Khảo sát giá trị của thử nghiệm hodge và đĩa kết hợp so với kỹ thuật pcr trong phát hiện enzyme metallo beta lactamase và klebsiella pneumoniae carbapenemase ở escherichia coli và klebsiella pneumoniae

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ Tr n Thị Thu H ng KHẢO SÁT GIÁ TRỊ CỦA THỬ NGHIỆM HODGE VÀ ĐĨA KẾT HỢP SO VỚI KỸ THUẬT PCR TRONG PHÁT HIỆN ENZYME METALLO- BETA- LACTAMASE VÀ Klebsiella pneumoniae CARBAPENEMASE Ở Escherichia coli VÀ Klebsiella pneumoniae Ngành: Kỹ thuật x t nghiệm y họ Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS HOÀNG QU C CƢỜNG Th nh phố Hồ Ch Minh – Năm 2018 ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin am đoan l ơng trình nghiên ứu chúng tơi Các tài liệu trích dẫn, số liệu luận văn l ho n to n trung thự v tuân theo yêu đề tài nghiên cứu Đề tài v hưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Tr n Thị Thu H ng u iii LỜI CẢM ƠN Kính gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS.BS Hồng Quố Cường tận tình dẫn, tạo điều kiện hướng em giải nh ng vấn đề gợi mở nhiều định hướng cho em suốt trình thực đề tài nghiên cứu! Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Vũ Quang Huy – Trưởng Bộ môn Xét nghiệm Y học, trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện để em ó sở thực đề tài nghiên cứu, cảm ơn th y cô khoa Vi sinh th y cô Bộ môn truyền dạy cho chúng em nhiều kiến thức, kinh nghiệm nghiên cứu quý báu tạo điều kiện cho chúng em hoàn thành tốt hương trình đ o tạo! Xin gửi lời ảm ơn tới ThS Nguyễn Tuấn Anh người ẫn động viên, hướng em chủ động giải nh ng khúc mắc sinh học phân tử nói riêng nh ng vấn đề liên quan suốt chặng đường nghiên cứu nói chung Xin cảm ơn ThS Phạm Thái Bình gợi mở ý tưởng nghiên cứu, truyền đạt nh ng kiến thức quý báu, hướng dẫn, hỗ trợ em vấn đề vi sinh Xin chân thành cảm ơn ThS.BS Nguyễn Sử Minh Tuyết – Khoa Vi sinh, bệnh viện Nhân Dân Gia Định; Anh Đ o Minh Ý – Khoa Vi sinh, bệnh viện Đa khoa tỉnh Đồng Nai hỗ trợ tận tình q trình thu thập chủng! Tơi xin gửi lời cảm ơn hân th nh tới em sinh viên đặ iệt hai em Tr n Lê Trung Nguyễn Thị Huệ Hạnh nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài! Và cuối cùng, tơi xin cảm ơn mẹ gia đình ln bên cạnh động viên nguồn động lự để vượt qua nh ng khó khăn thử thách sống Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018 Học viên Tr n Thị Thu H ng iv MỤC LỤC…………… LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC…………… iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC HÌNH xi DANH MỤC BẢNG xii DANH MỤC BIỂU ĐỒ xiii DANH MỤC SƠ ĐỒ xiv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI IỆU 1 Đặc điểm vi khuẩn học 1.1.1 Hình thái 1.1.2 Đặ điểm sinh vật hóa học tính chất nuôi cấy 1.1.3 Khả gây ệnh 1.2 Tình hình kháng thuốc giải pháp điều trị 1.2.1 Tình hình kháng thuốc 1.2.2 Giải pháp điều trị 10 Các chế lan truyền tính kháng thuốc 11 1.3.1 Cơ hế lan truyền 11 1.3.2 Vai trò di truyền ngang việ lây lan đặc tính kháng thuốc E coli K pneumoniae 16 Carbapenem chế đề kháng carbapenem 16 1.4.1 Carbapenem 16 1.4.2 Cơ hế tác dụng 17 1.4.3 Cơ hế vi khuẩn đề kháng carbapenem .18 1.5 Carbapenemase 20 1.5.1 Carbapenemase lớp A 20 v 1.5.2 Carbapenemase lớp B 21 1.5.3 Carbapenemase lớp D 23 1.6 Tình hình