KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA GIỐNG LAN DENDROBIUM MINI LAI TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO. LUẬN VĂN THẠC SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Thu Ly KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA GIỐNG LAN DENDROBIUM MINI LAI TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS BÙI VĂN LỆ Thành phố Hồ Chí Minh – 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm TP HCM, Phòng Đào tạo Sau đại học, Khoa Sinh học, tất thầy tận tình dạy dỗ, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian theo học trường - Thầy PGS TS Bùi Văn Lệ tận tình hướng dẫn, giảng dạy, bồi dưỡng kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu tạo điều kiện tốt để em hoàn thành luận văn - ThS Hoàng Minh Tâm, ThS Đặng Thị Ngọc Thanh – thầy cô quan tâm, tận tình bảo cho em ý tưởng đề tài - Thạc sĩ Nguyễn Văn Vinh, Trạm huấn luyện thực nghiệm nông nghiệp Văn Thánh thuộc Trung tâm khuyến nơng thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài - ThS Lê Minh Đức giúp đỡ hỗ trợ cho em công tác phịng thí nghiệm để em thực đề tài - Quý Thầy Cô ngành Sinh học khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên trường Đại học Sài Gòn tạo điều kiện thuận lợi để em học tập hoàn thành luận văn - Các bạn sinh viên ngành Sư phạm Sinh học trường Đại học Sài Gòn nhiệt tình giúp đỡ trình thực đề tài - Cảm ơn tất người thân, người bạn bên cạnh động viên tơi suốt q trình học tập - Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn ba mẹ, hai chị chồng yêu thương, động viên tạo điều kiện tốt cho hồn thành qúa trình học tập Một lần xin chân thành cảm ơn TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 Phạm Thị Thu Ly MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược đặc điểm lan Dendrobium lan Dendrobium mini 1.1.1 Đặc điểm hình thái 1.1.2 Điều kiện sinh thái 1.1.2.1 Nhiệt độ 1.1.2.2 Độ ẩm chế độ tưới nước 1.1.2.3 Ánh sáng .8 1.1.2.4 Nhu cầu dinh dưỡng .8 1.1.3 Các phương pháp nhân giống lan Dendrobium Dendrobium mini tự nhiên 1.2 1.1.3.1 Giao phấn 1.1.3.2 Phương pháp tách chiết Sơ lược phương pháp nhân giống in vitro 1.2.1 Lược sử phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật 1.2.2 Tầm quan trọng phương pháp nhân giống in vitro .10 1.2.3 Điều kiện nhân giống in vitro 11 1.2.4 Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật 11 1.2.4.1 Giai đoạn 1: Chọn lựa khử trùng mẫu 11 1.2.4.2 Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống 11 1.2.4.3 Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro 11 1.2.4.4 Giai đoạn 4: Tái sinh in vitro hoàn chỉnh 12 1.2.4.5 Giai đoạn 5: Chuyển vườm ươm 12 1.2.5 Những ưu điểm khó khăn nhân giống in vitro 12 1.2.5.1 Ưu điểm 12 1.2.5.2 Khó khăn 13 1.2.6 Sơ lược kỹ thuật dùng nuôi cấy mô thực vật .14 1.2.6.1 Nuôi cấy phôi .14 1.2.6.2 Nuôi cấy mô quan tách rời 14 1.2.6.3 Nuôi cấy mô phân sinh .15 1.2.6.4 Nuôi cấy bao phấn 15 1.2.6.5 Nuôi cấy tế bào đơn 15 1.2.6.6 Nuôi cấy protoplast 16 1.2.7 Các phương pháp nhân giống in vitro cho lan Denrdobium .17 1.2.7.1 Nhân giống chồi nách 17 1.2.7.2 Nhân giống chồi đỉnh 17 1.2.7.3 Nhân giống chồi bất định 17 1.2.7.4 Nhân giống qua nuôi cấy callus 17 1.2.7.5 Nhân giống đoạn giả hành 17 1.2.7.6 Nuôi cấy hạt lai 18 1.2.7.7 Dung hợp tế bào trần 18 1.3 Sơ lược phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) .18 1.4 Sơ lược phương pháp nuôi cấy tế bào môi trường lỏng lắc (nuôi cấy dịch treo tế bào) 19 1.5 Giới thiệu phôi soma protocorm like bodies (PLBs) 20 1.5.1 Giới thiệu phôi