NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS) NUÔI CẤY IN VITRO. LUẬN ÁN TIẾN SĨ

ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHAN THỊ Á KIM NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS) NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HUẾ - NĂM 2022 ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHAN THỊ Á KIM NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS) NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 942.02.01 HUẾ - NĂM 2022 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập hoàn thành luận án, em nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ Phòng đào tạo sau đại học, Thầy Cô giáo Khoa Sinh, Bộ môn Công nghệ sinh học - Trƣờng đại học Khoa học Huế, Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Quảng Nam Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý giá Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Lê Văn Tƣờng Huân, PGS TS Võ Thị Mai Hƣơng tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em suốt thời gian học tập; xin cảm ơn anh chị cơng tác Phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, Đại học Khoa học Huế; Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế nhiệt tình giúp đỡ em thực đề tài Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành lời cảm ơn sâu sắc đến GS TS Nguyễn Hoàng Lộc – Ngƣời Thầy giáo mẫu mực, tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực luận án Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ngƣời thân gia đình, bạn bè, đồng nghiệp động viên giúp đỡ em suốt thời gian học tập hoàn thành luận án Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn! Thừa Thiên Huế, tháng năm 2022 Phan Thị Á Kim LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực, khách quan nghiêm túc, tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ ràng Nếu có sai sót, tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Tác giả luận án MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC i BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU 1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Thành phần hóa học đinh lăng nhỏ 1.1.3 Giá trị dƣợc lý đinh lăng nhỏ 1.2 ELICITOR 10 1.2.1 Khái niệm 10 1.2.2 Phân loại 10 1.2.3 Cơ chế tác dụng elicitor 12 1.2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình k ch kháng 14 1.2.5 Nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất hợp chất thứ cấp 17 1.2.6 Một số thành tựu sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật đƣợc xử lý elicitor 19 1.3 TỔNG QUAN VỀ OLEANOLIC ACID 25 i 1.3.1 Vai trò phân bố 25 1.3.2 Một số công dụng oleanolic acid 25 1.3.3 Cấu trúc hóa học tính chất vật lý 28 1.3.4 Sinh tổng hợp oleanolic acid 29 1.3.5 Các nghiên cứu sản xuất oleanolic acid nuôi cấy mô tế bào thực vật 31 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NI CẤY IN VITRO VÀ SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP Ở CÂY ĐINH LĂNG 36 1.4.1 Nhân giống in vitro đinh lăng nhỏ 36 1.4.2 Sản xuất hợp chất thứ cấp từ đinh lăng nhỏ 39 1.4.3 Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy tế bào đinh lăng nhỏ 40 1.4.4 Xây dựng quy trình thu nhận hợp chất thứ cấp từ đinh lăng nhỏ 41 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 43 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 43 2.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu 43 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.2.1 Hóa chất môi trƣờng nuôi cấy 45 2.2.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy lên khả sinh trƣởng callus 46 2.2.