 100μl đệm TE Đun sôi 100°C/10 phút Ngâm đá/5 phút Ly tâm 14.000 v/10phút Thu dịch nỗi μl dịch + master mix Phản ứng PCR Điện di sản phẩm PCR Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 95oC/5 phút, 35 chu kỳ (94oC/30s, 62oC/30s, 72oC/ 30 s) Duy trì 72oC/10 phút ompA (469 bp) ix PHỤ LỤC III MÔI TRƯỜNG THUỐC THỬ DỤNG CỤ - THIẾT BỊ 1.1 Dụng cụ - Chai Dural 500ml - Ðĩa Petri với đƣờng kính 90-100mm - Ống nghiệm loại - Pippet 1ml - Ống đong 500ml - Cốc có mỏ 50ml, 250ml, 500ml - Bình cồn - Micropippet 100 - 1000l - Muỗng inox, panh dao, kéo inox - Túi nilon vô trùng - Bộ phân phối mơi trƣờng - Que cấy vịng (đƣờng kính vịng 3mm) que cấy thẳng platinum/iridium nickel/chrom Thiết bị - Tủ ủ 25± 1oC - Bể điều nhiệt 44± 0,5oC - Tủ ủ 30 ± 1oC - Lị vi sóng - Tủ ấm 44 ± 1oC - Tủ cấy vô trùng - Máy dập mẫu - Lò hấp ƣớt - Máy trộn mẫu - Tủ sấy khô tiệt trùng - Máy vortex - Cân phân tích - Máy đo pH với độ xác hiệu chuẩn ± 0,1 đơn vị pH 25OC MÔI TRƢỜNG, THUỐC THỬ Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn x 2.1 Nƣớc pepton đệm (Buffered peptone water- BPW) Thành phần Enzymatic digest of casein 10g NaCl 5g Na2HPO4.12H2O 9g KH2PO4 1,5g Nƣớc cất 1000ml Chuẩn bị Hoà tan thành phần nƣớc cách đun nóng cần Chỉnh pH 7,0 ± 0,2 25oC Phân phối vào bình ống nghiệm có dung tích thích hợp cần cho phép thử Hấp tiệt trùng 121oC/20phút 2.2 Môi trƣờng canh thang Lauryl sulfate tryptose biến đổi (mLST)/vancomycin 2.2.1 Môi trƣờng canh thang Lauryl sulfate tryptose biến đổi (mLST) Thành phần Sodium chloride (NaCl) 34g Enzyme digest of animal and plant tissue 20g Lactose Potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 5g 2,75g Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 2,75g Sodium lauryl sulfate Nƣớc cất 0,1g 1000ml Chuẩn bị Hoà tan thành phần nƣớc cách đun nóng cần Chỉnh pH 6,8 ± 0,2 25oC Phối 10ml mLST vào ống nghiệm Hấp tiệt trùng 121oC 15 phút 2.2.2Dung dịch Vancomycin Thành phần Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn xi Vancomycin 10mg Nƣớc cất 10ml Chuẩn bị Hoà tan vancomycin nƣớc lắc đều.Lọc vô trùng màng lọc 0,2 µm Bảo quản 0-5oC 15 ngày 2.2.2Mơi trƣờng mLST/ vancomycin hoàn chỉnh Thêm 0,1ml dung dịch vancomycin vào 10ml mLST để nồng độ vancomycin cuối 10µg/ml mơi trƣờng mLST Mơi trƣờng mLST/vancomycin hồn chỉnh đƣợc bảo quản 0-5oC ngày 2.3.Môi trƣờng thạch Enterobacter sakazakii isolation agar (ESIA TM) Thành phần Panceatic peptone of casein 7g Yeast extract 3g Sodium chloride (NaCl) 5g Sodium desoxycholate 0,6g 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl α-D-glucopyranoside0,15g Crystal violet Agar 2mg 12 đến18g (tùy thuộc vào sức đông thạch) Nƣớc cất1000ml Chuẩn bị Hồ tan thành phần mơi trƣờng hồn chỉnh nƣớc cách đun nóng Nếu cần, chỉnh pH 7,0 ± 0,2 25oC Hấp tiệt trùng 121oC 15 phút Làm nguội 44-47oC, đổ 15 ml thạch ESIATM vào đĩa petri vô trùng Bảo quản từ 0-5oC 14 ngày 2.4.Tryptone soya agar (TSA) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn xii Thành phần Enzyme digest of casein 15g Enzyme digest of soya 5g Sodium chloride (NaCl) 5g Agar 9-18g Nƣớc cất 1000ml Chuẩn bị Hoà tan thành phần mơi trƣờng hồn chỉnh nƣớc cách đun nóng Nếu cần, chỉnh pH đạt 7,3 ± 0,2 25 oC Hấp tiệt trùng 121oC 15 phút Làm nguội 44 - 47oC, đổ 15 ml thạch TSA vào đĩa petri vô trùng 2.5.Môi trƣờng thuốc thử dùng cho xác định tính chất sinh vật hóa học 2.5.1 Thuốc thử dùng cho phát oxidase Thành phần N, N, N’,N’-tetramethyl-p- 1g phenylenediamid dihydrochloride (C10H16 N22HCl) Nƣớc cất 100ml Chuẩn bị Hòa tan thành phần nƣớc trƣớc sử dụng 2.5.2 Môi trƣờng canh thang L- Lysine decacboxylase Thành phần L-lysin monohydrochloride 5g Yeast extract 3g Glucose 1g Bromocresol purple 0,015g Nƣớc cất 1000 ml Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn xiii Chuẩn bị Hòa tan thành phần mơi trƣờng hồn chỉnh nƣớc Nếu cần chỉnh pH để sau khử trùng pH đạt 6,8 ±0,2 25 oC Phân phối ml môi trƣờng vào ống nghiệm có nắp vặn.Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút 2.5.3 Môi trƣờng canh thang L- Ornithine decacboxylase Thành phần L-Ornithine monohydrochloride 5g Yeast extract 3g Glucose 1g Bromocresol purple 0,015g Nƣớc cất 1000 ml Chuẩn bị Hòa tan thành phần mơi trƣờng hồn chỉnh nƣớc Nếu cần chỉnh pH để sau khử trùng pH đạt 6,8 ±0,2 25 oC Phân phối ml môi trƣờng vào ống nghiệm có nắp vặn.Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút 2.5.4 Môi trƣờng canh thang L- Arginine dihydrolation Thành phần L-arginine monohydrochloride 5g Yeast extract 3g Glucose 1g Bromocresol purple 0,015g Nƣớc cất 1000 ml Chuẩn bị Hịa tan thành phần mơi trƣờng hồn chỉnh nƣớc Nếu cần chỉnh pH để sau khử trùng pH đạt 6,8 ± 0,2 25 oC Phân phối ml môi trƣờng vào ống nghiệm có nắp vặn.Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút 2.5.5 Mơi trƣờng thử nghiệm lên men carbohydrate 2.5.5.1 Môi trƣờng Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn xiv Thành phần Enzyme digest of casein 10g Sodium chloride (NaCl) 5g Phenol red Nƣớc cất 0,02g 1000ml Chuẩn bị Hòa tan thành phần nƣớc Nếu cần chỉnh pH để sau khử trùng pH đạt 6,8±0,2 25oC Phối môi trƣờng vào chai Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút 2.5.5.2 Dung dịch carbohydrate (D-sorbitol, L-rhamnose, D-melibiose amygdaline) 80mg/ml Chuẩn bị Carbohydrate Nƣớc cất 8g 100ml Thành phần Hòa tan thành phần nƣớc Lọc vô trùng màng lọc 0,2 µm 2.5.5.3 Mơi trƣờng thử nghiệm lên men carbohydrate hồn chỉnh Thành phần Môi trƣờng 875ml Dung dịch carbohydrate 125ml Chuẩn bị Đối với carbohydrate, thêm dung dịch carbohydrate vào môi trƣờng điều kiện vô trùng trộn Phối 10ml môi trƣờng vào ống nghiệm vô trùng 2.5.6 Môi trƣờng thạch Simmon citrate Thành phần Sodium citrate 2g NaCl 5g K2HPO4 1g Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn xv NH4H2PO4 1g MgSO4 0.2g Bromthymol blue 0.08g Agar đến 18g Nƣớc cất 1000ml Chuẩn bị Hồ tan thành phần mơi trƣờng hồn chỉnh nƣớc cách đun nóng Nếu cần chỉnh pH để sau khử trùng pH đạt 6,8 ±0,2 25oC Phân phối ml môi trƣờng vào ống nghiệm có nắp vặn Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút Ðặt ống thạch tƣ nghiêng để phần thạch nghiêng dài khoảng 2,5cm 2.6 Lƣu ý -Sử dụng nƣớc cất khử khoáng tinh để pha chế môi trƣờng nuôi cấy -Nếu cần thiết, dùng dung dịch axit HCl 1M NaOH 1M để chỉnh pH -Nếu khơng sử dụng cần bảo quản môi trƣờng nuôi cấy thuốc thử tối 0-5oC vòng tháng Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... ? ?Nghiên cứu triển khai phư ng ph p PCR ph t Enterobacter sakazakii sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột dành cho trẻ đến 12 th ng tuổi? ?? 3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu tổng qu t Nghiên cứu triển. .. cứu triển khai phƣơng pháp PCR phát vi khuẩn E sakazakii sản phẩm dinh dƣỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12 tháng tuổi Mục tiêu cụ thể Nghiên cứu triển khai phƣơng pháp PCR phát E sakazakii: ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG THÙY LINH NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Enterobacter sakazakii TRONG SỮA CÔNG THỨC VÀ CÁC SẢN PHẨM DINH DƯỠNG