NUOI CẤY TẾ BÀO VÀ CHỌN DONG TẾ BÀO

Chương NI CẤY TẾ BÀO VÀ CHỌN DỊNG TẾ BÀO 7.1 Nuôi cấy tế bào đơn Bản thân tế bào thực vật đơn vị độc lập, chứa đựng tất thơng tin di truyền đặc trưng thể từ sinh Cho nên tế bào xây dựng lại tồn thể nhờ tính tồn Thực vật bậc cao nguồn cung cấp các hợp chất hóa học dược liệu quan trọng Tuy nhiên năm gần sản lượng các thực vật khó đảm bảo mức ởn định hậu số yếu tố như: - Điều kiện tự nhiên khơng thuận lợi - Chi phí lao động ngày tăng - Khó khăn kỹ thuật kinh tế trồng trọt Phương pháp nuôi cấy tế bào dịch huyền phù (dịch lỏng) thực vật có khả góp phần giải khó khăn trên.Những tế bào trải qua quá trình ni cấy sinh trương dịch huyền phù gọi dòng tế bào Dịng tế bào có đặc điểm sau: - Khả tách tế bào cao - Phát sinh hình thái đồng - nhân to tế bào chất đậm đặc - Nhiều hạt tinh bột - Có dẫn liệu tạo quan - Có khả nhân đơi 24-72 - Mất tính tồn - Tăng mức đa bội thể Dịch huyền phù được tạo nuôi cấy mảnh mô sẹo khả biệt hóa, mơi trường lỏng được chuyển động śt thời gian ni cấy.Có thể ni cấy mảnh mơ biệt hóa vào mơi trường thời gian nuôi cấy kéo dài tế bào nuôi cấy trạng thái tự Tuy nhiên khơng có dịch huyền phù có tế bào đơn Các tế bào liên kết với kích thước khác nhau, các tế bào phân chia tế bào chết Danh từ xốp (friability) dùng để tế bào tách rời sau phân chia Mức độ tách rời tế bào phụ thuộc khả tạo nhiều tế bào xốp được điều khiển bơi môi trường Tăng tỉ lệ Cytokinin/ Auxin sản xuất nhiều tế bào xớp Cần có lượng mơ sẹo ban đầu thích hợp 2-3 g/cm Khi mô sẹo được cấy vào dịch lỏng ta có giai đoạn Lag-phase Đây giai đoạn đầu tiên có tín hiệu phân chia đầu tiên, sau giai đoạn Exponential-phase Linear-phase; giai đoạn tế bào phân chia, tế bào tăng số lượng tăng quần thể nhanh Sau giai đoạn Stationary-phase giai đoạn tế bào không phân chia, lượng tế bào sinh chết Sau giai đoạn suy vong Những tiến kỹ thuật năm gần đã được nhiều cơng trình tởng kết Ni cấy tế bào thực vật điều kiện in vitro để sản xuất các chất tự nhiên có sớ ưu điểm sau: - Các tế bào thực vật được nuôi cấy các điều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết địa lý Không cần phải vận chuyển bảo quản số lượng lớn các ngun liệu thơ - Có thể kiểm soát chất lượng hiệu suất sản phẩm cách loại bỏ các trơ ngại quá trình sản xuất thực vật, chất lượng nguyên liệu thô đồng các lô sản xuất - Một sớ sản phẩm trao đởi chất được sản xuất từ ni cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hồn chỉnh - Một sớ sản phẩm trao đởi chất được sản xuất từ ni cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hồn chỉnh Thách thức lớn đới với công nghệ tế bào thực vật ổn định cho phép nuôi cấy tế bào thực vật quy mô lớn đạt hiệu suất tối đa cho tích lũy sản xuất các hợp chất tự nhiên (hay gọi các sản phẩm thứ cấp) Điều thực hiện cách chọn lọc các kiểu gen thích hợp các dịng tế bào có sản lượng cao, xây dựng các cơng thức mơi trường dinh dưỡng hợp lý để nuôi cấy tế bào, thiết kế vận hành các hệ thống nuôi cấy tế bào (bioreactor) hiệu Chúng ta sử dụng kinh nghiệm kiến thức có được từ nuôi cấy vi sinh vật để áp dụng cho nuôi cấy tế bào thực vật Tuy nhiên, tế bào thực vật vi sinh vật có sớ đặc điểm khác nhau, cần phải cải biến điều chỉnh các điều kiện ni cấy cấu hình nời phản ứng (bioreactor) để tìm được các u cầu đặc thù nuôi cấy tế bào thực vật Hình Thiết bị ni cấy tế bào đơn 7.2 Chọn dòng tế bào Kỹ thuật chọn dòng tế bào đã đời sớm nghiên cứu vi sinh vật Nhưng thực vật bậc cao, kỹ thuật được ứng dụng cách khoảng 20 năm Người ta tiến hành xử lý chọn lọc tế bào thực vật ba mức độ chính: - Mơ sẹo (callus) - Tế bào đơn (single cell) - Tế bào trần (protoplast) Mục đích chọn lọc in vitro khái quát điểm sau : - Chọn dịng tế bào chớng chịu các điều kiện bất lợi ngoại cảnh, ví dụ: chớng chịu nóng, lạnh, phèn, mặn, khơ hạn - Chọn dịng tế bào kháng các độc tố: độc tố nấm bệnh tiết ra, các loại kháng sinh - Chọn dòng tế bào sản xuất dư thừa (over production) các loại sản phẩm chủ yếu amino acid - Chọn các đặc điểm thị để nghiên cứu di truyền (genetic markers) Hiện tượng biến dị di truyền xuất hiện các tế bào khơng phân hóa (undifferentiation), các protoplast phân lập, các callus các mô nuôi cấy in vitro Nguyên nhân biến dị chủ yếu thay đổi số lượng cấu trúc nhiễm sắc thể Tính khơng đờng tế bào nuôi cấy tăng lên các nhân tố sau: (a) Nhiễm sắc thể trạng thái khảm có rối loạn di truyền các tế bào mẫu vật cấy gây (b) Các đặc tính khơng theo quy luật các điều kiện nuôi cấy gây Trong nuôi cấy mô, các kiểu thay đổi thường bị loại bỏ mục đích tăng các quá trình ni cấy ởn định di truyền Những nghiên cứu gần cho thấy các thí nghiệm ni cấy mô tế bào thường trải qua thay đổi di truyền (đa bội-polyploidy, lệch bội-aneuploidy, đứt gãy nhiễm sắc thểchromosomal breakage, khuyết đoạn-deletion, chuyển đoạn-translocation, khuếch đại gen-gene amplifications, đột biến-mutations), thay đổi biểu hiện mức độ sinh hóa phân tử Như vậy, ni cấy mơ tế bào thực vật có khả tạo biến dị di truyền tương đối nhanh không cần phải ứng dụng các kỹ thuật phức tạp khác Biến dị di truyền nuôi cấy mô biểu hiện thay đởi tính trạng các tái sinh sau truyền sang hệ sau phương thức nhân giớng hữu tính (ví dụ: rau diếp, th́c lá) dinh dưỡng (ví dụ: mía, khoai tây) Các biến dị chọn lọc được nuôi cấy mơ có nhiều cách gọi khác như: dịng callus (calliclones-từ ni cấy callus) dịng protoplast (protoclones-từ ni cấy protoplast) Năm 1981, Larkin Scowcroft dùng thuật ngữ chung biến dị dịng vơ tính (somaclonal variation), Evans cs (1984) lại dùng thuật ngữ biến dị dòng giao tử (gameclonal variation) cho các dòng bị biến đổi di truyền phát triển từ các tế bào giao tử thể giao tử Sự đa dạng biến dị các dịng vơ tính làm nởi bật thực tế biến dị dịng vơ tính cơng cụ hữu hiệu cho việc cải thiện di truyền trồng 7.2.1 Đặc tính tế bào thực vật ni cấy Sự ổn định các dòng tế bào được nuôi cấy thể hiện tốc độ sinh trương sinh tởng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị kinh tế, đặc biệt ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào qui