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy lên khả sinh trƣởng tế bào 47 2.2.4 Xử lý elicitor 48 2.2.5 Định lƣợng oleanolic acid 49 2.2.6 Xử lý thống kê 50 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 52 3.1 ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƢỞNG CỦA CALLUS 52 ii 3.1.1 Ảnh hƣởng 2,4-D kết hợp với KIN lên sinh trƣởng callus 52 3.1.2 Ảnh hƣởng nguồn nitơ lên sinh trƣởng callus thân 57 3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO 60 3.2.1 Nuôi cấy tế bào 60 3.2.2 Ảnh hƣởng nguồn carbon 62 3.2.3 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng 63 3.3 ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID TRONG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ 66 3.3.1 Ảnh hƣởng dịch chiết nấm men 66 3.3.2 Ảnh hƣởng methyl jasmonate 71 Chƣơng BÀN LUẬN 76 4.1 ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY LÊN SINH TRƢỞNG CỦA CALLUS 76 4.1.1 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng 76 4.1.2 Ảnh hƣởng nguồn nitơ 77 4.2 ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƢỞNG CỦA TẾ BÀO VÀ HÀM LƢỢNG OLEANOLIC ACID 78 4.2.1 Nuôi cấy tế bào huyền phù 78 4.2.2 Ảnh hƣởng nguồn carbon 79 4.2.3 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng 80 4.2.4 T ch lũy oleanolic acid tế bào 81 4.3 ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID TRONG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ 83 4.3.1 Đặc điểm elicitor 83 4.3.2 Ảnh hƣởng số elicitor lên sinh trƣởng tế bào 85 4.3.3 Ảnh hƣởng số elicitor lên t ch lũy oleanolic acid 86 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 iii KẾT LUẬN 92 KIẾN NGHỊ 92 CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC 110 iv BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-dichlorophenoxy acetic acid BAP 6-benzyl aminopurine CAS Casamino acids Cs Cộng ĐC Đối chứng DW Dry weight (khối lƣợng khô) FW Fresh weight (khối lƣợng tƣơi) GI Growth index (Chỉ số sinh trƣởng) GPX Glutathione peroxidase GSH-px Gluthatione peroxidase HCTC Hợp chất thứ cấp HepG2 Human hepatocellular carcinoma (tế bào ung thƣ gan ngƣời) HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) IBA 3-indolebutyric acid IC50 Half maximal inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối đa nữa) JA Jasmonic acid KIN Kinetin KTST Kích th ch sinh trƣởng MDA Malonaldehyde MeJA Methyl jasmonate MIC Minimum inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối thiểu) MS Murashige and Skoog (1962) v MT Môi trƣờng NAA Naphthalene acetic acid OA Oleanolic acid PAA Phenyl acetic acid PGE2 Prostaglandin E2 ROS Reactive oxygen species SA Salicylic acid SOD Superoxide dismutase TB Tế bào TPA 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate TRYP Tryptone UA Ursolic acid YE Yeast extract (dịch chiết nấm men) vi 40 Frankfater C.R., Dowd M.K., Triplett B.A (2009), Effect of elicitors on the production of gossypol and methylated gossypol in cotton hairy roots, Plant Cell Tissue Organism Culture, 98, pp 341-349 41 Georgiev V., Marchev A., Haas C., Weber J., Nikolova M., Pavlov A (2011), Production of oleanolic and ursolic acids by callus cultures of Salvia tomentosa Mill, Biotechnology & Biotechnological Equipment, 25, pp 34-38 42 Haas C., Hengelhaupt K.-C., Kümmritz S., Bley T., Pavlov A., Steingroewer J (2014), Salvia suspension cultures as production systems for oleanolic and ursolic acid, Acta Physiologiae Plantarum, 36(8), pp 21372147 43 Halder M., Sarkar S., Jha S (2019), Elicitation: A biotechnological tool for enhanced production of secondary metabolites in hairy root cultures, Engineering in Life Sciences, 19(12), pp 880-895 44 Hamza M.A (2013), Effect of yeast extract (biotic elicitor) and incubation periods on selection of Lupinus termis explant in vitro, Journal of Applied Sciences Research, 9(7), pp 4186-4192 45 Hidalgo D., Steinmetz V., Brossat M., Tournier‐ Couturier L., Cusido Rosa M., Corchete P., Palazon J (2017), An optimized biotechnological system for the production