soma 20 1.5.2 Giới thiệu PLBs 21 1.6 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật 22 1.7 Một số chất hữu dùng nuôi cấy in vitro .23 1.8 Một số cơng trình nghiên cứu lan Dendrobium in vitro .24 1.8.1 Trong nước 24 1.8.2 Trên giới 24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vật liệu .26 2.1.1 Vật liệu nuôi cấy .26 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 26 2.1.3 Hóa chất 26 2.2 Môi trường điều kiện nuôi cấy 26 2.3 Nội dung nghiên cứu 27 2.4 Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu 27 Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu .27 2.4.2 Nội dung 2: Khảo sát loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .29 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 29 2.4.3 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 30 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng NAA BA đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 30 2.4.4 Nội dung 4: Khảo sát điều kiện nuôi cấy đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 31 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 31 2.4.5 Nội dung 5: Khảo sát ảnh hưởng hợp chất hữu cơ: vitamin, đường, nước dừa, khoai tây, bánh dầu đến khả nhân nhanh chồi sinh trưởng giống lan Dendrobium mini lai 32 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ vitamin lên tăng sinh chồi môi trường lỏng lắc 32 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng bánh dầu đến khả sinh trưởng chồi giống lan Dendrobium mini lai 33 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu đến khả sinh trưởng chồi giống lan Dendrobium mini lai .35 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu đến sinh trưởng giống lan Dendrobium mini lai giai đoạn tạo hoàn chỉnh 36 2.4.6 Xử lý, phân tích số liệu, kiện .37 2.5 Thời gian nghiên cứu 2.6 Nơi thực đề tài CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .38 3.1 Kết 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu 38 Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu .38 3.2 Kết 2: Khảo sát loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 40 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần khống loại môi trường nuôi cấy đến cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 40 3.3 Kết 3: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .42 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng NAA BA đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 42 3.4 Kết 4: Khảo sát điều kiện nuôi cấy đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 47 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 47 3.5 Kết 5: Khảo sát ảnh hưởng hợp chất hữu cơ: vitamin, đường, nước dừa, khoai tây, bánh dầu vitamin đến khả nhân nhanh chồi sinh trưởng giống lan Dendrobium mini lai 50 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ vitamin lên tăng sinh chồi môi trường lỏng lắc 50 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng bánh dầu đến khả sinh trưởng chồi giống lan Dendrobium mini lai 53 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu đến khả sinh trưởng chồi giống lan Dendrobium mini lai .59 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu đến sinh trưởng giống lan Dendrobium mini lai giai đoạn tạo hoàn chỉnh 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .67 Kết luận 67 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA : α-naphthaleneacetic acid BA : 6-benzyl adenin ABA : abcisic acid IAA : indol acetic acid IBA : indolbutyric acid TDZ : thidiazuron MS : Murasgige Skoog WPM : Woody Plant Medium PLBs : Protocorm