Thu nhận và tinh sạch enzym bromelin từ dứa cayenne

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ HỮU Ý THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYM BROMELIN TỪ DỨA CAYENNE CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÃ SỐ NGÀNH: 2.11.00 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 07 NĂM 2006 CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: TS HOÀNG KIM ANH Chữ ký Cán chấm nhận xét 1: TS TRẦN BÍCH LAM Chữ ký Cán chấm nhận xét 2: TS LÊ THỊ PHÚ Chữ ký Luận văn bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ, Trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh Ngày 09 tháng 08 năm 2006 TR NG I H C BÁCH KHOA PHÒNG ÀO T O S H NG HÒA XÃ H I CH NGH A VI T NAM C L P T DO H NH PHÚC Tp HCM, ngày tháng n m 200 NHI M V LU N V N TH C S tên h c viên: LÊ H U Ý Ngày, tháng, n m sinh: 12/05/1980 Chuyên ngành: Khoa h c công ngh th c ph m Phái: Nam i sinh: Sông Bé MSHV: 01104307 I- TÊN TÀI: THU NH N VÀ TINH S CH ENZYME BROMELAIN T CAYENNE D A II- NHI M V VÀ N I DUNG: Kh o sát hàm l ng protein ho t tính bromelain q trình phát tri n c a qu d a Cayenne Ch n nguyên li u- ph ph m c a công nghi p ch bi n d a thu nh n enzyme t t a enzyme, tinh s ch b ng s c ký l c gel Xác nh m t s tính ch t c a enzyme thu c (t0opt, pHopt, thông s ng c) III- NGÀY GIAO NHI M V : 06/02/2006 IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V : 06/07/2006 V- CÁN B H NG D N (Ghi rõ h c hàm, h c v , h , tên): TS HOÀNG KIM ANH CÁN B H NG D N (H c hàm, h c v , h tên ch ký) CN B MÔN QL CHUYÊN NGÀNH TS HOÀNG KIM ANH i dung c ng lu n v n th c s ã cH i ng chuyên ngành thông qua Ngày TR NG PHÒNG T S H TR tháng n m NG KHOA QL NGÀNH Toâi xin chân thành cảm ơn: TS Hoàng Kim Anh Viện Sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh Đã tận tình hướng dẫn, động viên, tạo điều kiện đóng góp nhiều ý kiến q báu suốt trình nghiên cứu PGS TS Đống Thị Anh Đào Bộ môn Hóa Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh Đã giúp đỡ, động viên để Luận văn hoàn thành cách tốt đẹp TS Lê Văn Việt Mẫn Chủ nhiệm Bộ môn Hóa Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh Đã giúp đỡ trình thực Luận văn Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ, hỗ trợ của: Thầy Văn Đức Chín, Bộ môn Sinh hóa, trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh Anh Nguyễn Duy Tân, học viên lớp K15 trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh Chị Phạm Kim Phụng, học viên lớp K15 trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh Các Anh, Chị, bạn bè lớp K15 trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh Em Nguyễn Thị Thanh Bình, sinh viên trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh MỤC LỤC DANH MỤC BAÛNG I DANH MỤC HÌNH II TRÍCH YẾU IV MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA DỨA [17] 2.1.1 Reã 2.1.2 Thaân 2.1.3 Laù 2.1.4 Hoa 2.1.5 Quaû 2.1.6 Haït 2.2 ỨNG DỤNG CỦA DỨA 2.2.1 Nguồn thực phẩm cho người 2.2.2 Món ăn chữa bệnh 2.2.3 Thức ăn cho vật nuôi 10 2.2.4 Các ứng dụng khác 10 2.3 TÌNH HÌNH PHÁT TRIỂN CỦA NGÀNH CÔNG NGHIỆP CHẾ BIẾN DỨA TẠI VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 10 2.4 ENZYME BROMELAIN TRONG DỨA 13 2.4.1 Tính chất vật lý cấu tạo hóa học 13 2.4.2 Cấu trúc không gian 15 2.4.3 Hoạt tính bromelain 16 2.4.4 Cơ chế tác động bromelain 17 2.