of centellosides based on elicitation and bioconversion of Centella asiatica cell cultures, Engineering in Life Sciences, 17(4), pp 413-419 46 Ho T.T., Lee J.D., Jeong C.S., Paek K.Y., Park S.Y (2018), Improvement of biosynthesis and accumulation of bioactive compounds by elicitation in adventitious root cultures of Polygonum multiflorum, Applied Microbiology and Biotechnology, 102(1), pp 199-209 47 Ho T.T., Murthy H.N., Park S.Y (2020), Methyl jasmonate induced oxidative stress and accumulation of secondary metabolites in plant cell and organ cultures, International Journal of Molecular Sciences, 21(3), pp 99 48 Horiuchi K., Shiota S., Hatano T., Yoshida T., Kuroda T., Tsuchiya T (2007), Antimicrobial activity of oleanolic acid from Salvia officinalis and related compounds on vancomycin-resistant enterococci (VRE), Biol Pharm Bull, 30(6), pp 1147-1149 49 Huan V.D., Yamamura S., Ohtani K., Kasai R., Yamasaki K., Nham N.T., Chau H.M (1998), Oleanane saponins from Polyscias fruticosa, Phytochemistry, 47(3), pp 451-457 50 Huang P., Xia L., Zhou L., Liu W., Wang P., Qing Z., Zeng J (2021), Influence of different elicitors on BIA production in Macleaya cordata, Scientific Reports, 11(1), pp 1-7 51 Huang W.Y., Cai Y.Z., Zhang Y (2010), Natural phenolic compounds from medicinal herbs and dietary plants: potential use for cancer prevention, Nutr Cancer, 62(1), pp 1-20 52 Ilczuk A., Jagiełło-Kubiec K., Jacygrad E (2013), The effect of carbon source in culture medium on micropropagation of common ninebark (Physocarpus opulifolius (L.) Maxim.) 'Diable D'or', Acta Scientiarum Polonorum - Hortorum Cultus, 12(3), pp 23-33 53 Isah T (2019), Stress and defense responses in plant secondary metabolites production, Biological Research, 52, pp 1-25 54 Janicsák G., Veres K., Zoltán Kakasy A., Máthé I (2006), Study of the oleanolic and ursolic acid contents of some species of the Lamiaceae, Biochemical Systematics and Ecology, 34(5), pp 392-396 55 Kim Y.B., Reedb D.W., Covellob P.S (2015), Production of triterpenoid sapogenins in hairy root cultures of Silene vulgaris, Natural Product Communications, 10(11), pp 1919-1922 56 Kochkin D.V., Sukhanova E.S., Nosov A.M (2014), Their accumulation of triterpene glycosides in the growing cycle cell suspension cultures 100 Polyscias fruticosa, Vestnik of Volga State University of Technology Ser: Forest Ecology Nature Management, 4(24), pp 67-73 57 Krzyzanowska J., Czubacka A., Pecio L., Przybys M., Doroszewska T., Stochmal A., Oleszek W (2012), The effects of jasmonic acid and methyl jasmonate on rosmarinic acid production in Mentha piperita cell suspension cultures, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 108(1), pp 73-81 58 Kumar P., Chaturvedi R., Sundar D., Bisaria V.S (2015), Piriformospora indica enhances the production of pentacyclic triterpenoids in Lantana camara L suspension cultures, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 125, pp 23-29 59 Kwan L.S., Tan S.Y., Hirata Y., Chan L.K., Nagaoka Y., Uesato S., Boey P.L (2021), Biotic elicitation at different feeding time in cell suspension cultures of Eurycoma longifolia Jack, a valuable medicinal plant, for enhancement of cytotoxic activity of bioactive compounds against human colon cancer cell line, In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, pp 60 Le K.C., Im W.T., Paek K.Y., Park S.Y (2018), Biotic elicitation of ginsenoside metabolism of mutant adventitious root culture in Panax ginseng, Applied Microbiology and Biotechnology, 102(4), pp 1687-1697 61 Lee J.K., Eom S.H., Hyun T.K (2018), Enhanced biosynthesis of saponins by coronatine in cell suspension culture of Kalopanax septemlobus, Biotech, 8(1), pp 59 62 León J., Rojo E., Sánchez-Serrano J.J (2001), Wound signalling in plants, Journal of Experimental Botany, 52(354), pp 1-9 63 Linh N.T.N., Cuong L.K., Tam H.T., Tung H.T., Luan V.Q., Hien V.T., Loc N.H., Nhut D.T (2019), Improvement of bioactive saponin accumulation in adventitious root cultures of Panax vietnamensis via culture periods and elicitation, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 137(1), pp 101-113 101 64 Liu J (1995), Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid, Journal of Ethnopharmacology, 49(2), pp 57-68 65 Loc N.H., Anh N.H.T., Binh D.H.N., Yang M.S., Kim T.G (2010), Production of glycoalkaloids from callus cultures of Solanum hainanense Hance, Journal of Plant Biotechnology, 37, pp 96-101 66 Loc N.H., Thanh L.T.H (2011), Solasodine production from cell culture of Solanum hainanense Hance, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 16(3), pp 581-586 67 Loc N.H., Anh N.H.T., Khuyen L.T.M., An T.N.T (2014), Effects of yeast extract and methyl jasmonate on the enhancement of solasodine biosynthesis in cell cultures of Solanum hainanense Hance, J Plant Biochem Biotechnol, 3(1), pp 1-6 68 Loc N.H., Giang N.T., Huy N.D (2016), Effect of salicylic acid on expression level of genes related with isoprenoid pathway in centella (Centella asiatica (L.) Urban) cells, Biotech, 6(1), pp 86-93 69 Luczkiewcz M., Cisowski W (2001), Optimisation of the second phase of a two phase growth system for anthocyanin accumulation in callus cultures of Rudbeckia hirta, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 65(1), pp 57-68 70 Luyen N.T., Dang N.H., Binh P.T.X., Hai N.T., Dat N.T (2018), Hypoglycemic property of triterpenoid saponin PFS isolated from Polyscias fruticosa leaves, Annals of the Brazilian Academy of Sciences, 90(3), pp 2881-2886 71 Ma X.H., Zhao Y.C., Yin L., Han D.W., Ji C.X (1982), Studies on the effect of oleanolic acid on experimental liver injury, Yao Xue Xue Bao, 17(2), pp 93-97 72 Manivannan A., Soundararajan P., Park Y.G., Jeong B.R (2016), Chemical elicitor-induced modulation of antioxidant metabolism and enhancement of secondary metabolite accumulation in cell suspension 102 cultures of Scrophularia kakudensis Franch, International Journal of Molecular Sciences, 17(3), pp 399 73 Maqsood M., Abdul M (2017), Yeast extract elicitation increases vinblastine and vincristine yield in protoplast derived tissues and plantlets in Catharanthus roseus, Revista Brasileira de Farmacognosia, 27(5), pp 549556 74 Markowski M., Długosz M., Szakiel A., Durli M., Poinsignon S., Bouguet-Bonnet S., Vernex-Loset L., Krier G., Henry M (2018), Increased synthesis of a new oleanane-type saponin in hairy roots of marigold (Calendula officinalis) after treatment with jasmonic acid, Natural Product Research, 18, pp 1-5 75 Martínez V.M.V., Estrada-Soto S.E., Arellano-García J.d.J., Rivera-Leyva J.C., Castillo-España P., Flores A.F., Cardoso-Taketa A.T., Perea-Arango I (2017), Methyl jasmonate and salicylic acid enhanced the production of ursolic and oleanolic acid in callus cultures of Lepechinia caulescens, Pharmacognosy Magazine, 13(4), pp 886-889 76 Maryadele J.O.N., Patricia E.H., Cherie B.K., Kristin J.R., Catherine M.K., Maryann R.D.A (2006), The Merck Index fourteenth edition, Merck & CO., Inc., USA.s 77 Misra R.C., Maiti P., Chanotiya C.S., Shanker K., Ghosh S (2014), Methyl jasmonate-elicited transcriptional responses and pentacyclic triterpene biosynthesis in sweet basil, Plant Physiology, 164(2), pp 1028-1044 78 Moharrami F., Hosseini B., Farjaminezhad M., Sharafi A (2017), Effects of yeast extract on antioxidant activity and tropane alkaloids production in hairy roots cultures of Hyoscyamus reticulatus L, Scientific Journal Management System, 33(3), pp 466-480 103 