mô công nghiệp Biến dị di truyền tế bào nuôi cấy sơ để thu nhận thể biến dị soma có đặc tính q Sự ởn định u cầu cần thiết cho việc vi nhân giớng các dịng tế bào chọn lọc ổn định tạo giống Một vấn đề khác được đề cập tới thông báo ni cấy tế bào Catharanthus tính khơng ởn định các dịng tế bào đới với việc tạo sản phẩm thứ cấp Một vài dòng khả tạo alkaloid tiến hành bảo quản chúng Vì thế, hiện tượng giảm suất khơng thể hồn tồn loại trừ được Khó khăn ngày trơ nên lớn đưa qui mô sản xuất lên dạng công nghiệp Như trước hết phải tiến hành chọn lọc dịng tế bào tỏ tương đới ổn định tiến hành nghiên cứu chế ngun nhân dẫn đến tính bất ởn định Hiện nay, người ta cần tuân theo qui trình được ứng dụng ngành vi sinh vật học nhằm thu được dịng tế bào có suất ởn định tất các giai đoạn nuôi cấy đồng thời để tránh hồn tồn dịng sản xuất Một sớ nghiên cứu cho thấy có dịng tế bào chun tạo sắc tớ có tính ởn định đặc biệt điều quan trọng vấn đề suất Thế nhưng, xét nghiên cứu di truyền có cơng trình phân tích sớ lượng nhiễm sắc thể dịng tế bào tạo nhiều caroten dịng khơng tạo caroten Daucus carota tác giả khơng tìm thấy sai khác hai dịng Sự ởn định suất quá trình cấy chuyển, người ta cấy chuyển khới callus có màu sắc đậm nhất, việc làm hồn tồn vơ ý thức Ngồi ra, người ta cịn phát triển kỹ thuật bảo quản đông lạnh đạt tới trình độ cho phép tránh hồn tồn xuất hiện thay đởi kỹ thuật đơng lạnh gây Phương pháp bảo quản cách giảm phân chia tế bào nuôi cấy nhiệt độ 0oC phương pháp có hiệu Việc tái thiết được suất dịng tế bào Catharanthus nêu được giải thích hiện tượng tái biến song toàn vấn đề tái thiết suất được giải thích dịng tế bào được nghiên cứu dịng epigenetic khơng phải dòng genetic Sự thật tế bào thực vật nuôi cấy mang nhiều đặc điểm không di truyền đã được biết khá kỹ Chỉ có sớ trường hợp người ta chứng minh được thay đổi dòng tế bào đột biến cụ thể genome plastome người ta chứng minh được có sản phẩm gen thay đởi, ví dụ enzyme thay đổi được tạo Như vậy, việc sử dụng dịng tế bào epigenetic khơng di truyền làm phức tạp hóa mục tiêu sản xuất các hợp chất thứ cấp nuôi cấy tế bào Thật khơng may mắn khó chọn được dịng tế bào khơng mang thay đởi khơng di truyền ḿn chứng minh điều phải tái sinh hồn chỉnh từ dịng tế bào sau tiến hành kiểm tra ni cấy mơ từ hạt thu được từ hồn chỉnh Loại tế bào dung ni cấy tế bào mô sẹo kết tế bào soma phản biệt hóa tế bào lai hữu tính Tính đa dạng dịng tế bào thuận lợi cho các nghiên cứu sinh học Những mơ sẹo đầu tiên, hình thành qua phân chia tế bào mô thường không đồng Những tế bào mô nuôi cấy khác nguyên nhân tính khơng đờng tế bào mơ sẹo tiền khơi Sự phân bào nguyên nhiễm bất thường s̉t quá trình phát sinh trì phát sinh dẫn đến hình thành tế bào đa bội, lệch bội tái xắp xếp lại nhiễm sắc thể Dùng tốc độ sinh trương điều kiện nuôi cấy thích hợp dẫn đến việc chọn lọc nhanh chóng tế bào khơng vào giai đoạn biệt hóa; mơ sẹo khơng đờng tiền khơi chuyển hóa thành tế bào mơ sẹo chặt sau chuyển hóa thành tế bào mô sẹo xốp, hai loại tế bào khơng có cấu trúc mơ học Thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy hormone xác định đặc tính sinh lí phát sinh biểu sinh tế bào phụ thuộc vào phần khác mô sẹo Kiểu di truyền loại thực vật chịu ảnh hương bơi các quá trình biến đởi xác định cấu trúc tốc độ sinh trương mơ sẹo Để có phân bào tế bào đơn, cần phải sử dụng môi trường giàu dinh dưỡng hay môi trường điều kiện cách nuôi cấy chung với mô dinh dưỡng hay lớp mô cung cấp dinh dưỡng Mật độ tế bào đơn cao giảm thể tích mơi trường thúc đẩy tế bào chuyển qua phân chia, điều kiện định trước để phát sinh phân bào tế bào khả phân chia Ni cấy tế bào thực vật bậc cao có tính hai mặt di truyền: 1- Nó mang tính sơ hữu thong tin di truyền cần thiết thể hiện mức độ tế bào Thông tin di truyền được thực hiện chức tế bào 2- Tế bào nuôi cấy trì thơng tin bở sung xác định khả sản xuất các chất Nguyên nhân gây chết quần thể tế bào invitro được phân chia theo các kiểu sau đây: - Có chết tế bào tất các phase chu kì tế bào - Sự chết xuất hiện phase giai đoạn giảm dần nuôi cấy giới hạn dưỡng chất hay ức chế các sản phẩm độc tớ quá trình trao đởi chất - Sự chết thể hiện trước tế bào phân chia 7.2.2 Nguyên liệu điều kiện nuôi cấy 7.2.2.1 Kiểu gen mẫu vật Kiểu gen ảnh hương lên tần số tái sinh tần sớ biến dị dịng soma Sun cs (1983) nghiên cứu khả tái sinh các thể đa bội 18 thứ (variety) khác lúa tái sinh được nhiều dạng bội thể khác thứ indica mà không tái sinh được thứ japonica Mẫu vật được sử dụng từ nhiều nguồn mô khác lá, rễ, lóng (internodes), bầu (ovaries) hoa tự (inflorescenes) Ng̀n mẫu vật được xem quan trọng việc xuất hiện biến dị dòng soma Nghiên cứu phong lữ (geranium) cho thấy các biến dị soma thu được từ cành giâm cuống lá (petiole cuttings) rễ in vivo, từ cành giâm thân (stem cuttings) Cây dứa (Ananas cosmosus) phát triển từ callus hom giâm (slip), chồi đỉnh chồi nách (crown and axillary bud) cho thấy có biến đổi đặc điểm gai (spine), các phát triển từ callus tụ (syncarp) cho thấy có biến dị màu lá, gai, lớp sáp (wax) tán lá (foliage) (Wakasa 1979) Van Harten cs (1981) quan sát thấy có thay đởi hình thái 12,3% khoai tây tái sinh từ mảnh lá (leaf discs), ngược lại có tới 50,3% các biến dị có ng̀n gớc từ callus cuống (rachis) cuống lá Các tác nhân chọn lọc khác được sử dụng dựa vào các nguồn mẫu vật khác nuôi cấy, tạo dãy biến dị dòng soma các tái sinh 7.2.2.2 Ảnh hưởng của phytohormone Nồng độ cao các nhân tố điều khiển sinh trương ảnh hương đến thay đổi kiểu nhân các tế bào nuôi cấy 2,4-D cảm ứng biến dị nhiễm sắc thể các tái sinh nuôi cấy mô lúa mạch (Deambrogio and Dale 1980) khoai tây (Shepard 1981) hiện diện nồng độ cao môi trường Tương tự, các biến dị dịng soma các lồi Nicotiana cảnh (ornamental nicotiana) thu được từ mẫu lá mơi trường có cung cấp BAP từ 5-10 mmol/L (Bravo and Evans 1985) Các phytohormone cần thiết cho cảm ứng phát sinh quan phân hóa chời; nhiên, nồng độ cao các chất không cho phép tái sinh thành hồn chỉnh ni cấy mô tỷ lệ phytohormone môi trường cần được