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain 19 2.4.6 Các ứng dụng bromelain 20 2.5 MOÄT SỐ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME BROMELAIN 23 2.5.1 Sơ đồ chung 23 2.5.2 Phương pháp phá vỡ tế bào thu enzyme 23 2.5.3 Thu nhaän enzyme dựa đặc điểm hòa tan 24 2.5.4 Thu nhận enzyme phương pháp hấp phụ 25 2.5.5 Thu nhận enzyme phương pháp siêu loïc 25 2.5.6 Tinh enzyme phương pháp sắc ký 26 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 29 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 32 3.2.2 Qui trình thu nhận enzyme bromelain 33 3.2.3 Ly trích bromelain 33 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 3.2.8 3.2.9 Kết tủa protein 34 Khảo sát điều kiện kết tủa enzyme bromelain 34 Tinh bromelain sắc ký loïc gel 35 Xác định số tính chất chế phẩm enzyme thu 35 Các phương pháp phân tích 37 Xử lý số liệu 37 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38 4.1 KHẢO SÁT HÀM LƯNG PROTEIN HÒA TAN VÀ HOẠT TÍNH BROMELAIN TRONG QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA QUẢ DỨA CAYENNE 38 4.1.1 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan hoạt tính bromelain trình phát triển dứa Cayenne 38 4.1.2 Sự phân bố hàm lượng protein hòa tan hoạt tính bromelain phận dứa Cayenne 42 4.2 LỰA CHỌN NGUYÊN LIỆU THU NHẬN ENZYME 44 4.2.1 Chọn nguyên liệu thời điểm thu nhận enzyme 44 4.2.2 So sánh số số khối lượng, hàm lượng protein hoạt tính bromelain dứa Cayenne dứa Queen 47 4.3 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH BROMELAIN 50 4.3.1 Khảo sát tác nhân kết tủa 50 4.3.2 Xaùc định nồng độ amonium sulfate bão hòa 51 4.3.3 Xác định điều kiện tủa thích hợp 52 4.3.4 Tinh bromelain phương pháp sắc ký lọc gel 56 4.4 KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM ENZYME BROMELAIN 58 4.4.1 Khaûo sát nhiệt độ tối thích pH tối thích chế phẩm 58 4.4.2 Xác định số Michaelis-Menten vận tốc phản ứng cực đại 59 KẾT LUẬN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHUÏ LUÏC 67 i DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Vị trí dứa bảng phân loại thực vật Bảng 2.1 Thành phần hóa học dứa Bảng 2.2 Các quốc gia sản xuất dứa chủ yếu Bảng 2.3 Một số thông số vật lý bromelain Bảng 2.4 Thành phần amino acid nhóm khác bromelain Bảng 2.5 Hoạt tính phân giải casein bromelain Bảng 2.6 Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) bromelain Bảng 2.7 Hằng số Michaelis chất tổng hợp khác Bảng 4.1 Hàm lượng protein hoạt tính chung (HTC) lõi, thịt vỏ dứa Queen Cayenne Bảng 4.2 So sánh khối lượng, tổng hàm lượng protein, tổng hoạt tính hoạt tính riêng lõi-vỏ thịt dứa