like bodies tTCL : Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt theo chiều ngang lTCL : Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt theo chiều dọc NT : Nghiệm thức DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nồng độ javen thời gian khử trùng mẫu 27 Bảng 2.2 Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 30 Bảng 2.3 Điều kiện nuôi cấy nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 31 Bảng 2.4 Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật vitamin bổ sung vào môi trường ảnh hưởng đến tăng sinh chồi lan Dendrobium mini lai 33 Bảng 2.5 Nồng độ bánh dầu bổ sung vào môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai 34 Bảng 2.6 Nồng độ cơm dừa bánh dầu bổ sung vào môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai 35 Bảng 2.7 Nồng độ cơm dừa bánh dầu bổ sung vào môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng lan Dendrobium mini lai giai đoạn tạo hoàn chỉnh 36 Bảng 3.1 Kết ảnh hưởng nồng độ javen thời gian lắc mẫu lên trình khử trùng 38 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thành phần khoáng loại môi trường nuôi cấy đến cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 41 Bảng 3.3 Tỉ lệ mẫu sống ảnh hưởng BA NAA 43 Bảng 3.4 Tỉ lệ mẫu tạo PLBs ảnh hưởng BA NAA 43 Bảng 3.5 Tổng số chồi thu ảnh hưởng BA NAA 44 Bảng 3.6 Chiều cao chồi trung bình thu ảnh hưởng BA NAA 44 Bảng 3.7 Tỉ lệ mẫu sống ảnh hưởng BA NAA ni cấy điều kiện khơng có ánh sáng 47 Bảng 3.8 Tỉ lệ mẫu tạo PLBs ảnh hưởng BA NAA ni cấy điều kiện khơng có ánh sáng 48 Bảng 3.9 Tổng số chồi thu ảnh hưởng BA NAA nuôi cấy điều kiện khơng có ánh sáng 48 Bảng 3.10 Chiều cao chồi trung bình thu ảnh hưởng BA NAA nuôi cấy điều kiện ánh sáng 49 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ vitamin lên tăng sinh chồi lan môi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy 51 Bảng 3.12 Tỉ lệ nhân chồi lan ảnh hưởng bánh dầu 54 Bảng 3.13 Chiều cao trung bình ảnh hưởng bánh dầu 55 Bảng 3.14 Số trung bình thu ảnh hưởng bánh dầu 56 Bảng 3.15 Hình thái, màu sắc ảnh hưởng bánh dầu 57 Bảng 3.16 Tổng số chồi thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu 59 Bảng 3.17 Tỉ lệ nhân chồi ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu 60 Bảng 3.18 Chiều cao chồi trung bình thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu 60 Bảng 3.19 Số trung bình thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu 61 Bảng 3.20 Hình thái, màu sắc ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu 61 Bảng 3.21 Chiều cao trung bình thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu giai đoạn tạo hoàn chỉnh 63 Bảng 3.22 Số trung bình thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu giai đoạn tạo hoàn chỉnh 64 Bảng 3.23 Số rễ thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu giai đoạn tạo hoàn chỉnh 64 Bảng 3.24 Hình thái, màu sắc ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu giai đoạn tạo hoàn chỉnh 66 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1 Tổng quan lan Dendrobium Hình 1.2 Cơ quan sinh sản lan thuộc họ Ochidaceae Hình 1.3 Một số kỹ thuật dùng nuôi cấy mô tế bào thực vật 17 Hình 1.4 PLBs hình thành từ phương pháp tTCL 22 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu 29 Hình 3.1 Chồi lan non thu nhận vườn, cắt bớt bao 39 Hình 3.2 Kết khử trùng chồi lan theo nghiệm thức 40 Hình 3.3 Lan Dendrobium mini lai nuôi cấy môi trường MS, Gamborg B5 WPM sau 60 ngày 42 Hình 3.4 PLBs sau 60 ngày nuôi cấy nghiệm thức đến nghiệm thức 46 Hình 3.5 PLBs sau 60 