79 Moscatiello R., Baldan B., Navazio L (2013), Plant Cell Suspension Cultures In Maathuis FJM, ed Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols Totowa, NJ, Humana Press: 77-93 80 Murashige T., Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant, 15(3), pp 473-497 81 Naik P.M., Al-Khayri J.M (2016), Abiotic and Biotic Elicitors–Role in Secondary Metabolites Production through In vitro Culture of Medicinal Plants In Shanker AK, Shanker C, eds Abiotic and Biotic Stress in Plants Recent Advances and Future Perspectives, IntechOpen: 82 Namdeo A.G (2007), Plant cell elicitation for production of secondary metabolites: A review, Pharmacognosy Reviews, 1(1), pp 69-79 83 Ncube B., Van Staden J (2015), Tilting Plant Metabolism for Improved Metabolite Biosynthesis and Enhanced Human Benefit, Molecules, 20(7), pp 12698-12731 84 Neumann K.H., Kumar A., Imani J (2009), Plant cell and tissue culture-A Tool in biotechnology, Principles and Practice, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg 85 Nhan N.H., Loc N.H (2017), Production of eurycomanone from cell suspension culture of Eurycoma longifolia, Pharmaceutical Biology, 55(1), pp 2234-2239 86 Nhan N.H., Loc N.H (2018), Enhancement of eurycomanone biosynthesis in cell culture of longjack (Eurycoma longifolia) by elicitor treatment, Journal of Plant Biotechnology, 45(4), pp 340-346 87 Niikawa M., Hayashi H., Sato T., Nagase H., Kito H (1993), Isolation of substances from glossy privet (Ligustrum lucidum Ait.) inhibiting the mutagenicity of benzo[a]pyrene in bacteria, Mutat Res, 319(1), pp 1-9 88 Nopo-Olazabal C., Condori J., Nopo-Olazabal L., Medina-Bolivar F (2014), Differential induction of antioxidant stilbenoids in hairy roots of Vitis 104 rotundifolia treated with methyl jasmonate and hydrogen peroxide, Plant Physiology and Biochemistry, 74, pp 50-69 89 Ochoa-Villarreal M., Howat S., Hong S., Jang M.O., Jin Y.W., Lee E.K., Loake G.J (2016), Plant cell culture strategies for the production of natural products, BMB Reports, 49(3), pp 149-158 90 Paek K., Chakrabarty D., Hahn E.J (2005), Application of bioreactor systems for large scale production of horticultural and medicinal plants, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 81, pp 287-300 91 Park T.W., Arasu V.M., Al-Dhabi A.N., Yeo K.S., Jeon J., Park S.J., Lee Y.S., Park U.S (2016), Yeast extract and silver nitrate induce the expression of phenylpropanoid biosynthetic genes and induce the accumulation of rosmarinic acid in Agastache rugosa cell culture, Molecules, 21(4), pp 426 92 Pierik R.L.M., Sprenkels P.A., Van Der Harst B., Van Der Meys Q.G (1988), Seed germination and further development of plantlets of Paphiopedilum ciliolare Pfitz in vitro, Scientia Horticulturae, 34(1), pp 139153 93 Pitta-Alvarez S.I., Spollansky T.C., Guilietti A.M (2000), The influence of different biotic and abiotic elicitors on the production and profile of tropane alkaloids in hairy root cultures of Brugmansia candida, Enzyme and Microbial Technology, 26, pp 252-258 94 Plunkett G.M., Lowry P.P., Vu N.V (2004), Phylogenetic relationships among Polyscias (Araliaceae) and close relatives from the Western Indian ocean sasin, International Journal of Plant Sciences, 165(5), pp 861-873 95 Pollier J., Goossens A (2012), Oleanolic acid, Phytochemistry, 77, pp 1015 96 Pourjabar A., Azimi M., Kahrizi D., Cheghamirza K., Mostafaie A (2018), Proteome analysis of milk thistle (Silybum marianum L.) cell 105 suspension cultures in response to methyl jasmonate and yeast extract elicitors, Applied Ecology and Environmental Research, 17, pp 97 Radman R., Saez T., Bucke C., Keshavarz T (2003), Elicitation of plants and microbial cell systems, Biotechnol Appl Biochem, 37(Pt 1), pp 91-102 98 Raghavendra S., Ramesh C.K., Kumar V., Moinuddin Khan M.H (2011), Elicitors and precursor induced effect on L-Dopa production in suspension cultures of Mucuna pruriens L, Frontiers in Life Science, 5(3-4), pp 127-133 99 Rahimi S., Devi B.S.R., Khorolragchaa A., Kim Y.J., Kim J.H., Jung S.K., Yang D.C (2014), Effect of salicylic acid and yeast extract on the accumulation of jasmonic acid and sesquiterpenoids in Panax ginseng adventitious roots, Russian Journal of Plant Physiology, 61(6), pp 811-817 100 Rhee H.S., Cho H.