nghiên cứu 24 1.6.1 Tình hình nghiên cứu nước .24 1.6.2 Tình hình nghiên cứu quốc tế 25 Các phƣơng pháp phát carbapenemase s dụng nghi n cứu 27 1.7.1 Phương pháp real – time PCR 28 1.7.2 Thử nghiệm Ho ge ải biên 29 1.7.3 Phương pháp đ a kết hợp .30 CHƢƠNG Đ I TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 Đối tƣợng nghiên cứu 32 2 Phƣơng pháp nghi n cứu 32 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 32 2.2.2 Phương pháp định anh v kháng sinh đồ khoa vi sinh bệnh viện 34 2.2.3 Thử nghiệm Hodge cải iên v đ a kết hợp 34 2.2.4 Phương pháp tối ưu hóa phản ứng real – time PCR 34 2.2.5 Giải trình tự gen 38 2.2.6 Phương pháp thống kê sử dụng nghiên cứu .39 2.2.7 Vấn đề Y đức .39 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41 Đặc t nh mẫu 41 3.1.1 Đặ t nh mẫu theo giới 41 3.1.2 Đặ t nh mẫu theo tuổi 41 3.1.3 Đặ điểm đối tượng theo địa điểm nghiên cứu 44 3.1.4 Tỷ lệ vi khuẩn mang gen 46 3.2 Tối ƣu h a qu tr nh rea – time PCR xác định blaNDM, blaKPC E coli K pneumoniae 47 3.2.1 Khảo sát hiệu hoạt động mồi 48 3.2.2 Khảo sát nhiệt độ lai 48 vi 3.2.3 Khảo sát hiệu hoạt động phản ứng multiplex real – time PCR 50 3.2.4 Tối ưu nồng độ mồi v mẫu 3.2.5 Tối ưu nồng độ mồi NDM .52 3.2.6 Tối ưu nồng độ mẫu dò NDM .52 3.2.7 Tối ưu nồng độ mồi KPC 54 3.2.8 Tối ưu nồng độ mẫu dò KPC 55 3.2.9 Tối ưu nồng độ Mg2+ 56 16S rRNA 50 3.2.10 Tối ưu nồng độ enzyme .57 3.2.11 Khảo sát hiệu quy trình real – time PCR .58 3.2.12 Quy trình real – time PCR phát gen blaNDM blaKPC E coli K pneumoniae 60 33 ác định giá trị th nghiệm th nghiệm Hodge cải biên 61 34 ác định giá trị th nghiệm đ a ết hợp 62 3.4.1 Thử nghiệm EDTA 62 3.4.2 Thử nghiệm Boronic acid 62 3.4.3 So sánh kết thử nghiệm Ho ge ải iên v đ a kết hợp 63 CHƢƠNG BÀN LUẬN 64 Khảo sát đặc t nh mẫu 64 4.1.1 Đặc tính mẫu theo giới 64 4.1.2 Đặc tính mẫu theo tuổi 64 4.1.3 Đặ điểm kháng thuố theo địa điểm nghiên ứu 65 4.1.4 Sự phân ố đối tượng loại ệnh phẩm 66 4.2 Hiệu hoạt động quy trình PCR, so sánh với quy trình khác phát blaNDM blaKPC E coli K pneumoniae 67 4.3 Giá trị th nghiệm th nghiệm Hodge cải biên 68 4.4 Giá trị phƣơng pháp đ a ết hợp 69 4.4.1 Thử nghiệm EDTA 69 4.4.2 Thử nghiệm Boronic 70 4.4.3 So sánh ưu nhượ điểm thử nghiệm 73 vii 4.5 Hạn chế đề tài: 74 4.5.1 Sinh học phân tử 74 4.5.2 Vi sinh 74 KẾT LUẬN 75 KIẾN NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH SÁCH CHỦNG BV NHÂN DÂN GIA ĐỊNH 22 PHỤ LỤC DANH SÁCH CHỦNG BV ĐK TỈNH ĐỒNG NAI 25 PHỤ LỤC CÁC CHỦNG ATCC DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 27 PHỤ LỤC GIÁ TRỊ CT CÁC MẪU KHẢO SÁT NHIỆT Đ AI 28 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PCR THỬ NGHIỆM HODGE 29 PHỤ LỤC KẾT QUẢ KIỂM TRA Đ NHẠY QUY TRÌNH 32 PHỤ LỤC KẾT QUẢ KIỂM TRA Đ ĐẶC HIỆU QUY TRÌNH 33 PHỤ LỤC KẾT QUẢ GIẢI TR NH T PHỤ LỤC M T S GEN 34 H NH ẢNH THỬ NGHIỆM 41 PHỤ LỤC QUY TRÌNH VẬN CHUYỂN MẪU BỆNH PHẨM 42 PHỤ LỤC 10 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA VÀ REALTIME PCR 44 PHỤ LỤC 11 QUY TRÌNH THỬ NGHIỆM HODGE 48 PHỤ LỤC 12 QUY TRÌNH THỬ NGHIỆM ĐĨA KẾT HỢP 50 PHỤ LỤC 13 KẾT QUẢ SO SÁNH MONOPLEX VÀ MULTIPLEX REAL-TIME PCR 53 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT E/K : Escherichia coli/Klebsiella pneumoniae MS : Mã số