điều chỉnh cẩn thận các hệ thống nuôi cấy nhân giớng in vitro cho các biến dị dịng soma 7.3 Biến dị dòng tế bào 7.3.1 Cơ sở phân tử của biến dị Các biến dị xuất hiện kết thay đổi tinh vi các đột biến đơn gen xuất hiện nuôi cấy, các đột biến biểu hiện rõ ràng khơng có thay đởi thuộc nhân (karyological changes) Các đột biến lặn không phát hiện được R (các tái sinh in vitro từ các tế bào mô bất kỳ), biểu hiện hệ R (thế hệ thu được sau tự thụ phấn (selfing) R 0) Thế hệ F1 phân ly tính trạng quan tâm theo quy luật Mendel với tỷ lệ 3:1 Những phân tích sâu đã xác định chất biến dị Biến dị dòng soma các đột biến lặn đơn gen đã được tìm thấy ngơ, Nicotiana sylvestris, lúa lúa mì Trong sớ trường hợp đặc biệt, các dòng thị di truyền (thiếu chlorophyll) đã giúp đánh giá các tái sinh từ nuôi cấy tế bào Những thay đổi hệ gen (genome) tế bào chất được quan sát các dịng soma Ở ngơ có hai tính trạng thuộc tế bào chất: (a) mẫn cảm với độc tố chiết từ Drechslera maydis nòi T-tác nhân gây bệnh rụi lá (leaf blight) giống ngô Southern, (b) tế bào chất bất dục đực Texas (cms-T) Cả hai tính trạng được điều khiển bơi mtDNA (DNA ty thể) Một hướng khác đột biến đơn gen biến dị dịng soma liên quan với các nhân tớ gen nhảy (transposable elements) Chourey Kemble (1982) đã phát hiện biến dị kết xen đoạn các DNA giống plasmid (plasmid-like DNA) hệ gen ty thể nuôi cấy tế bào ngô cms-s Những thay đổi cảm ứng gen nhảy được thông báo chi tiết các dịng th́c lá, alfalfa lúa mì Biến dị dịng soma xuất hiện thay đởi phân tử gây hiện tượng trao đổi chéo nguyên phân (mitotic crossing over-MCO) các tái sinh Hiện tượng bao gồm hai trường hợp biến dị đối xứng bất đới xứng Các đột biến đơn gen bơi MCO hình thành chế thớng các biến dị di truyền Những thay đổi nhỏ cấu trúc các nhiễm sắc thể dẫn đến thay đổi biểu hiện chuyển giao di truyền (sang hệ sau) các gen đặc trưng, khuyết đoạn (deletion) nhân đoạn (duplication) (hoặc nhiều sao) gen, biến đởi gen các quá trình sửa chữa Sự tái tổ hợp sau, đứt gãy nhiễm sắc thể vùng ưu tiên các “điểm nóng” di truyền (hot spots) các nhiễm sắc thể đặc biệt ảnh hương đến hệ gen dẫn đến thay đổi biểu hiện phenotype Các nghiên cứu gần đã chứng minh thay đổi DNA quan tử, các profiles protein isoenzyme liên quan với xuất hiện biến dị dòng soma thực vật (lúa mì, lúa, khoai tây, ngơ, lúa mạch lanh) DNA quan tử được tinh tương đới dễ có chuỗi nucleotide phức tạp Một sớ enzyme cắt hạn chế dễ dàng phân biệt các kiểu cytosinemethylation (thay đổi các biến dị dịng soma) bên ngồi bên vị trí cắt hạn chế Các dịng soma lúa mì có biến đổi mặt bên gliadin Ở lúa mạch, các biến dị thường có ng̀n gớc từ ni cấy callus; biến dị có liên quan tới các đoạn spacer rDNA các hordein đã được tìm thấy 7.3.2 Bản chất biến dị dịng giao tư Nguyên liệu di truyền các tế bào mơ soma được phân bớ cách bình thường thơng qua quá trình ngun phân (mitosis) Ngược lại các giao tử, chúng sản phẩm quá trình giảm phân (meiosis), nhận bổ sung di truyền với các allele theo các quy luật phân ly độc lập theo Mendel Để phân biệt các dịng soma có ng̀n gớc soma các dịng giao tử có ng̀n gớc giao tử, người ta dùng thông số khác Thứ nhất, hai loại gen đột biến lặn trội cảm ứng bơi biến dị dòng giao tử biểu hiện trực tiếp các đơn bội tái sinh từ tiểu bào tử (microspores) các bao phấn nhị bội (từ chúng có gen) Điều cho phép phân tích trực tiếp các dịng giao tử (R 0) để xác định các thể biến dị Thứ hai, các thể tái tổ hợp phát triển các dòng giao tử kết tổ hợp chéo giảm phân (meiotic crossing over) Thứ ba, dịng giao tử được dùng sau có được ởn định nhờ gấp đơi sớ lượng nhiễm sắc thể Giá trị biến dị dòng giao tử cải thiện di truyền rõ ràng từ phát triển các dòng đơn bội kép (double-haploid) cách nuôi cấy bao phấn các lai F lúa mì lúa Ni cấy bao phấn đã được sử dụng để phát triển các tái tổ hợp thể lai F lúa mì giớng Xian nog 5675 (một thứ có mày trắng, râu đầu hạt thóc, cụm hoa hình chùy cuống hoa ngắn) giống Jili (một thứ có mày màu đỏ, có râu, cụm hoa hình thoi cuống hoa cao) Một số đơn bội kép đã được phát triển biểu hiện các đặc điểm hỗn hợp hai bố mẹ Biến dị tái sinh từ mô thể giao tử đã được thông báo số trường hợp khám phá “dị hợp tử dư” (residual heterozygosity, thường có vi khuẩn) Hướng nghiên cứu khám phá các dị hợp tử dư thực vật nuôi cấy bao phấn từ các thể đơn bội kép kiểm tra biến dị xuất hiện các chu trình sinh sản đơn tính (androgenesis) Kiểm tra các có ng̀n gớc từ chu trình thứ hai ni cấy bao phấn đơn bội kép th́c lá đã tìm được các biến dị suất, chiều cao cây, ngày hoa, hàm lượng alkaloid tổng số Các biến dị tương tự đã được thông báo các từ thể đơn bội kép N sylvestris phát triển sau sớ chu trình sinh sản đơn tính Các biến dị dịng giao tử kết các nhân tố gây tái tổ hợp giảm phân các đột biến trước nuôi cấy bao phấn 7.3.3 Đột biến hay thay đởi hoạt tính gen Đột biến phải kết rõ ràng thay đởi cấu trúc bậc DNA có di truyền dẫn đến biến đởi tính trạng, đột biến phải thay đổi lâu dài di truyền cấu trúc bậc DNA dẫn đến biến đởi tính trạng Thơng thường ni cấy tế bào thực vật đột biến được chọn lọc thông qua thay đởi tính trạng tế bào Những thay đởi tính trạng tế bào kết thay đởi hoạt tính gen Ví dụ: Dịng tế bào thuốc lá kháng cycloheximide Maliga (1976) cấy chuyển 1-2 lần sang mơi trường khơng chứa cycloheximide khả kháng cycloheximide Điều chứng tỏ tính kháng cycloheximide gen bình thường khơng thể hiện - Tương tự người ta gặp dịng tế bào cà rớt chớng chịu 2,4-D Widholm (1977) - Dịng tế bào cà rớt kháng colchicine kết thay đởi tính chất màng tế bào Các dạng biến đổi chế khơng di truyền (epigenetic mechanism) điều khiển Thay đởi tính trạng đột biến phải tính trạng chuyển qua hệ sau sinh sản hữu tính được Đột biến DNA nhân phân ly theo định luật Mendel sau lai, đột biến DNA quan tử lục lạp ty thể di truyền theo đường mẹ Cho tới lúc lai xong, tớt nên gọi các dịng vừa phân lập được các dòng tế bào (hoặc các dạng thay đởi tính trạng) Khi tái sinh từ dịng tế bào xuất hiện khơng di truyền tính trạng đã chọn Điều giải thích sau: lúc