ngày nuôi cấy nghiệm thức đến nghiệm thức điều kiện khơng có ánh sáng 50 Hình 3.6 Sự tăng sinh chồi lan môi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức đến nghiệm thức 52 Hình 3.7 Hình thái chồi lan mơi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức đến nghiệm thức 53 Hình 3.8 Chồi lan Dendrobium mini lai loại môi trường bánh dầu khác sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức đến nghiệm thức 58 Hình 3.9 Chồi lan Dendrobium mini lai loại môi trường bánh dầu khác sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức đến nghiệm thức 12 59 Hình 3.10 Lan Dendrobium mini lai mơi trường MS có bổ sung cơm dừa bánh dầu xử lý nhiệt sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức đến 62 Hình 3.11 Lan Dendrobium mini lai giai đoạn tạo hồn chỉnh mơi trường MS có bổ sung cơm dừa bánh dầu xử lý nhiệt sau 49 ngày nuôi cấy 66 MỞ ĐẦU  Đặt vấn đề Ngày với kinh tế ngày phát triển, nhu cầu vật chất người ngày cải thiện nâng cao Và đặc biệt nhu cầu tinh thần người dân thiếu Một cách mà người chọn để làm đẹp cho sống trồng hoa cảnh Việc lựa chọn loại hoa trồng tùy theo sở thích, vẻ đẹp hoa điều kiện nuôi trồng Trong đó, hoa lan hoa nhiều người ưa thích Hoa lan loài hoa vương giả, với vẻ đẹp kiêu kì huyền bí, có vai trị quan trọng đời sống tinh thần kinh tế Ngoài chúng có hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú đa dạng, phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam nên chúng sản xuất phổ biến Hoa lan nước ta phong phú đa dạng, có nhiều giống khác như: Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Mokara, Vanda, Dendrobium… chúng cho hoa đẹp mang nhiều màu sắc khác Hoa lan dùng để trang trí, trưng bày, làm quà tặng… hay người ta bán hoa, cắt cành kinh doanh Trong số có lẽ Dendrobium giống phong phú từ màu sắc, dạng hoa giống, loài Mặt khác, Dendrobium dễ trồng, siêng hoa lâu tàn Do đó, ưa chuộng trồng phổ biến nước ta nhằm phục vụ cho nhu cầu sống Trong nhóm Dendrobium, giống lan Dendrobium mini ưa chuộng thị trường đặc biệt Nhật Hàn Quốc với nhiều ngun nhân như: dễ trồng, khơng địi hỏi nhiều diện tích trồng lại sản xuất nhiều cây, lợi nhuận mang đến lớn kỳ vọng, hoa quanh năm lâu tàn (hoa kéo dài từ 2-3 tháng), thích hợp trưng bày bàn làm việc cho phịng họp lớn, thích hợp cho đủ loại bình, chậu khác Một số giống lan Dendrobium mini với sắc hoa từ trắng tuyền đến hồng, hồng phớt, hồng nhạt điểm vàng… Tuy nhiên, giống lan Dendrobium mini thị trường Việt Nam chưa phong phú màu sắc, nhiều giống mang khuyết điểm như: thân yếu, phát hoa ngắn, hoa mau tàn, màu sắc hoa nhợt nhạt…, số lượng hoa thị trường không nhiều để phục vụ cho nhu cầu người Nên việc nhân giống lan Dendrobium mini để thỏa mãn hiếu kì khách hàng thu lại lợi ích kinh tế việc làm cần thiết Phương pháp nuôi cấy in vitro phương pháp nhân giống lan qui mô công nghiệp, lan sản xuất hoàn toàn giống từ bố mẹ quí lai tạo xem có giá trị sau lần hoa Do đó, đề tài “Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển giống lan Dendrobium mini lai điều kiện nuôi cấy in vitro” thực  Mục tiêu đề tài - Xác định phương pháp khử trùng mẫu - Xác định môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai tốt - Xác định môi trường nhân chồi lan Dendrobium mini lai tối ưu điều kiện in vitro - Xác định môi trường tạo lan Dendrobium mini lai hoàn chỉnh tốt điều kiện in vitro  Đối tượng nghiên cứu Giống lan Dendrobium mini lai  Nội dung nghiên cứu Khảo sát quy trình khử trùng mẫu Khảo sát môi trường cảm ứng tạo chồi Khảo sát môi trường nhân chồi Dendrobium