Queen Cayenne Bảng 4.3 So sánh kết tủa bromelain tác nhân kết tủa khác Bảng 4.4 Kết tủa enzyme amonium sulfate độ bão hòa khác Bảng 4.5 Bảng kết khảo sát hàm lượng protein hoạt tính bromelain chế độ tủa khác với tác nhân (NH4)2SO4 bão hòa Bảng 4.6 Thông số trình tinh chế phẩm bromelain Bảng 4.7 Hoạt tính chế phẩm enzyme theo nhiệt độ Bảng 4.8 Hoạt tính chế phẩm enzyme theo pH ii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Những thay đổi trình phát triển dứa Hình 2.2 Cấu trúc phần carbohydrate bromelain Hình 2.3 Một số sản phẩm thuốc có chứa bromelain Hình 3.1 Dứa Cayenne độ tuổi 80 ngày 110 ngày (tính từ ngày xử lý đất đèn) Hình 3.2 Các phận dứa Cayenne độ tuổi 110 ngày Hình 3.3 Sơ đồ nghiên cứu Hình 3.4 Qui trình thu nhận enzyme bromelain Hình 3.5 Hình minh họa phương pháp Lineweaver et Burk Hình 4.1 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan hoạt tính chung theo ngày tuổi Hình 4.2 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan hoạt tính bromelain chồi theo ngày tuổi Hình 4.3 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan hoạt tính bromelain cuống theo ngày tuổi Hình 4.4 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan hoạt tính bromelain lõi theo ngày tuổi Hình 4.5 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan hoạt tính bromelain thịt theo ngày tuổi Hình 4.6 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan hoạt tính bromelain vỏ theo ngày tuổi Hình 4.7 Sự phân bố tổng hàm lượng protein hòa tan phần khác dứa Cayenne Hình 4.8 Sự phân bố tổng hoạt tính bromelain phần khác dứa Cayenne Hình 4.9 So sánh hàm lượng protein hoạt tính chung (HTC) lõi, thịt vỏ dứa Queen Cayenne Hình 4.10 So sánh khối lượng lõi, thịt vỏ dứa Queen Cayenne Hình 4.11 So sánh tổng protein tổng hoạt tính (THT) lõi, vỏ thịt dứa Queen Cayenne Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn phương trình hồi qui hoạt tính bromelain theo thông số nhiệt độ pH Hình 4.13 Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hoạt tính enzyme thu nhận theo thời gian phương pháp sắc ký lọc gel iii Hình 4.14 Sự thay đổi hoạt tính chế phẩm theo nhiệt độ Hình 4.15 Sự thay đổi hoạt tính chế phẩm theo pH Hình 4.16 Đường biểu diễn vận tốc phản ứng theo nồng độ chất Hình 4.17 Đường thẳng xây dựng theo phương pháp Lineweaver et Burk 65 18.Trần Thị Hường (2003), Thu nhận bromelin thử nghiệm dùng chế phẩm bromelin để làm phomat tươi, Luận văn Thạc só Khoa học Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh 19.Trịnh Xuân Vũ (1976), Sinh lý thực vật, Nhà xuất Nông thôn 20.Vũ Công Hậu (1987), Cây ăn miền Nam, Nhà xuất Nông nghiệp 21.G Sarlot (1978), Các phương pháp hóa phân tích, tập 2, Nhà xuất Đại học trung học chuyên nghiệp, Hà Nội 22.V L Kretovits – V L Iarovenko (1982), Sử dụng chế phẩm enzym công nghiệp thực phẩm, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 23.A Braith Waite, Chromatographic methods, Kluwer Academic Publishers, Boston, London 24.Alan