chọn sớ tế bào mẫn cảm được bảo vệ bơi các tế bào chống chịu xung quanh cách cung cấp các sản phẩm trao đổi chất enzyme qua các khe tế bào, tế bào mẫn cảm xuất hiện thông qua hiện tượng tách tế bào vô tính, hiện tượng tạo khảm biến đởi di truyền (back mutation-thoái biến) không di truyền (epigenetic) Các dạng biến đổi chọn được nuôi cấy in vitro thường xuất hiện với tần số 10-5-10-8 không xử lý đột biến Nếu xử lý tăng được tần sớ lên 10 lần Các tác nhân gây đột biến thường được sử dụng là: - Ethylmethane sulphonate (EMS) - N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine (MNNG) - N-ethyl-nitrosourea (ENU) - Tia X tia UV Chưa có sớ liệu cụ thể nồng độ, phổ tần số đối với loại tác nhân bơi độ lớn khới tế bào được xử lý, mật độ tế bào gieo đĩa petri số nhiễm sắc thể karyotype tế bào bị xử lý Sử dụng protoplast thực vật bậc cao phương pháp tớt để tiếp cận vấn đề 7.4 Nguyên tắc chọn dịng tế bào 7.4.1 Chọn trực tiếp Thơng qua ưu sinh trương hay khác biệt thấy được màu sắc chọn được dịng tế bào từ q̀n thể tế bào Một sớ dịng có khả kháng kháng sinh, kháng các chất đồng đẳng amino acid chớng chịu ḿi chọn trực tiếp từ quần thể tế bào Hệ thống tế bào hay được sử dụng các tế bào dịch huyền phù khối callus Điều kiện chọn lọc các độc tố với nồng độ khác gây tác động trực tiếp lên sinh trương tế bào Những tế bào có khả phân chia môi trường chứa độc tố với nồng độ tăng dần từ lần cấy chuyển đến lần cấy chuyển khác được sàng lọc dần (chọn lọc kiểu bậc thang) Hoặc đưa quần thể tế bào vào điều kiện mơi trường ức chế sinh trương hồn tồn để chọn tế bào sớng sót, nhiên ngưỡng tối đa mức độ nồng độ tác nhân chọn lọc cần phải được thăm dị trước khơng ức chế phát triển các tế bào đột biến quần thể tế bào nuôi cấy Thông thường, người ta trộn tế bào vào môi trường thạch chứa dược tố chọn tế bào sống sót phân chia thành khuẩn lạc mơ sẹo, cấy trực tiếp lên môi trường chọn lọc chứa độc tớ Dịng chớng chịu thường xuất hiện từ phần khối tế bào nuôi cấy 7.4.2 Chọn gián tiếp Trong trường hợp đặc điểm dòng được chọn kết biểu hiện khuyết tật tế bào Thí dụ điển hình chọn dịng thiếu enzyme nitrate reductase (NR) Trên môi trường chứa ClO 3- tế bào có NR sử dụng ClO 3- NO -3 khử thành ClO -2 , ClO -2 tác dụng độc tớ có tế bào khơng có NR sớng sót mơi trường chọn lọc 7.4.3 Chọn tổng thê Các tế bào dị dưỡng thực vật thường được chọn phương thức xử lý đột biến nuôi môi trường có chứa yếu tớ dinh dưỡng cần thiết có lại yếu tớ gây đột biến, ví dụ: đột biến lặn chịu được S-2-aminoethyl cysteine xuất hiện sau xử lý đột biến phôi nuôi cấy 7.5 Cách chọn dịng tế bào 7.5.1 Khơng có tác nhân chọn lọc Các tế bào callus không tổ chức (unorganised), sinh trương nuôi cấy in vitro các thời kỳ khác môi trường không chứa tác nhân chọn lọc (độc tố các chất ức chế), được cảm ứng để phân hóa các hồn chỉnh Các tái sinh được trồng đồng ruộng để chọn lọc các biến dị Bằng phương thức người ta đã thu được các biến dị dòng soma các lồi trờng khác 7.5.1.1 Cây mía đường (Saccharum officinarum) Cây biến dị phân lập từ nuôi cấy mô tế bào được xác nhận đầu tiên mía Cơng việc bắt đầu đảo Fiji (Nhật), phân lập các dịng phụ (subclones) giớng mía Pindar để kháng bệnh Fiji (do virus aphid-transmitted) bệnh mốc sương (downey mildew) (do Scelerospora sacchari) Tính kháng được trì các dịng soma qua vài hệ trờng đồng ruộng Ở Australia, Larkin Scowcroft (1981), đã khai thác khả tạo các biến dị nuôi cấy mô để cải thiện số giá trị nông học giớng mía Q101 kháng bệnh đớm mắt (do Helminthosporium sacchari) Tương tự, Liu (1981) đã xác định các dịng callus mía cho ưu giớng (thứ) địa phương tốt (F160, Taiwan) suất, hàm lượng đường khả kháng bệnh than (do Ustilago scitaminea) 7.5.1.2 Cây khoai tây (Solanum tuberosum) Shepard cs (1980) đã tái sinh số lớn từ protoplast tế bào thịt lá giống “Russet Burbank” thông báo các biến dị thu được quần thể protoclones Một số chúng kháng được bệnh thối sớm (early blight-do Alternaria solani) thối muộn (late blight-do Phytophtora infestans) Các protoclone kháng virus Y xoắn lá (leaf-roll) đã xuất hiện đồng ruộng (Thomson cs 1986) Biến dị di truyền khoai tây phát triển từ tái sinh ni cấy mơ di truyền sang hệ sau thông qua sinh sản sinh dưỡng (Sree Ramulu 1986) Các biến dị phân lập các tái sinh từ callus giống Bintje, cho các dịng-sản xuất phương thức sinh dưỡng-mang các tính trạng suất, kháng bệnh thối muộn nấm vảy (scab) đồng ruộng tốt 7.5.1.3 Cây cà chua (Lycopersicum esculentum) Evans cs (1987), đã phân lập các dịng soma cà chua các biến dị hình thái, các đột biến lặn tính bất dục đực kháng nấm Fusarium oxysporium mắt cuống lá, khả Sơ đờ 7.2 Chọn dòị̀ng kháá́ng Helminthosporium maydis ởở̉ ngô Kháng độc tố nấm bệnh rỉ sắt tính bất dục đực di truyền đường mẹ đột biến gen gây nên, tế bào chất có quần thể genome các quan tử, chọn lọc tính chịu bệnh tức chọn gen thích hợp q̀n thể Tính kháng thường mtDNA định, tính bất dục đực trường hợp mtDNA định Ở thuốc lá, người ta chọn lọc được đột biến kháng methionine sulfoximine, độc tố Pseudomonas tabacci tiết (P tabaci gây bệnh cháy rụi thuốc lá) 7.5.2.3 Kháng chất diệt cỏ Sinh trương cỏ dại quần thể các trồng quan trọng nông nghiệp thường được điều chỉnh các chất diệt cỏ Vì các chất diệt cỏ (herbicide) có thời gian sớng dư ngắn (short residual life), nên chúng được ứng dụng lặp lại nhiều lần trồng Một số trồng đã trơ nên nhạy cảm với chất diệt cỏ việc sử dụng lặp lại Hơn nữa, phương pháp điều chỉnh cỏ dại khơng kinh tế các chất diệt cỏ hầu hết đắt tiền Phương pháp nuôi cấy in vitro cho phép thu được các biểu hiện tính chớng chịu đối với các chất diệt cỏ Nuôi cấy protoplast mơi trường có các chất diệt cỏ khác đã cảm ứng đột biến tạo các dịng tế bào chớng chịu sau tái sinh thành Các kháng các chất diệt cỏ tái sinh từ tế bào nuôi cấy bao gồm Nicotiana tabacum (kháng amitrole, bentazone, chlorosulphon, isopropyl Ncarbamate, phenmedifarm, picloram paraquat), Corydyllis (kháng glyphosphate), Medicago sativa (kháng glufosinate) Một sớ tính trạng chớng chịu được di truyền các đơn