mini lai điều kiện in vitro Khảo sát môi trường tạo lan Dendrobium mini lai hoàn chỉnh điều kiện in vitro  Thời gian nghiên cứu Từ tháng 01/12/2013 đến 31/01/2014: Viết bảo vệ đề cương Từ tháng 2/2014 đến tháng 8/2014: Thu mẫu, thực nghiệm, lặp lại nghiệm thức Tháng 8/2014: Hoàn thành luận văn  Nơi thực đề tài Phịng thí nghiệm mơn Sinh học, trường Đại học Sài Gòn 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược đặc điểm lan Dendrobium lan Dendrobium mini Vị trí phân loại: Lan Dendrobium thuộc: - Giới: Plantae (Thực vật) - Ngành: Angiospermatophyta (Thực vật Hạt kín) - Lớp: Liliopsida (Monocotyledones) (Một Lá mầm) - Lớp phụ: Liliidae (Bạch huệ) - Bộ: Orchidales (Bộ Lan) - Họ: Orchidaceae (Phong lan) - Giống: Dendrobium sp Hình 1.1 Tổng quan lan Dendrobium [20] Họ Orchidaceae có khoảng 750 chi, 25000 lồi, chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc ngành thực vật Hạt kín họ lớn ngành Một mầm Các loài hệ thống phân bố rộng, hình thái cấu tạo đa dạng phức tạp [10] Giống lan Dendrobium đặt tên vào năm 1799, phong phú chủng loại, với khoảng 1600 loài phân bố vùng thuộc Châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều Đông Nam Á Úc Châu 4 Tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp Dendron nghĩa gỗ bios sống Dendrobium giống phụ sinh, sống gỗ Có người gọi Hồng Lan, có người gọi Đăng Lan Dendrobium có 1.600 lồi chia thành dạng [17]: - Dạng đứng (Dendrobium phalaenopsis) thường mọc xứ nóng, chịu ẩm siêng hoa với giống tiêu biểu như: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên, Sonia - Dạng thịng (Dendrobium nobile) chịu khí hậu mát mẽ với giống tiêu biểu như: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng Với 1600 loài khác địi hỏi nhiều cách chăm sóc khác nhau, nguyên chúng du nhập từ nhiều địa danh khác Nhật Bản, Triều Tiên Newzealand, đặc biệt Guinea nơi sản sinh nhiều lồi Dendrobium [1] Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 lồi, xếp 14 tơng phân biệt thân (giả hành), hoa [14] Dendrobium loài lan sống cành không cộng sinh, phân bố nhiều Châu Âu Nam Thái Bình Dương, tìm thấy nhiều Châu Úc, Tân Guinea, Thái Lan, Việt Nam dãy núi Himalaya Dendrobium trồng phục vụ cho lan chậu lan cắt cành Hiện nay, thị trường Dendrobium ngày đa dạng phong phú loại lan lai có nguồn gốc khác [10] Điều kiện sinh thái Dendrobium đa dạng, có lồi mọc hoa vùng lạnh, có lồi vùng nóng, có lồi trung gian, có lồi thích nghi với điều kiện khí hậu  Lan Dendrobium mini Lan Dendrobium mini loài lai tạo, thân đứng Loài lan chọn lọc từ Thái Lan du nhập vào nước ta Đặc điểm loài lan dạng bụi, lùn (chỉ cao 15 – 20 cm), hoa nhiều, hoa nở quanh năm Cây nhỏ nhảy chồi mạnh, nhảy chồi thân già hay suy yếu Hoa có kích thước khơng lớn khoảng x cm hoa đẹp, số hoa cành nhiều từ - 13 hoa, hoa bền lâu tàn (1,5 – tháng) Thông thường giả hành có tới - phát (cành) hoa, tốt lên đến phát hoa [5] 5 1.1.1 Đặc điểm hình thái Dendrobium thuộc nhóm đa thân, vừa có thân thật vừa có giả hành Giống lan có phận sinh dưỡng rễ, thân, giả hành, quan sinh sản hoa, trái [14] - Dendrobium có hệ rễ khí sinh, có lớp hú tẩm dày bao quanh gồm lớp tế bào chết chứa đầy khơng khí nên rễ ánh lên màu xanh bạc Vì vậy, rễ hút nước mưa chảy dọc vỏ gỗ hay nước lơ lửng khơng khí, sương nước, giúp hút dinh dưỡng chất khoáng, mặt khác giúp bám chặt vào giá thể, khơng bị gió Một số lồi có thân phát triển chí tiêu giảm hồn tồn, có hệ rễ chứa diệp lục tố giúp hấp thụ ánh sáng cần thiết cho hoa quang hợp [14] Rễ lan Dendrobium giống rễ lan Vũ Nữ, Cattleya thuộc