Wiseman (2000), Handbook of enzyme biotechnology, 3rd edition, Ellis Horwood 25.Ballis (Zud) (1941), Eng Chem-33, 150 26.Berndt (W) (1968), Castroenterol 6,3, Chem Abs 27.Coveca (2002), Comision veracruzana de comercializacion agropecuaria Gobierno del Estado de Veracruz, Mexico 28.David, Harvey (2000), Modern Analytical Chemistry, McGraw- Hill Companies, Inc 29.Doi E., et al (1974), Carboxypeptidase in commercial Bromelain powder, partial purufication and some properties of pineapple carboxypeptidase, Biochem 75, 5, p 1063-1071 30.Dominic W S Wong (2001), Food enzymes structure and mechanism, Chapman & Hall 31.Gastronomía (2004) htpp://www.peru.com /gastronomia/docs2/ 32.Geo coppens (2001), http://www.ciat.cgiar.org/ipgri/fruits_from_americas/frutalesGeo 33.Marin (LA), Chem, Abs-53 34.Maurer, H.R., Review- Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use 35.Morton, J (1987), Fruits of warm climates, Creative Resource Systems, Inc NC, p.18-28 36.Mundogar (2004) http://www.mundogar.com 37.Py C.y M Tisseau (1969), La pina tropical, Ed Blume Barcelona, p.278 38.Rodney F Boyer (1993), Modern experimental biochemistry, The Benjamin/Cummings Publishing Company Inc 39.Ruyssen and A Lauwers, 1978, Pharmaceutical Enzymes- properties and assay methods, Story Scientia P.V.B.A, p 107-117 66 40.Sanewski, G and Scott, C (2000), The Australian pineappl industry, In: Subhadrabandhu, S and Chairidchai, P (eds), Proceedings of the Third International Pineapple Symposium International Society for Horticultural Science, Pattaya, Thailand, p.53-55 41.Sidney P Colowick, Nathan O Kaplan, Methods in enzymololy, vol2, McCollum, Pratt Institute, the Jonh Hopkins University, Baltimore, Maryland 42.Su (YuanChi) (1967), Spec ISS, Dec 42-54 Chem Abs 69 43.www.baobinhdinh.com.vn 44.www.chromatography.amershambiosciences.com 45.www.cpv.org.vn 46.www.hort.purdue.edu/newcrop/morton/pineapple.html 47.www.fao.org/inpho/content/compend/text/ch33/AE614e01.htm 48.www.news.bbc.co.uk/1/hi/health/4697739.stm 49.www.nhandan.com.vn 50.www.vnanet.vn 67 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: CÁC DUNG DỊCH ĐỆM SỬ DỤNG TRONG CÁC PHÉP PHÂN TÍCH [3] DUNG DỊCH ĐỆM PHOSPHATE (PH 5,7-8,0) a Dung dịch monosodium orthophosphate 0,2 m (dung dịch a): Cân 27,8 g NaH2PO4 hòa tan dẫn nước đến 1000 ml b Dung dịch disodium hydrophosphate (dung dịch b): Cân 53,05 g Na2HPO4.7H2O 71,7 g Na2HPO4.12H2O hòa tan dẫn nước đến 1000 ml c Pha dung dịch đệm phosphate: Dung dịch đệm phosphate có pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) số ml dung dịch (b), dẫn nước ñeán 200 ml a (ml) b (ml) pH a (ml) b (ml) pH 93,5 6,5 5,6 45,0 55,0 6,9 9,2 8,0 5,8 39,0 61,0 7,0 90,0 10,0 5,9 33,0 67,0 7,1 87,7 12,3 6,0 28,0 72,0 7,2 85,0 15,0 6,1 23,0 77,0 7,3 81,5 18,5 6,2 19,0 81,0 7,4 77,5 22,5 6,3 16,0 84,0 7,5 73,5 26,5 6,4 13,0 87,0 7,6 68,5 31,5 6,5 10,5 89,5 7,7 62,5 37,5 6,6 8,5 91,5 7,8 56,5 43,5 6,7 7,0 93,0 7,9 51,0 