allele (monogenic alleles) trội lặn (Bảng 7.2) Khả chống chịu chất diệt cỏ được biến nạp vào tế bào cách lai soma (xem chương 5) thông qua công nghệ chuyển gen (xem chương 6) Bảng 7.2 Các dịng tếbào đột biến mang tính trạng hữu ích nơng nghiệp thu từni cấy in vitro Tác nhân chọn lọc Loài Tác Tái nhân đột sinh biến Chịu lạnh Daucus carota EMS Nicotiana sylvestris Khơng Có Asulam Apium gravaeolens Khơng Khơng Bentazone Nicotiana tabacum Tia  (1n) Có(c) 2,4-D Lotus corniculatus Khơng Có 2,4-D; 2,4,5-T; 2,4-DB Trifolium repens Khơng Khơng Có(e) Kháng các chất diệt cỏ Isopropyl-N-phenyl- Nicotiana tabacum carbamate Có(c, EMS d) Tia X Có(c) Paraquat Nicotiana tabacum Phenmedifarm Nicotiana tabacum Tia  (1n) Có(c) Picloram Nicotiana tabacum Khơng Có(c) Solanum tuberosum Khơng Có Zea mays T-cms Khơng Có(c) Solanum tuberosum Khơng Có(c) Capsicum annum Khơng Khơng Datura innoxia Khơng Có Kickxia ramosissima Khơng Có Khơng Khơng Medicago sativa Khơng Khơng Oryza sativa Không Không Nicotiana sylvestris Không Không Nicotiana sylvestris EMS Có Nicotiana tabacum Khơng Kháng các pathotoxins Fusarium oxysporum Helminthosporium maydis Phytophthora infestans Chống chịu muối Nicotiana tabacum Có(c) Chú thích (c) Cây kháng (d) Cây bất thụ (e) Không biểu hiện 7.5.2.4 Chống chịu các stress của môi trường Stress môi trường nồng độ muối cao đất nhân tố kìm hãm phát triển nơng nghiệp Từ kết đầu tiên tái sinh thuốc lá in vitro chống chịu NaCl (Nabors 1980), đến người ta đã phát triển sớ lượng lớn các dịng tế bào trờng chớng chịu nờng độ ḿi cao (Nguyễn Hoàng Lộc 1992) Dix (1977) đã phát triển các dịng chớng chịu lạnh cách ni cấy tế bào Nicotiana sylvestris điều kiện nhiệt độ thấp Tuy nhiên, phenotype các tái sinh từ dịng khơng được chuyển sang hệ sau phương thức hữu tính Lê Trần Bình (1992) đã thu được các dịng lúa chịu nhiệt độ thấp thơng qua nuôi cấy mô callus Các kết tương tự theo hướng biến dị dịng soma mang tính trạng chớng chịu stress nước được cảm ứng PEG mannitol (mannitol or PEG-induced water stress) nuôi cấy mô callus th́c lá, mía lúa đã được thơng báo (Ngũn Hồng Lộc 1992, 2003; Razdan 1994; Trương Thị Bích Phượng 2004) 7.5.2.5 Các dòng khuyết dưỡng Các dạng khuyết dưỡng được sử dụng cho biến nạp DNA, lai soma nghiên cứu các quá trình trao đởi chất Sử dụng nuôi cấy tế bào đơn bội xử lý đột biến gen tiện lợi cho phát triển số lớn các loại khuyết dưỡng Các dòng tế bào khuyết dưỡng đầu tiên được Carlson (1970) thông báo thuốc lá đơn-nhị bội (dihaploid) sinh trương chậm môi trường tới thiểu địi hỏi trao đởi chất đặc biệt để hời phục lại sinh trương bình thường Các dịng khuyết dưỡng phân lập được ni cấy in vitro các loài thực vật khác bao gồm các yêu cầu: (a) pathotenate, adenin isoleucine + valine Datura innoxia; (b) histidine, tryptophan nicotinic acid Hyoscyanus muticus; (c) isoleucine, leucine, uracil Nicotiana plumbaginifolia Các dịng Datura được phân lập ni cấy dịch huyền phù tế bào Thông qua dung hợp bở sung (fusioncomplementation), các dịng khuyết dưỡng N plumbaginifolia H muticus được xác định trạng thái lặn Chlorate ( ClO )-một dạng tương tự nitrate-được biến đổi nhờ enzyme nitrate reductase trơ thành chlorite ( ClO -2 ), loại độc tố tế bào Vì vậy, mơi trường được bở sung chlorate các tế bào dạng hoang dại có hoạt tính enzyme nitrate reductase bị chết, các tế bào khơng có enzyme sớng sót Các thể hời biến (revertants) dạng hoang dại được kiểm tra khả sử dụng NO môi trường ni cấy các tế bào Các dịng thiếu nitrate reductase được phân lập từ các tế bào nuôi cấy N tabacum, N plumbaginifolia, H muticus, D innoxia, Rosa damascena Petunia Người ta sử dụng các loại dịng tế bào các đặc tính chúng đặc điểm thị nghiên cứu điều khiển di truyền kỹ thuật gen Hai loại dòng tế bào đã được xác định: loại đột biến (nia) không tổng hợp apoenzyme, loại (cnx) không tổng hợp cofactor Các phenotype được sử dụng các marker bổ sung việc chọn lọc các thể lai soma Sơ đồ 7.3 Dòng cnx nia về gen NR thuốc lá Bảng 7.3 Các đột biến khuyết dưỡng chọn lọc nuôi cấy in vitro Nhu cầu dưỡng/ dinh Lồi Tác nhân đột biến Tái EMS Khơng kiểu hình Adenine Datura innoxia (1n) p-aminobenzoic acid Nicotiana (1n) tabacum EMS Có Arginine Nicotiana (1n) tabacum EMS Có Biotin Nicotiana (1n) tabacum EMS Có Histidine Hyoscyamus muticus NTG (1n) Có Hypoxanthine Nicotiana Có tabacum EMS sinh (1n) 7.5.2.6 Kháng kháng sinh (antibiotic resistance) Maliga (1973) chọn lọc thành công dịng tế bào th́c lá kháng streptomycin di truyền đường mẹ Streptomycin ức chế sinh tổng hợp protein lục lạp, ty thể không ảnh hương đến sinh tổng hợp protein ribosome tế bào chất Dòng tế bào kháng streptomycin có màu xanh được chọn cách tách cụm tế bào xanh môi trường chứa streptomycin Dịng tế bào có màu trắng được chọn thơng qua khả sinh trương môi trường chứa streptomycin Khả kháng lục lạp ty thể quan tử định Ngồi ra, người ta cịn phát hiện được tính kháng tở hợp nghĩa chọn lọc tính kháng loại kháng sinh kháng được sớ kháng sinh khác Ví dụ: dịng N sylvertris kháng kanamycin kháng được streptomycin neomycin 7.5.2.7 Kháng các đồng đẳng base của DNA Trong nuôi cấy mô tế bào động vật người ta dùng: 5-bromodeoxy uridin (BUdR) 8azaguanidin (AG) để chọn dòng tế bào đột biến thiếu thymidinkinase (TK) hypoxanthin guanidin phosphoribosyl transferase (HGPRT) Cơ chế chọn lọc sau: - Các tế bào có TK HGPRT bình thường sử dụng BUdR AG các nucleotide cho sinh tổng hợp DNA DNA mang BUdR AG khơng bình thường tế bào chết - Những tế bào thiếu TK HGPRT không sử dụng BUdR AG chúng sống được Các nhà nuôi cấy mơ thực vật sử dụng mơ hình đới với tế bào thực vật bước đầu thu được sớ kết Ví dụ: chọn được dịng tế bào th́c lá có hoạt tính HGPRT giảm 50%, song các dịng kháng BUdR có hoạt tính enzyme lại phụ thuộc TK khá lớn Điều được giải thích sau: tế bào thực vật có hai loại TK, phải chọn được hai tế bào đột biến đờng thời hồn tồn hoạt tính TK Mặt khác dòng tế bào đậu tương kháng BUdR Okyana (1976) lại tế bào có khả sản xuất dư thừa thymidin Cũng thể có tế bào có chế sửa chữa DNA tốt