loại rễ bán gió, khơng chịu lạnh, bị lạnh thời gian dài rễ bị mục nát bị chết [10] Nhóm thường có rễ nhỏ nhiều rễ, chủ yếu bám vào giá thể, vào thân để hút dưỡng chất dính vào giá thể nước, trồng vào chậu, phải để giá thể nhiều hơn, gần toàn rễ bám vào giá thể, vào thành chậu, có số rễ chìa ngồi Đối với lan, rễ bán gió phải trồng với giá thể nhỏ nhiều hơn, để rễ bám dày đặc hút nhiều dưỡng chất [17] - Thân: Dendrobium thuộc nhóm đa thân (cịn gọi nhóm hợp trục) có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài giá thể nằm sâu đất gọi thân rễ Một số Dendrobium có mầm non, lồi chóng tàn, chóng vàng úa rụng vào mùa thu, thân phình to giống củ khơng có nơi dự trữ lượng [2] - Giả hành: Là đoạn phình to, bên có mơ mềm chứa dịch nhày làm giảm nước dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi điều kiện khơ hạn sống bám cao Ngồi giả hành cịn chứa diệp lục tố nên quang hợp [14] Hình dạng kích thước giả hành đa dạng: hình cầu, thn dài hay hình trụ xếp chồng lên tạo thành thân có mọc xen kẽ Một số lồi xứ lạnh có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên giả hành khơng có màu xanh phía có nang [10] 6 - Lá: Các mọc xen kẽ ôm lấy thân giả có tận thay thn dài xuống thành bẹ ơm thân, hình dạng cấu trúc đa dạng [14] Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng Dạng mềm mại mọng nước, nạc, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống Phiến trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung quạt hay gấp lại theo gân hình chữ V Những sát gốc giảm cịn bẹ khơng phát triển hay giảm hẳn thành vảy [10] Các loài thuộc giống Dendrobium vùng nhiệt đới nói riêng họ Orchidaceae nói chung đơi rụng vào mùa khơ hạn Sau đó, hoa hay sống ẩn để gặp mưa cho chồi [2] - Hoa: Dendrobium thuộc nhóm phụ hoa nách Chồi hoa mọc từ mắt ngủ đọt thân gần Sự biểu trước hoa khác biệt có nhiều lồi rụng hết trước hoa Thời gian hoa đầu mùa mưa hay đầu tết Giống Dendrobium đủ dinh dưỡng cho hoa thành chùm, phát hoa dài thời gian hoa trung bình 1-2 tháng Hoa mọc từ thân thành chùm hay hoa Hoa có màu trắng, vàng đến tím Thường đài sau nằm mình, hai đài bên dài dính lại với mép dính vào đáy trụ tạo thành phần chân trụ phía gọi cằm Mơi gắn vào cằm, đơi kéo dài phía sau tạo thành cựa, móc hay túi Mơi ngun hay có thùy, gai, sọc có lơng khơng Hai cánh hoa bên giống hai đài Trụ thấp, phần đực đỉnh trụ có nắp đậy, nắp gắn vào trụ nhờ ngắn phía sau, bốn khối phấn nhỏ dính lại với cặp [14] - Quả: Họ Orchidaceae có thuộc loại nang, hạt chín, nang bung cịn dính phần đỉnh gốc Ở số lồi, chín khơng nứt nên hạt khỏi quả bị mục nát [10] 7 a) b) Hình 1.2 Cơ quan sinh sản lan thuộc họ Ochidaceae [20] a) Cấu tạo hoa chi tiết b) Quả lan 1.1.2 Điều kiện sinh thái 1.1.2.1 Nhiệt độ Nhiệt độ tác động lan qua đường quang tổng hợp, cường độ quang hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10 % tốc độ quang hợp tăng lên gấp đơi Nhiệt độ cịn ảnh hưởng đến hoa số loài lan lan Bạch Câu Dendrobium crumenatum đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng - 6oC vài giây ngày sau chúng nở hoa đồng loạt Ở 18,5oC, Dendrobium nobile tăng trưởng mà không hoa chúng hoa nhiệt độ hạ xuống 13oC hay thấp [9] Căn vào nhu cầu nhiệt độ, tạm chia Dendrobium thành hai nhóm [11]: - Nhóm ưa lạnh: sinh trưởng phát triển tốt nhiệt độ lý tưởng 150C, gồm giống lấy từ vùng cao nguyên độ cao 1.000m Các loài trồng nhiệt độ cao 25oC, sống hoa - Nhóm ưa nóng: nhiệt độ thích hợp cho lồi nhóm 25oC, gồm đa số giống Dendrobium vùng nhiệt đới, loài giống Dendrobium lai trồng thành phố Hồ Chí