49,0 6,8 5,3 94,7 8,0 68 DUNG DỊCH ĐỆM CITRATE (PH 3,0-6,2) a Dung dòch citric acid (dung dòch a): Hòa tan 21,01 g C6H8O7.H2O vào nước định mức đến 1000 ml b Dung dịch trisodium citrate: Hòa tan 29,41 g C6H5O7Na3 2H2O vào nước định mức đến 1000 ml c Pha dung dịch đệm citrate: Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) số ml dung dịch (b) theo bảng sau: a (ml) b (ml) pH a (ml) b (ml) pH 46,5 3,5 3,0 23,0 27,0 4,8 43,8 6,2 3,2 20,5 29,5 5,0 40,0 10,0 3,4 18,0 32,0 5,2 37,0 13,0 3,6 16,0 34,0 5,4 35,0 15,0 3,8 13,7 36,3 5,6 33,0 17,0 4,0 11,8 38,2 5,8 31,0 19,0 4,2 9,5 40,5 6,0 28,0 22,0 4,4 7,2 42,8 6,2 25,5 24,5 4,6 PHUÏ LUÏC 2: SỰ BIẾN ĐỘNG CỦA HÀM LƯNG PROTEIN HÒA TAN Ở CÁC THÀNH PHẦN KHÁC NHAU CỦA QUẢ DỨA CAYENNE THEO NGÀY TUỔI Ngày tuổi Hàm lượng protein (mg/g phận) Lá Chồi 80 1,53 ± 0,85 3,95 ± 0,27 90 4,07 ± 1,45 100 Cuống Lõi Thịt Vỏ 5,65 ± 0,61 22,72 ± 2,44 8,56 ± 2,07 3,44 ± 0,22 4,20 ± 0,18 5,74 ± 0,88 15,77 ± 1,49 7,29 ± 1,22 4,17 ± 1,10 4,48 ± 1,10 6,15 ± 0,24 6,47 ± 0,65 7,91 ± 0,73 10,94 ± 0,19 4,56 ± 0,65 110 10,66 ± 0,83 7,54 ± 0,75 9,82 ± 1,81 16,12 ± 1,20 11,16 ± 1,50 6,35 ± 1,34 120 13,92 ± 1,18 6,60 ± 0,80 13,09 ± 1,56 14,98 ± 2,36 11,68 ± 1,07 9,11 ± 1,57 130 13,83 ± 1,72 12,50 ± 1,08 13,95 ± 1,36 12,69 ± 0,72 9,20 ± 0,83 9,80 ± 1,34 140 8,31 ± 0,77 13,01 ± 1,59 10,82 ± 1,39 13,32 ± 0,57 14,17 ± 2,47 11,24 ± 1,75 150 5,57 ± 0,88 1,87 ± 0,57 5,61 ± 0,79 69 7,58 ± 0,96 6,57 ± 1,59 6,06 ± 1,34 PHỤ LỤC 3: SỰ BIẾN ĐỘNG CỦA HOẠT TÍNH CHUNG CỦA BROMELAIN Ở CÁC THÀNH PHẦN KHÁC NHAU CỦA QUẢ DỨA CAYENNE THEO NGÀY TUỔI Ngày tuổi Hoạt tính chung (UI/g phận) Lá Chồi Cuống Lõi Thịt Vỏ 80 46,02 ± 2,18 69,30 ± 0,56 73,02 ± 0,60 255,32 ± 1,03 143,38 ± 4,31 161,27 ± 0,96 90 74,12 ± 2,22 95,01 ± 0,51 79,14 ± 0,19 134,87 ± 5,23 42,19 ± 0,72 207,14 ± 5,78 100 80,94 ± 2,35 80,28 ± 0,62 95,21 ± 1,24 92,91 ± 0,60 87,48 ± 0,81 69,82 ± 0,94 110 123,04 ± 10,72 90,63 ± 1,36 94,33 ± 1,43 161,34 ± 1,14 65,37 ± 1,35 45,01 ± 1,03 120 481,35 ± 4,28 90,19 ± 3,20 525,52 ± 5,71 512,08 ± 7,39 244,25 ± 1,66 100,11 ± 2,22 130 353,66 ± 4,24 155,07 ± 1,31 165,90 ± 3,11 120,81 ± 0,82 245,18 ± 2,32 92,26 ± 0,80 140 366,17 ± 3,73 137,84 ± 2,27 246,34 ± 2,89 176,36 ± 1,26 470,61 ± 2,07 280,34 ± 4,53 150 184,26 ± 2,80 48,22 ± 1,54 71,55 ± 1,51 85,10 ± 1,21 80,19 ± 2,13 133,07 ± 2,57 70 71 PHỤ LỤC 4: SỰ BIẾN ĐỘNG CỦA HOẠT TÍNH RIÊNG CỦA BROMELAIN Ở CÁC THÀNH PHẦN KHÁC NHAU CỦA QUẢ DỨA CAYENNE THEO NGÀY TUỔI Hoạt tính riêng (UI/mg protein) Ngày tuổi Lá Chồi Cuống Lõi Thịt Vỏ 80 29,69±1,28 17,40±0,26 12,93±0,60 11,27±0,66 16,57±0,80 9,34±0,16 90 18,39±1,12 22,53±0,86 13,76±0,49 9,89±0,11 100 17,69±0,71 13,03±0,86 14,64±0,41 11,67±0,47 7,99±0,80 15,10±0,56 110 11,59±0,55 11,83±0,57 5,74±0,60 120 34,50±0,56 130 25,50±0,36 12,43±1,06 11,73±1,10 140 43,97±0,70 10,47±0,76 22,77±0,45 13,20±0,60 24,87±0,71 33,13±0,42 150 33,10±0,40 25,90±0,60 12,70±0,75 11,23±0,49 12,03±0,57 22,01±0,86 9,63±0,61 