cho phép chúng sửa được sai lệch BUdR hay AG gây chúng có khả kháng BUdR AG 7.6 Nuôi cấy tế bào sản xuất hợp chất tự nhiên 7.6.1 Phương hướng chiến lược sản xuất các sản phẩm thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào Mặc dù nhiều trường hợp các hợp chất có giá trị chữa bệnh hồn tồn thu được được sản xuất với hàm lượng nhỏ người ta tởng kết chung được rằng: Mỗi tế bào đều có khả biểu hiện tính toàn thể hóa học cũng hình thái học Một vài ví dụ chứng minh cho chiến lược chung mà cần phải tuân theo để có được các dịng tế bào có suất cao Đầu tiên cấy gây nuôi cấy tế bào loài thực vật sản sinh hợp chất cần có (nên chọn lồi có suất cao) sau tiến hành chọn tính ởn định dòng tế bào khác từ thể khác để tìm dịng có suất cao Theo phương thức dịng tế bào có suất alkaloid cao được chọn từ nuôi cấy mô Catharanthus dịng tế bào với hoạt tính hydroxyd hóa cao được chọn từ nuôi cấy Digitalis Tuy nhiên, dòng tế bào Digitalis thời điểm hiện không sản sinh cardiac glycoside Kỹ thuật chọn dòng đã được ứng dụng để chọn dòng tế bào sản xuất nhiều nicotin từ dòng tế bào Nicotiana rustica đã hồn tồn khả tởng hợp alkaloid Phương pháp chọn dòng đã được cải tiến cách kết hợp với phương pháp phân tích có độ nhạy tính đặc thù cao hơn, ví dụ miễn dịch phóng xạ Mặc dù khơng phải tiền đề cần thiết trường hợp Đương nhiên, đường tới ưu tìm được phương pháp cho phép xác định sản phẩm thứ cấp tế bào sống, chẳng hạn thông qua các chất huỳnh quang UV hay chất có màu sắc nhận thấy được Thế thực tế khó tìm chất màu có khả thâm nhập vào không bào nơi các sản phẩm thứ cấp được tích trữ để tạo phản ứng màu mà khơng làm chết tế bào Sự phân lập các dịng tế bào chịu p-fluorphenylalanine, có dịng có hoạt tính enzyme tăng lên hàm lượng cao các hợp chất fenol tan etanol cho thấy triển vọng khác việc chọn dịng tế bào Đó cách sử dụng các chất đặc biệt gây áp lực chọn lọc để phân lập tế bào sản xuất dư thừa các sản phẩm thứ cấp thực vật điều kiểm nghiệm với ni cấy tế bào tạo alkaloid có ng̀n gớc các acid amin Tuy nhiên, người ta cần thấy việc sản xuất các amino acid đặc thù yếu tớ hạn chế đới với quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp tế bào mà cịn có nhiều yếu tớ khác cần đề cập tới Một bước phải cải tiến qui trình ni cấy cách thay đởi hợp lý môi trường, nhiều tài liệu đã thông báo người ta thay đổi hàm lượng hormone, đường, vitamin, nhiệt độ Hàng loạt biến đổi môi trường, điều kiện ni cấy thay đởi dịng tế bào được kiểm nghiệm hệ thống kiểm định phương pháp giọt nhỏ kết hợp với phương pháp miễn dịch phóng xạ Nghiên cứu thay đởi môi trường nuôi cấy được cải tiến thêm bước kỹ thuật ni chemostat (thể ởn định hóa tính) được ứng dụng 7.6.2 Nuôi cấy tế bào suất cao Nuôi cấy tế bào nhiều dược liệu đã được tiến hành nhiều trường hợp người ta khơng tìm thấy thấy với lượng nhỏ (dạng vết) các hợp chất ḿn có Tuy nhiên, tới thực tế đã cho thấy có thí nghiệm ni cấy tế bào thực vật có khả sản xuất các sản phẩm thứ cấp thực vật với hàm lượng lớn hàm lượng các chất phận thực vật có nhiệm vụ tích trữ các hợp chất đặc biệt Ni cấy đầu tiên được phân lập có chứa hàm lượng cao các sản phẩm thứ cấp các ni cấy sản xuất các hợp chất sắc tố anthocyanin tế bào Haplopappus, betalain callus củ cải đường anthraquinon tế bào Lithospermum erythrorhizon, Morinda citrifolia các loài Galium Trong trường hợp Morinda Galium, người ta đã nâng được hàm lượng anthraquinon nuôi cấy tế bào lên 20 lần so với rễ quan tích trữ các hợp chất các nói Kể người ta so sánh hàm lượng các chất tế bào tế bào chuyên sản sinh các chất hàm lượng tế bào ni cấy lớn từ 2-4 lần Hàm lượng tương đối cao ubiquinon-10 được tìm thấy tế bào th́c lá L-dopa môi trường nuôi cấy tế bào Mucuna pruriens Nhiều cơng trình cho thấy ni cấy callus tế bào Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với dược liệu bình thường Người ta đã phân lập được các dòng tế bào Catharanthus sản xuất serpentin ajmalicin từ nuôi cấy in vitro Bằng loại môi trường sản xuất đặc biệt họ đã đưa được sản lượng alkaloid hai dịng tớt lên mức cao nữa, dịng tạo được 162 mg/L serpentin, dòng tạo được 72 mg/L serpentin với 264 mg/L ajmalicin Cũng đáng ý nuôi cấy tế bào Panax pseudoginseng cho hàm lượng saponin khá cao nuôi cấy tế bào Glycyrrhiza glabra đạt được hàm lượng glycyrrhizin từ 3-4% trọng lượng khô Hàm lượng chất thứ cấp cao được xác định nuôi cấy tế bào Coleus blumei, 13-15% trọng lượng khơ chất rosmarinic acid chu kỳ nuôi 13 ngày Nồng độ rosmarinic acid tế bào nuôi cấy lớn năm lần so với Trên lĩnh vực steroid chuyển hóa steroid các dịng tế bào có suất cao đã được nghiên cứu Một sớ cơng trình đã ni cấy thành công tế bào Dioscorea deltoidea với sản lượng diogenin ngun liệu thơ để sản xuất các steroid chống thụ thai các hormone thượng thận Quá trình chuyển hóa các steroid được khá nhiều phịng thí nghiệm nghiên cứu Chẳng hạn, nghiên cứu quá trình sinh chuyển hóa các hợp chất glycoside cardiac nuôi cấy tế bào Digitalis lanata tế bào Digitalis lanata ngừng sản xuất glycoside cardiac chúng có khả hydroxyd hóa digitoxin nguyên tử C 12 để tạo digoxin Digoxin hợp chất có ý nghĩa y học lớn digitoxin Quá trình hydroxyd hóa xảy ni cấy tế bào nhanh hiệu đưa vào môi trường nuôi cấy chất β-methyl-digitoxin Sau 12 ngày người ta thu được g β-methyl-digoxin bình ni dung tích 20 lít Ngồi ra, người ta cịn thu được các chất caffein từ nuôi cấy tế bào Coffea arabica, berberin từ tế bào Coptis japonica (lồi phải trờng từ 4-6 năm thu được hàm lượng đáng kể berberin rễ, song hàm lượng thu được sau tuần phương pháp nuôi cấy tế bào) Những chất được sử dụng rộng rãi công nghệ hương liệu y học Chất reserpin chất có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp các bệnh rới loạn t̀n hồn khác được sản xuất phương pháp nuôi cấy tế bào Rauwolfia serpentina Nuôi cấy tế bào 30 ngày sản xuất được 3500 kg reserpin, tương đương với lượng hàng năm giới thu được từ rễ Chất naptathoquinones chiết từ rễ cỏ rễ máu (puccoon) được dùng để chữa bỏng bệnh da Chất được sản xuất phương pháp nuôi cấy mô, sản lượng