Minh tỉnh phía Nam Ngồi ra, cịn có nhóm Dendrobium trung gian sống vùng lạnh vùng nóng, vùng lạnh sinh trưởng hoa nhiều Dendrobium primulinum, Dendrobium farmeri nhiệt độ lý tưởng loài 20oC 8 1.1.2.2 Độ ẩm chế độ tưới nước Các lan sống bám cao, chúng lấy nước từ trận mưa, từ nước khơng khí Chính ẩm độ định diện loài phong lan Trong thời kỳ sinh trưởng cần tưới đủ, vào mùa nóng Giữa lần tưới cần xem xét giá thể trồng có bị đọng nước khơng Khơ gần khô tốt Phải đảm bảo cho giá thể trồng thơng thống làm cho rễ lan có lúc khơ, khơ lúc điều quan trọng Chế độ thở lan có phần nhờ vào rễ Thời kỳ sinh trưởng độ ẩm cần từ 60 đến 70 % Thời kỳ nghỉ cần giảm thích đáng Dendrobium giống giống lan khác phát triển tốt khơng khí ẩm thoáng Ẩm độ tương đối cần thiết 40 – 70% Cấu tạo giá thể ẩm úng rễ bị thối biểu mọc từ phần thân [19] 1.1.2.3 Ánh sáng Dendrobium loài lan ưa sáng (60 – 70 %), thích hợp với ánh sáng mạnh, có loài yêu cầu ánh sáng tới 80 – 90 % Nhờ mà chúng phát triển giả hành thật mạnh mẽ, tất nhiên không để ánh nắng chiếu trực tiếp làm cháy [16] Nếu thừa ánh sáng bị vàng lá, giả hành bị teo lại, xấu thích nghi dần, hoa nhiều đẹp Nếu thiếu ánh sáng, bị thối hóa rõ rệt, èo uột số lượng hoa [20] 1.1.2.4 Nhu cầu dinh dưỡng Dendrobium thân đứng đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần nhiều phân bón dùng nhiều dạng phân bón khác Cịn loại Dendrobium thân thòng hấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng Các loại phân hữu như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phân trâu dùng tốt cách phân bị khơ pha lỗng với nước tưới, vị chặt viên đặt bề mặt giá thể, rễ lan hấp thụ dưỡng chất phóng thích qua q trình tưới nước Các loại phân vơ dùng thường có cơng thức 30 – 10 – 10 dùng lần/tuần với nồng độ muỗng cà phê/4 lít Trong suốt mùa tăng trưởng, ta bón phân 10 – 20 – 30 làm lần/tuần để tạo sức chịu đựng cho trước bước vào mùa nghỉ Trong mùa tăng trưởng có nụ hoa, thay phân 30 – 10 – 10 phân 10 – 20 – 20 với chu kỳ bón hoa tàn Trong mùa nghỉ hồn tồn khơng bón phân cho Dendrobium, hay giảm khơng bón phân cho Dendrobium hồn tất thời kì tăng trưởng năm Thường phân bón dùng dạng hỗn hợp bổ sung thêm chất phụ gia sinh tố nguyên tố vi lượng 1.1.3 Các phương pháp nhân giống lan Dendrobium Dendrobium mini tự nhiên 1.1.3.1 Giao phấn Giao phấn tự nhiên tượng thông thường, gần bắt buộc hầu hết lồi lan Đó ngun nhân họ lan có số lượng chủng loại phong phú Đó phương thức tồn tại, phát triển tiến hoá ưu họ thực vật hướng thụ phấn nhờ côn trùng Việc giao phấn tạo giống mới, qua chọn lọc, có đặc tính hẳn bố mẹ 1.1.3.2 Phương pháp tách chiết Phương pháp dùng để tách chậu lan đầy, đồng thời làm tăng số lượng Các giả hành già đựợc tách hoa tàn tách trồng đựợc từ - năm Giả hành già ươm lại giá thể ẩm để tạo chồi con, chồi nuôi với giả hành lúc tạo rễ mới, đủ sức phát triển tách lần thứ hai Từ giả hành cho đợt - Phương pháp chiết tách đảm bảo tính chất di truyền bố mẹ lại cho hệ sinh trưởng không đồng nên khó cung cấp số lượng lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mô lớn 1.2 Sơ lược phương pháp nhân giống in vitro 1.2.1 Lược sử phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật thuật ngữ mô tả phương thức nuôi cấy phận thực vật ống nghiệm có chứa môi trường điều kiện vô trùng Đối tượng ni cấy bao gồm từ cấu trúc có tổ chức đỉnh sinh trưởng, chồi bất định, phôi đến cấu trúc khơng có tổ chức mơ sẹo, dịch huyền phù tế bào, tế bào trần (protoplast) [18] Năm 1665 Robert Hook quan sát tế bào sống kính hiển vi đưa khái niệm tế bào