8,41±2,64 9,97±0,38 5,78±0,37 7,07±0,41 8,59±0,41 30,12±16,9 34,21±0,95 20,97±0,55 10,87±0,59 9,43±0,15 26,60±0,60 9,45±0,61 PHUÏ LỤC 5: TRỌNG LƯNG CÁC BỘ PHẬN CỦA QUẢ DỨA CAYENNE THEO NGÀY TUỔI Ngày tuổi Trọng lượng (g) Lá Chồi Cuống Lõi Thịt Vỏ 80 46,13 19,32 67,00 29,46 101,59 66,70 90 53,20 52,56 66,51 44,09 196,93 99,80 100 35,50 135,76 57,37 69,40 455,68 186,85 110 46,08 112,21 56,74 68,95 482,74 201,04 120 41,95 152,13 50,86 66,77 513,77 192,10 130 31,70 143,7 55,02 99,00 551,85 237,45 140 50,03 240,10 65,00 115,01 575,12 275,00 150 53,93 274,30 63,05 175,98 687,85 218,27 72 PHỤ LỤC 6: SỰ BIẾN ĐỘNG CỦA TỔNG HÀM LƯNG PROTEIN Ở CÁC BỘ PHẬN KHÁC NHAU CỦA QUẢ DỨA CAYENNE THEO NGÀY TUỔI Ngày tuổi Tổng protein (mg) Lá Chồi Cuống Lõi Thịt Vỏ 80 70,51 ± 39,38 76,28 ± 5,22 378,52 ± 40,61 669,40 ± 71,99 869,80 ± 210,53 229,42 ± 14,89 90 216,62 ± 77,29 220,91 ± 9,67 381,84 ± 58,33 695,23 ± 65,47 1435,61 ± 240,87 416,05 ± 110,20 100 159,02 ± 39,02 835,54 ± 33,02 370,88 ± 37,10 548,98 ± 50,40 4985,52 ± 85,97 851,91 ± 121,94 110 491,21 ± 38,19 846,01 ± 84,49 556,89 1111,75 ± 82,69 5387,95 ± 723,78 1275,99 ± 268,92 120 583,95 1003,97 ± 49,30 ± 121,37 665,71 999,99 ± 79,22 ± 157,75 5999,63 ± 551,32 1750,05 ± 302,38 130 438,29 1796,54 ± 54,42 ± 154,64 767,50 ± 74,97 1256,45 ± 70,84 7443,2 ± 671,12 2327,89 ± 317,45 140 415,50 3122,08 ± 38,62 ± 382,34 703,49 ± 90,26 1531,55 ± 65,89 8146,41 ± 269,16 3092,02 ± 246,79 150 511,59 300,37 ± 47,54 ± 157,46 353,92 1334,03 ± 49,69 ± 168,87 4515,9 ± 109,48 1322,92 ± 293,14 ± 50,89 73 PHỤ LỤC 7: SỰ BIẾN ĐỘNG TỔNG HOẠT TÍNH Ở CÁC BỘ PHẬN QUẢ KHÁC NHAU CỦA QUẢ DỨA CAYENNE THEO NGÀY TUỔI Ngày tuổi Tổng hoạt tính (UI) Lá Chồi Cuống Lõi Thịt Vỏ 80 2126,35 ± 12,79 1327,55 ± 2,08 4883,37 ± 3,70 7533,36 ± 3,82 14498,37 ± 41,55 10709,10 ± 6,16 90 3930,05 ± 11,86 4979,84 ± 2,43 5234,69 ± 6,02 5920,28 ± 23,28 8293,64 ± 14,45 20609,32 ± 56,66 100 2827,87 10889,07 ± 7,58 ± 8,27 5439,92 ± 7,02 6396,65 ± 4,22 39833,07 ± 36,92 12841,35 ± 16,86 110 5688,32 10042,41 ± 4,69 ± 14,47 5333,81 11080,87 ± 8,14 ± 9,89 31182,94 ± 73,38 9000,15 ± 19,34 120 20161,05 28864,60 26700,70 34132,42 125592,96 ± 19,95 ± 48,28 ± 12,64 ± 22,86 ± 82,19 19052,62 ± 21,36 130 11178,68 22280,38 ± 6,85 ± 19,23 90,59 11858,18 197975,67 ± 16,88 ± 8,38 ± 181,45 21891,35 ± 19,13 140 18276,21 32879,96 15995,89 20243,97 269974,88 ± 18,63 ± 64,44 ± 18,65 ± 17,90 ± 117,49 76920,24 ± 67,43 150 9933,08 13228,85 ± 15,07 ± 40,20 4501,25 14981,05 ± 7,18 ± 19,12 54776,42 ± 154,92 29080,59 ± 13,35 74 PHỤ LỤC 8: QUI TRÌNH THỰC HIỆN PHƯƠNG PHÁP BRADFORD [3] Chuẩn bị hóa chất: Dung dịch albumin 0,1 mg/ml: cân 10 mg albumin pha vào ml nước cất Lắc cho tan Giữ nhiệt độ lạnh Khi dùng pha loãng 100 lần, dung dịch albumin 0,1 mg/ml Dung dịch thuốc thử Bradford: Lấy 0,002 g phẩm màu Coomassie Briliant Blue hòa tan 4,7 g ethanol 99%, sau bổ sung 8,5 g phosphoric acid 85% chỉnh đến 100 ml nước cất Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị dãy ống nghiệm với hóa chất theo bảng sau: Ống nghiệm số Nồng độ albumin (µg/ml) Dung dịch albumin 0,1 (mg/ml) Nước cất (ml) 0 0,0 1,0 10 0,1 0,9 20 0,2 0,8 30 0,3 0,7 40 0,4 0,6 50 0,5 0,5 Tiến hành lô thí nghiệm, lô ống nghiệm đánh số theo thứ tự: Thí nghiệm Thí nghiệm 0a 0b 1a 1b 2a 2b 3a 3b 4a 4b 5a 5b Sử dụng đồng hồ bấm giây, canh thời gian phút Cho ml dung dịch thuốc thử Bradford vào ống nghiệm 0a Lắc đều, để yên Ở thời điểm phút, cho ml dung dịch thuốc thử vào ống nghiệm 0b Lắc để yên Thực bổ sung ml dung dịch thuốc thử vào ống 1a, 1b, … 5a, 5b thời điểm cách phút Đến thời điểm 11 phút, cho ml thuốc thử vào ống 5b Lắc đều, để yên Tính thời gian ống 0a 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 595 nm (OD595 nm) Tính thời gian ống 0b 21 phút, tiến hành đo OD595 nm Tuần tự tiến hành đo OD595 nm ống lại thời điểm cách phút Đến thời điểm 31 phút tiến hành đo cho ống 5b Lấy giá trị trung bình hai ống a b 75 Lấy OD595 nm ống thử thật (có protein) trừ OD595 nm ống thử không (không có protein) ta ∆OD595 Vẽ đường tuyến tính nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang ∆OD595 Việc đo mẫu tiến hành tương tự với thời gian phản ứng 20 phút Mẫu đo với thể tích cho OD595 nm nằm khoảng OD595 nm đường chuẩn Từ lượng protein tính dung dịch đem đo, suy tổng lượng protein có 100 g mẫu nguyên liệu ban đầu Tính kết quả: mg protein = a.10-3.n.V với a: nồng độ protein mẫu suy từ đường chuẩn (µg/ml); n: hệ số pha loãng; V: thể tích dịch chiết từ 100 g nguyên liệu ban đầu (ml) 76 PHỤ LỤC 9: QUI TRÌNH THỰC HIỆN PHƯƠNG PHÁP ANSON CẢI TIẾN [13] Chuẩn bị hóa chất: Thuốc thử Folin, Na2CO3 6%, HCl 0,2 N, TCA 5%, dung dịch casein 1% đệm phosphate pH 8, dung dịch chứa enzyme protease, dung dịch tyrosin chuẩn 1µmol Tiến hành thí nghiệm: Xây dựng đường chuẩn tyrosin: Chuẩn bị ống nghiệm sau: Ống nghieäm Dd Tyrosine 1µmol/ml (ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,5 HCl 0,2N (ml) 4,9 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,5 Nồng độ Tyrosine (µmol/ml) 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,30 Lấy 1ml nồng độ cho vào ống nghiệm cho thêm ống 5ml Na2CO3 6% 1ml thuốc thử Folin, lắc Giữ hỗn hợp phản ứng 20 phút, sau đo mật độ quang hỗn hợp dung dịch bước sóng 660nm Biểu diễn biến thiên mật độ quang (OD) theo nồng độ tyrosine µmol/ml Xác định lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm proteolytic tạo thành: Đối với ống thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm 2ml chất Đặt vào bể ổn nhiệt 37oC Sau 10 phút thêm vào 2ml dung dịch enzyme (cũng 37oC), lắc trộn để 10 phút 37oC Cho vào ống nghiệm 4ml dung dịch TCA Lắc trộn nhanh để protein dư hợp chất cao phân tử khác kết tủa, giữ ống nghiệm 37oC thêm 20 phút lọc lấy dịch Lấy 1ml dịch 5ml Na2CO3 6%, trộn thêm 1ml thuốc thử Folin Sau 20 phút phản ứng, dung dịch có màu xanh đậm Đo mật độ quang bước sóng 660nm 77 Đối với ống kiểm tra (tiến hành song