NC : Nghiên cứu NST : Nhiễm sắc thể SHPT : Sinh học phân tử TN : Thử nghiệm TB : Tế bào TP : Th nh phố TIẾNG ANH ATCC : American Type Culture Collection BHI : Brain heart infusion cAMP : Cyclic adenosine monophosphate CDC : Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Kiểm sốt Phịng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ) cGMP : Cyclic guanosine monophosphate CI : Chromosomal integron CPE : Carbapenemase producing Enterobacteriaceae CRE : Carbapenem resistant Enterobacteriaceae DNA : Deoxyribonucleic acid dNTPs : Deoxyribonucleotide triphosphates ddNTPs : Dideoxyribonucleotide triphosphates eCIM : EDTA Modified carbapenemase inactived method EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay ESBL : Extended-spectrum--Lactamase EUCAST : European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing ix GC : Gene cassette GES : Guiana extended-spectrum GIM : German imipenemase HGE : Haploid genome equivalent IMI : Imipenem-hy rolysing β-lactamse IMP : Imipenemase KPC : Klebsiella pneumoniae carbapenemase LOD : Limit of detection MC : MacConkey agar MLBs : Metallo-beta-lactacmases MI : Mobile integron MIC : Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) mCIM : Modified carbapenemase inactived method MHT : Modified Hodge test NDM : New Delhi metallo-β-lactamase NMC : Not metalloenzyme carbapenemase NI : Noninformation NPV : Negative predictive value (Giá trị tiên đoán âm t nh) OXA : Oxacillinase PBA : Phenyl boronic acid PBP : Penicillin binding protein PCR : Polymerase chain reaction PPV : Positive predictive value (Giá trị tiên đoán ương t nh) Se : Sensitivity Độ nhạy) SME : Carbapenemase producing Serratia marcescens SIM : Seoul imipenemase Sp : Specificity Độ đặ hiệu) SPM : Sao Paulo encoded metallo-beta-lactamase VIM : Verona Integron-encoded metallo-beta-lactamase x Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM PHỤ ỤC 13 Mẫu KẾT QUẢ SO SÁNH MONOPLEX VÀ MULTIPLEX REAL-TIME PCR Mo Mul Mẫu Mo Mul Mẫu Mo Mul Mẫu Mo Mul GD001 (-) (-) GD011 KPC KPC GD021 NDM NDM DN003 NDM NDM GD002 NDM NDM GD012 NDM NDM GD022 NDM NDM DN004 (-) (-) GD003 (-) (-) GD013 NDM NDM GD023 NDM NDM DN005 NDM NDM GD004 NDM NDM GD014 NDM NDM GD024 NDM NDM DN006 NDM NDM GD005 (-) (-) GD015 (-) (-) GD025 NDM NDM DN007 (-) (-) GD006 (-) (-) GD016 KPC KPC GD026 (-) (-) DN008 (-) (-) GD007 (-) (-) GD017 NDM NDM GD027 NDM NDM DN009 (-) (-) GD008 (-) (-) GD018 NDM/KPC NDM/KPC GD028 (-) (-) DN010 (-) (-) GD009 NDM NDM GD019 NDM NDM 028356 (-) (-) DN011 KPC KPC GD010 NDM NDM GD020 (-) (-) DN002 (-) (-) DN012 NDM NDM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... nghiên cứu ? ?Khảo sát giá trị thử nghiệm Hodge cải biên v đ a kết hợp so với kỹ thuật PCR phát enzyme Metallo- beta- lactamase Klebsiella pneumoniae carbapenemase Escherichia coli Klebsiella pneumoniae? ??... thử nghiệm Ho ge ải iên phát carbapenemase E .coli K pneumonia tiết Xá định giá trị thử nghiệm đ a kết hợp phát v phân loại carbapenemase E coli K pneumoniae tiết ra, so sánh giá trị với thử nghiệm. .. trình PCR, so sánh với quy trình khác phát blaNDM blaKPC E coli K pneumoniae 67 4.3 Giá trị th nghiệm th nghiệm Hodge cải biên 68 4.4 Giá trị phƣơng pháp đ a ết hợp 69 4.4.1 Thử nghiệm