chất được tạo từ mô nuôi cấy cao tám lần so với tự nhiên Các nhà nghiên cứu thuộc tổ hợp dược phẩm Gibageigy (Based, Thụy Sĩ) đã sản xuất được loại alkaloid scopolanin từ tế bào Hyoscyanus aegypticus nuôi cấy hệ lên men khơng có cánh khuấy Bằng cách chọn lọc các dòng tế bào cao sản nhờ kỹ thuật đột biến tế bào trần, biến dị đơn dòng kỹ thuật gen, người ta đã làm tăng sản lượng scopolamin gấp ngàn lần Tóm lại, ni cấy mơ tế bào thực vật có khả sản xuất các hợp chất thứ cấp với suất cao vài trường hợp cao hẳn so với hồn chỉnh có suất cao Bảng 7.4 Sựtích lũy chất trao đởi thứcấp nuôi cấy mô vàtếbào Các chất trao đổi thứ cấp Loại nuôi cấy Nguồn thực vật - Anthocyanins Cyanidin C Dimorphothica auriculata C Haplopappus gracilis C D auriculata Alizartin C Morinda citrifolia Digitolutein C Digitalis lanata 4-hydroxydigitolutein C D lanata 3-methyl purpurin C D lanata Rhein C Cassia angustifolia C Ruta graveolens C, SC Phaseolus aureus C, SC Glycine max C P aureus Coumestrol C, SC P aureus Pisatin C Pisum sativum Soyagol C, SC P aureus Delphinidin - Anthraquinones - Carotenoids Antheraxanthin Beta-carotene Lutein Lutein-5, epoxide Neoxanthin Voilaxanthin Zeaxanthin - Chalcones and Deoxyflavones Daidzein 2’,4,4’-trihydroxy chalcone - Coumestanes Coumarino chromans - Flavones Flavanoids Apigenin SC G max C Solanum dulcamara C Trigonella corniculata Artimissinine C Artemisia scoparia Chrysoerion SC Petroselinum hortense Isorhamnetin SC Argemone mexicana SC P hortens C Agave wightii C Allium sativum C A scoparia C Dolichos lablab C G max C P sativum C Lycopersicon esculentum C Datura pinnata SC Papaver hortense Negretin SC Solanum tuberosum Nobeletin C Citrus aurantinum Quercetin C A wightii SC Crotalaria juncea C Datura metel C D taluta C L esculentum C P hortense C S aviculare C C aurantium C Plumbago zeylanica C Yucca aloifolia Keempferol Luteolin Sinensetin - Naphthoquinones Plumbagin - Sapogenins Chlorogenin Hecogenin Sarsasapogenin Smilagenin Tiggenin Diosgenin C S aviculare C S dulcamara C S nigrum C S xanthocarpum Gitogenin C A wightii Hecogenin C A wightii Tiggenin SC S nigrum SC Andrographis paniculata - Sesquiterpenes Cryophyllenebisabolene C Lindenenol C Linderane Lindra strychinifolia L strychinifolia L strychinifolia - Steroidal alkaloids Solasonine C S xanthocarpu Tomatin C L esculentumm C Paul’s Scarlet Rose C Tylophora indica Beta-sitosterol C Nicotiana tabacum Campesterol C Withania sommifera C D metel C Helianthus annuus C Paul’s Scarlet Rose C Trigonella indica C T foenum-graceum C, SC H annuus C, SC S indicum Cycloartinol C, SC N tabacum Isofucosterol C, SC H annuus Lanosterol C S nigrum Obtusifoliol C, SC N tabacum Stigma sterol C Dioscorea tokora - Sterols Triterpenes Beta-amyrin Cholesterol - Tannins Catechin Epicatechin C Camellia sinensis SC Paul’s Scarlet Rose C C sinensis Chữ viết tắt C: callus, SC: nuôi cấy dịch huyền phù (suspension culture) 7.6.3 Sản xuất bằng nuôi cấy tế bào ở những nước công nghiệp Kỹ thuật tiến nuôi cấy tế bào được triển khai ngày rõ ràng các nước công nghiệp tiên tiến Sản phẩm công nghiệp đầu tiên từ nuôi cấy tế bào shikonin được tập đồn cơng nghiệp hóa dầu Mitsui (Nhật) sản xuất Shikonin vị thuốc dân tộc Nhật Bản dùng làm thuốc chống viêm Năm 1983, Mitsui thông báo quá trình phát triển kỹ nghệ sản xuất công nghiệp chất shikonin nuôi cấy tế bào thùng lên men loại nhỏ 750 lít Thành cơng bước đầu chọn được dịng tế bào tích lũy shikonin gấp mười lần nhiều so với nguồn nguyên liệu tự nhiên Lithospermum erythrozhizon (koshikon) xây dựng phương pháp hai giai đoạn để sản xuất shikonin từ ni cấy tế bào Tuy nhiên, có năm vấn đề quan trọng hạn chế kỹ thuật nuôi cấy tế bào cho mục tiêu thương phẩm đối với số chất có giá trị cao: - Chọn được dịng thực có suất cao - Điều khiển được tế bào tạo chất quan tâm Gen mã hóa các sản phẩm hóa học thường hoạt động điều kiện đặc biệt - Nhiễm khuẩn nhiễm nấm tế bào thực vật sinh trương chậm, xử lý kháng sinh gây hậu cho sinh trương tạo hoạt chất - Sản phẩm không tập trung tế bào thực vật khơng tởng hợp chuyên sản phẩm thứ cấp mà thường kèm số chất khác - Nuôi cấy tế bào thay đởi biến động tương tác các gen khác dịng suất lấn át tồn ni cấy Mặc dù vậy, đột phá kỹ thuật ni cấy tế bào (ví dụ nuôi cấy rễ tơ) cho thấy tương lai gần hóa chất cơng nghiệp có ng̀n gớc thực vật cho dù dược liệu, th́c nhuộm hay chất màu thực vật sản xuất các nồi phản ứng sinh học 7.6.4 Nuôi cấy rễ tơ (hair roots) sinh tổng hợp Những vấn đề tồn nuôi cấy tế bào công nghiệp được giải thơng qua kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ, sơ khoa học giải pháp việc nhiễm callus với giống vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes khiến cho tế bào callus đồng phân hóa thành rễ Vi khuẩn chuyển DNA vào gen tế bào thực vật khiến cho gen tạo chất điều khiển sinh trương rễ hoạt động Hệ thống rễ đa bội bào nơi lý tương để sản sinh hóa chất thực vật chúng ổn định di truyền, sinh trương nhanh (từ đầu rễ nuôi cấy rễ lơng tăng trọng lượng từ 2500 - 5000 lần tuần) mang lại cho nuôi cấy tế bào khá nhiều ưu điểm đáng kể khả tránh nhiễm khuẩn Các công ty Nhật Bản đã sử dụng kỹ thuật để mơ rộng nuôi cấy rễ nhân sâm, loại nuôi cấy tỏ dễ điều khiển Công ty Escagenetics (California, Mỹ) đã thông báo thành công việc sản xuất taxol nuôi cấy rễ lông Taxol chất tách chiết từ vỏ lá kim thủy tùng ( Taxus brerifolia) được dùng thử có kết điều trị nhiều loại ung thư Việc cung cấp taxol gặp khó khăn thân thủy tùng khan hàm lượng taxol chúng thấp Escagenetics đã sản xuất taxol với nờng độ cao nồng độ tự nhiên thấy vỏ lá thủy tùng Hiện nay, hãng Phyton Catalytic (New York, Mỹ) đã mua quyền sản xuất toxol chất đồng đẳng taxol qui mô pilot Giá bán taxol hiện được xác định 200.000 - 300.000 USD/kg Theo Escagenetics việc sản xuất vanillin nuôi cấy tế bào cơng nghiệp đã bệ phóng tớt để họ tới nuôi cấy tế bào taxol Thông qua mối quan tâm sản xuất taxol hiểu biết quá trình sinh tởng hợp dược chất được mơ rộng Tới có 10 sớ các dược chất có ng̀n