-Y., Son S.Y., Yoon H.S.-Y., J.M J.M.P (2010), Enhanced accumulation of decursin and decursinol angelate in root cultures and intact roots of Angelica gigas Nakai following elicitation, Plant Cell Tissue Organ Culture, 101, pp 295-302 101 Sakr S.S., Melad S.S., El-Shamy M.A., Elhafez A.E.A (2014), In vitro propagation of Polyscias fruticosa plant, International Journal of Plant & Soil Science, 3(10), pp 1254-1265 102 Salehi M., Moieni A., Safaie N., Farhadi S (2019), Elicitors derived from endophytic fungi Chaetomium globosum and Paraconiothyrium brasiliense enhance paclitaxel production in Corylus avellana cell suspension culture, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 136(1), pp 161-171 103 Sharma M., Sharma A., Ashwani K., Kumar B.S (2011), Enhancement of secandary metabolites in cultured plant cells thoungh stress stimulus, American Journal of Plant Physiology, 6(2), pp 50-71 104 Sheper T (2001), Advances in biochemical engineering biotechnologyplant cell, Springer-Verlag, Berlin Heideberg 106 105 Singh G.B., Singh S., Bani S., Gupta B.D., Banerjee S.K (1992), Antiinflammatory activity of oleanolic acid in rats and mice, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 44(5), pp 456-458 106 Sliwińska A., Syklowska K., Kosmider A., Granica S., Miszczak K., Nowicka G., Kasztelan A., Podsadni P., Turlo J (2018), Stimulation of phenolic compounds production in the in vitro cultivated Polyscias filicifolia Bailey shoots and evaluation of the antioxidant and cytotoxic potential of plant extracts, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 87, pp 107 Sukhanova E.S., Chernyak N.D.N., A M (2010), Obtaining and description of Polyscias filicifolia and Polyscias fruticosa calli and suspension cell cultures., Biotekhnologiya, 4, pp 44-50 108 Sultana N., Ata A (2008), Oleanolic acid and related derivatives as medicinally important compounds, Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 23(6), pp 739-756 109 Suzuki H., Fukushima E.O., Umemoto N., Ohyama K., Seki H., Muranaka T (2018), Comparative analysis of CYP716A subfamily enzymes for the heterologous production of C-28 oxidized triterpenoids in transgenic yeast, Plant biotechnology (Tokyo, Japan), 35(2), pp 131-139 110 Takagi K., Park E.H., Kato H (1980), Anti-inflammatory activities of hederagenin and crude saponin isolated from Sapindus mukorossi Gaertn, Chem Pharm Bull, 28(4), pp 1183-1188 111 Thach B.D., Le N.T.L., Diep T.C., Trinh T.B., Tran T.L.G., Nguyen P.A.U., Ngo K.S (2016), Protocol establishment for multiplication and renegeration of Polycias fruticosa (L.) Harms An inportant medicinal plant in Viet Nam, European Journal of Biotechnology and Genetic Engineering, 3(1), pp 31-37 112 Thai T.V., Hanh T.T.H., Dang N.H., Hien D.T.T., Vinh H.L.N., Dat N.T (2016), Validated High Performance Liquid Chromatography method for 107 quantification of a major saponin in Polyscias fruticosa, Journal of Multidisciplinary Engineering Science and Technology, 3(5), pp 4880-4882 113 Thanh N.T., Murthy H.N., Yu K.W., Hahn E.J., Paek K.Y (2005), Methyl jasmonate elicitation enhanced synthesis of ginsenoside by cell suspension culture of Panax ginseng in 5L balloon type