song với ống thí nghiệm): Lấy 2ml dung dịch enzyme 37oC, thêm 4ml dung dịch TCA Tiến hành phản ứng 10 phút 37oC Tiếp tục cho thêm 2ml dung dịch chất giữ 20 phút 37oC Sau tiến hành tương tự ống thí nghiệm Lấy hiệu số OD ống thí nghiệm ống kiểm tra Dựa vào đường chuẩn tyrosine xác định lượng tyrosine tương ứng Tính kết quaỷ: Hoaùt ủoọ protease = àM ì V ì L (UI) t×v V: tổng thể tích hỗn hợp sau kết tủa với TCA, ml v: thể tích lọc đem phân tích, ml t: thời gian thủy phân, phút L: độ pha loãng mẫu µM: lượng tyrosine (µmol) tương ứng với ml dịch enzyme (suy từ đường chuẩn) 78 PHỤ LỤC 10: CÁC ĐƯỜNG CHUẨN SỬ DỤNG CHO CÁC PHƯƠNG PHÁP BRADFORD VÀ ANSON CẢI TIẾN Nồng độ albumin (µg/ml) OD595nm 10 20 30 40 50 0,000 0,017 0,037 0,065 0,093 0,103 y = 0.0021x 0.12 OD 595nm 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 10 20 30 40 50 60 Nồ ng độ albumin (µg/ml) Đường chuẩn Albumin (sử dụng cho phương pháp Bradford) Nồng độ tyrosine (µmol/ml) 0,000 0,020 0,040 0,080 0,120 0,160 0,200 0,300 OD660nm 0,000 0,033 0,068 0,124 0,194 0,260 0,319 0,478 y = 1.5995x 0.600 OD 660nm 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Nồng độ tyrosine (µmol/ml) Đường chuẩn tyrosine (sử dụng cho phương pháp Anson cải tiến) TÓM TẮT LÝ LỊCH Họ tên: LÊ HỮU Ý Phái: Nam Ngày tháng năm sinh: 12/05/1980 Nơi sinh: t nh Sông Bé Nguyên quán: xã An Điền, huyện Bến Cát, tỉnh Sông Bé Dân tộc: Kinh Tôn giáo: Không Địa thường trú: 33/3 tổ 3, khu 1, ấp Chánh Lộc, xã Chánh Mỹ, thị xã Thủ Dầu Một, t nh Bình Dương QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO Đại học: Chế độ học: quy Thời gian học: từ 09/1998 đến 01/2004 Nơi học: trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh Đề tài Luận văn tốt nghiệp: Thiết kế Nhà máy sản xuất xúc xích, thịt nguội Ngày nơi bảo vệ Luận văn tốt nghiệp: tháng 01/2003 trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn: KS ĐINH TRẦN NHẬT THU Sau đại học: Chế độ học: quy Thời gian học: từ 09/2004 đến 08/2006 Nơi học: trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh Đề tài Luận văn tốt nghiệp: Thu nhận tinh enzym bromelin từ dứa Cayenne Ngày nơi bảo vệ Luận văn tốt nghiệp: tháng 08/2006 trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn: TS HOÀNG KIM ANH QUÁ TRÌNH CÔNG TÁC Từ 06/2003 đến 06/2004: công tác Công ty TNHH CNTP LIWAYWAY VIỆT NAM Từ 08/2004 đến 02/2006: công tác Công ty Cổ phần KI DO ... PHÁP THU NHẬN ENZYME BROMELAIN 23 2.5.1 Sơ đồ chung 23 2.5.2 Phương pháp phá vỡ tế bào thu enzyme 23 2.5.3 Thu nhận enzyme dựa đặc điểm hòa tan 24 2.5.4 Thu nhận enzyme... phân bố enzyme bromelain phận dứa Cayenne, bước đầu thu nhận chế phẩm enzyme từ phế liệu công nghiệp chế biến dứa phương pháp kết tủa, sắc ký lọc gel…, hy vọng dự án trồng chế biến dứa Cayenne. .. pháp thu nhận nguồn enzyme mặt giải toán xử lý phế phẩm nhà máy chế biến dứa, mặt khác lại khai thác nguồn enzyme có giá trị Trên giới có nhiều công trình nghiên cứu dứa enzyme bromelain từ dứa