gớc thực vật được sử dụng rộng rãi (khoảng 300.000 lồi) được tởng hợp nhân tạo phịng thí nghiệm, sớ cịn lại được chiết trực tiếp từ cỏ Thế Văn phòng thương mại quyền Mỹ đã cấp quyền tác giả cho ĐH Q́c gia Florida qui trình công nghệ bán tổng hợp thuốc chống ung thư Công nghệ kết hợp chất gọi baccatin III chuỗi tổng hợp để thu được chất có cấu trúc giớng chất taxol tự nhiên Baccatin III được tách chiết từ thủy tùng nước Anh, họ hàng với thủy tùng Địa Trung Hải Công ty dược Bristol-Myers Squibb, nơi cung cấp taxol tự nhiên vừa ký hợp đồng quyền với ĐH Quốc gia Florida để đưa công nghệ sản xuất taxol vào sản xuất Srinivasan cs (1997) đã nuôi cấy dịch huyền phù tế bào loài thuỷ tùng Taxus chinensis T baccata hệ thớng ni cấy mơ hình (model system) nhằm chứng minh khả tương tự tích lũy sinh khối (biomass) sản xuất các chất trao đổi thứ cấp (taxane) thu từ nuôi cấy các đĩa polystyrene ngăn (six-well polystyrene plates) các bình thủy tinh (loại 25 ml 125 ml, lắc 120 vịng/phút) Merkli cs (1997) đã ni cấy rễ tơ Trigonella foenum-graecum với gây nhiễm chủng A4 Agrobacterium rhizogenes Các rễ tơ đã sản xuất diosgenin, spirostanol quan trọng cho bán tổng hợp (semi-synthesis) các hormone steroid Hàm lượng diosgenin thu được cao 0,040% trọng lượng khô (trên môi trường ni thích hợp nhất-McCown’s woody plant medium có 1% sucrose) gần gấp lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 tháng tuổi (0,024%) Các tác giả đã nghiên cứu ảnh hương cholesterol, pH môi trường chitosan đến khả sản xuất diosgenin Bổ sung 40 mg/l chitosan vào môi trường nuôi cấy nâng hàm lượng diosgenin lên gấp lần so với đới chứng Sevón cs (1997) đã tái sinh từ protoplast rễ Hyoscyamus muticus được gây nhiễm Agrobacterium rhizogenes sau phân tích hóa học 34 riêng rẽ đã trương thành Kết nghiên cứu cho thấy các có sản xuất hyoscyamine, scopolamine, nhiều loại calystegin, điều đáng kể đã tìm thấy các biến dị dịng soma các Tuy nhiên, có mặt các gen rol (A, B C) A rhizogenes gây bất lợi cho việc tích lũy các alkaloid các chuyển gen ngược lại với ưu điểm nuôi cấy rễ tơ Sikuli cs (1997), đã nghiên cứu ảnh hương tuổi mô nuôi cấy đến tích lũy sinh khới sản lượng alkaloid rễ tơ thu được sau gây nhiễm Datura stramonium với chủng Agrobacterium ATCC 15834 Hàm lượng hyoscimine rễ đạt cực đại sau tuần nuôi cấy khoảng 100mg/l Bên cạnh đó, các tác giả cịn nghiên cứu ảnh hương cân ion ( NO , SO 24- , H PO -4 , K+, Ca2+ Mg2+) đến sản lượng sinh khối tích lũy hyoscyamine Nờng độ NO 3- K+ cao cho sinh khới cao nhất, cịn sản lượng hyoscyanine cao SO 24- K+ cao 7.7 Ứng dụng biến dị dòng soma dòng giao tư công tác giống trồng Các đột biến đơn gen hệ gen nhân quan tử tạo thứ in vitro (in vitro variety) thích hợp có các đặc tính đặc trưng được cải thiện Trong khuôn khổ tạo giống trồng, biến dị dịng soma được sử dụng để khám phá các thể biến dị trì tất các đặc tính tớt có bở sung tính trạng hữu ích, kháng các bệnh chất diệt cỏ Các biến dị sau được thử nghiệm đồng ruộng để xác định chắc chắn ổn định di truyền chúng Lai thuận nghịch (reciprocal cross) hệ F mang tính trạng mong ḿn với đới chứng có ng̀n gớc từ hạt ổn định xa (further stabilise) các thể biến dị giúp đỡ tạo hạt các dòng hứa hẹn Biến dị dòng giao tử, được cảm ứng hầu hết bơi tái tổ hợp giảm phân chu trình hữu tính thể lai F 1, tạo phân ly vượt quá giới hạn để khám phá các tở hợp gen Các dịng tế bào khác chọn lọc điều kiện in vitro chứng minh lực ứng dụng cho nơng nghiệp công nghiệp Các tái sinh biểu hiện các tính trạng kháng chất diệt cỏ, pathotoxin, ḿi phèn Hơn nữa, khả biến dị nuôi cấy tế bào đã thể hiện vai trị hữu ích việc tổng hợp các chất thứ cấp liên quan đếm phạm vi thương mại Hinh 7.2 Biểu đồ khai thác hiệu quả tác động giữa nhân tế bào chất Các kỹ thuật ứng dụng cho việc cảm ứng biến dị dòng soma dòng giao tử dễ dàng công nghệ DNA tái tổ hợp Đặc biệt, cải thiện trờng mang các tính trạng đa gen (polygenic traits) các phương pháp tạo giống trồng truyền thống không truyền thống đã được chứng minh khó khăn Biến dị dịng soma kỹ thuật thích hợp cho cơng nghệ di truyền các trồng 7.8.Thực hành nuôi cấy dịch huyền phù Nguyên liệu thực vật - Hạt lúa (Oryza satica): nuôi cấy tạo callus - Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria) in vitro: nuôi cấy tạo callus Môi trường nuôi cấy tạo callus a Lúa - MS đầy đủ - Saccharose % - Agar 0,8 % - 2,4-D mg/L - KIN 0,1 mg/L - pHmôi trường ~ 5,8 Môi trường nuôi cấy tế bào dịch lỏng Thành phần môi trường tương tự môi trường tạo callus không bổ sung agar Tiến hành * LÚA: chuẩn bị môi trường theo các bước tương tự các trước - Tạo callus Hình 7.3 Ni cấy tạo mơ sẹo lúa  Hạt lúa bóc vỏ, rửa xà phòng dòng nước chảy Cho hạt lúa vào bình khử trùng, khử trùng sơ cờn 70% phút Sau khử trùng HgCl 0,1 % phút Rửa lại nước cất vô trùng 4-5 lần trước cấy  Cấy hạt lúa đã khử trùng vào môi trường đã chuẩn bị nuôi nhiệt độ 25 ± oC, thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux  Sau 4-5 tuần các callus màu trắng sữa xuất hiện các hạt lúa - Nhân callus Dùng dao mổ tách lấy các khối callus nhỏ có đường kính 1-2 mm cấy chuyển lên mơi trường nhân callus (thành phần môi trường tương tự môi trường tạo callus) Sau 3-4 tuần, các callus phát triển nhanh chóng thành các khới callus lớn (đường kính khoảng 3-5 mm) - Ni cấy tế bào dịch huyền phù  Chuẩn bị môi trường nuôi cấy dịch huyền phù Các bước tiến hành khử trùng tương tự mơi trường có agar Mỗi bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi trường  Chọn các khới callus có màu trắng ngà, rắn từ mơi trường nhân để chuyển vào môi trường lỏng Một gam callus cho vào bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi trường ( các thao tác tiến hành điều kiện vơ trùng) Đặt các bình mơi trường chứa callus máy lắc phịng ni cấy (nhiệt độ 25 ± 2oC) với tốc độ khoảng 100-150 vịng/phút Cứ ngày lấy bình ni cấy, lọc sinh khối tế bào máy hút chân không, cân lượng mẫu tươi thu được Sau đó, đem sấy mẫu 65 oC để cân trọng lượng khô So sánh với kết ban đầu để theo dõi tốc độ sinh trương callus