bubble bioreactor, Apply Microbiology Biotechnology, 67, pp 197-201 114 Titova M.V., Popova E.V., Shumilo N.A., Kulichenko I.E., Chernyak N.D., Ivanov I.M., Klushin A.G., Nosov A.M (2021), Stability of cryopreserved Polyscias filicifolia suspension cell culture during cultivation in laboratory and industrial bioreactors, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 145(3), pp 591-600 115 Tung N.T., Thi P.T.D., Sang D.N., Thao D.T., Quang H.T (2022), Biomass accumulation of Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino in cell suspension cultures inhibiting human cancer cell growth, Research Journal of Biotechnology, 17, pp 61-68 116 VanEtten H.D., Mansfield J.W., Bailey J.A., Farmer E.E (1994), Two Classes of Plant Antibiotics: Phytoalexins versus "Phytoanticipins", Plant Cell, 6(9), pp 1191-1192 117 Veerashree V., Anuradha C.M., Vadlapudi K (2012), Elicitor-enhanced production of gymnemic acid in cell suspension cultures of Gymnema sylvestre R Br., Plant Cell Tiss Organ Cult, 108, pp 27-35 118 Vijaya S.N., Udayasri P.V.V., Aswani K.Y., Ravi B.B., Phani K.Y., Vijay V.M (2010), Advancements in the production of secondary metabolites, Natural Products, 3, pp 112-123 119 Warhade M., Badere R (2018), Fusarium oxysporum cell elicitor enhances betalain content in the cell suspension culture of Celosia cristata, Physiol Mol Biol Plants, 24(2), pp 285-293 108 120 Wiktorowska E., Długosz M., Janiszowska W (2010), Significant enhancement of oleanolic acid accumulation by biotic elicitors in cell suspension cultures of Calendula officinalis L, Enzyme and Microbial Technology, 46(1), pp 14-20 121 Woldemichael G.M., Franzblau S.G., Zhang F., Wang Y., Timmermann B.N (2003), Inhibitory effect of sterols from Ruprechtia triflora and diterpenes from Calceolaria pinnifolia on the growth of Mycobacterium tuberculosis, Planta Med, 69(7), pp 628-631 122 Xu K., Chu F., Li G., Xu X., Wang P., Song J., Zhou S., Lei H (2014), Oleanolic acid synthetic oligoglycosides: a review on recent progress in biological activities, Pharmazie, 69, pp 483-495 123 Yamamoto H., Ichimura M., Inoue K (1995), Stimulation of prenylated flavanone production by mannans and acidic polysaccharides in callus culture of Sophora flavescens, Phytochem, 40, pp 77-81 124 Yaseen M., Ahmad T., Sablok G., Standardi A., Hafiz I.A (2013), Review: role of carbon sources for in vitro plant growth and development, Molecular Biology Reports, 40(4), pp 2837-2849 125 Yin Z., Shangguan X., Chen J., Zhao Q., Li D (2013), Growth and triterpenic acid accumulation of Cyclocarya paliurus cell suspension cultures, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 18(3), pp 606-614 126 Zhang C.H., Mei X.G., Liu L., Yu L.J (2000), Enhanced paclitaxel production induced by the combination of elicitors in cell suspension cultures of Taxus chinensis, Biotechnology Letters, 22, pp 1561-1564 127 Zhao Z.J., Song Y.G., Liu Y.L., Qiao M., Zhai X.L., Xiang F.N (2013), The effect of elicitors on oleanolic acid accumulation and expression of triterpenoid synthesis genes in Gentiana straminea, Biologia Plantarum, 57(1), pp 139-143 109 PHỤ LỤC 110 Đƣờng chuẩn oleanolic acid Hình Đƣờng chuẩn oleanolic acid Trong đó: y: Diện tích đỉnh (peak) (mAU*s) x: Nồng độ oleanolic acid mẫu (µg/mL) 111 Kiểm tra độ tinh oleanolic acid chuẩn 112 Môi trƣờng MS (Murashige Skoog, 1962) HÀM LƢỢNG (mg/L) THÀNH PHẦN Đa lƣợng: KHNO3 1900 KH2PO4 170 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O 440 FeSO4.7H2O 27,8 Na2.EDTA 37,3 Vi lƣợng: H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 ZnSO4.4H2O 8,6 Na2MoO4.2H2O 0,25 KI 0,83 3.Vitamin: Myo - Inositol 100 Thiamine - HCl 0,1 Pyridoxine - HCl 0,5 Acid nicotinic 0,5 4.Acid amine: Glycine 113