Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định khả năng tồn tại, phát triển tăng sinh và khả năng duy trì tính gốc của TBG màng ối sau khi nuôi cấy trên màng ối đông khô. Nghiên cứu này thành công sẽ tạo ra nhiều triển vọng trong việc sử màng ối trong công nghệ mô.
TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TẤM MÀNG ỐI ĐÔNG KHÔ LÀM GIÁ THỂ TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC Nguyễn Viết Trung*; Phạm Văn Trân* TãM T¾T Sử dụng màng ối đông khô để nuôi cấy tế bào gốc (TBG) màng ối với mục tiêu ứng dụng màng ối đông khô làm giá thể sinh học nuôi cấy tế bào (TB), đồng thời bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng giá thể màng ối lên khả tăng sinh biệt hóa TB Tấm màng ối đơng khơ “làm ướt” trở lại dung dịch PBS, sau dàn lên đáy đĩa ni cấy Nhỏ trải TBG màng ối lên bề mặt màng ối Nuôi cấy TBG màng ối môi trường DMEM 10% huyết bào thai bê Thu hoạch TB nuôi cấy dung dịch trypsin 0,25% Đo tăng sinh TB theo phương pháp MTS xác định tính gốc TB dấu ấn OCT-4 Kết quả: TBG màng ối phát triển tốt màng ối đông khô “làm ướt”, đồng thời giữ nguyên biểu OCT-4 Như vậy, sử dụng màng ối đông khô làm giá thể để nuôi cấy TBG màng ối giúp TB tăng sinh trì tính gốc ban đầu * Từ khóa: Tế bào gốc; Màng ối đông khô APPLYING HYPER-DRY AMNION FOR CULTURE OF AMNIOTIC MEMBRANE STEM CELLS SUMMARY Using of “hyper-dry amnion” as biological scaffold for culturing the amniotic stem cells to study theirs effects on proliferation and differentiation of these cells “Hyper-dry amnion” returned fresh amniotic membrane with PBS solution and then set to the bottom of the culture plate Drip and spread of cells on amniotic membrane surface and cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum Cells were harvested from cell culture dish using trypsin 0.25% Measurement of cell proliferation by the MTS method Characterisation of cells by OCT-4 marker So that, Amniotic membrane stem cells proliferate well on hyper-dried amniotic membrane returned to those of fresh amniotic membrane and stem cell always express OCT-4 marker So that “hyper-dry amnion” is used as a scaffold upon which amniotic stem cells can regenerate and maintain theirs characterisations * Key words: Stem cells; Hyper-dry amnion ĐẶT VẤN ĐỀ Điều kiện tiên cho việc lựa chọn giá đỡ tính phù hợp mặt sinh học nó, tức thích hợp với tổ chức sống, không độc, không gây ung thư khơng kích thích sinh miễn dịch thể sống Giá đỡ khơng bị phá hủy q trình viêm nên sử dụng để cấy ghép Ngồi ra, giá đỡ cần có tính chất học phù hợp với mơ, bao gồm tính thấm, tính ổn định, độ đàn hồi, tính linh hoạt dễ dàng lấy bỏ cần [1] * Bệnh viện 103 Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS TS Lê Văn Đông TS Nguyễn Đặng Dũng TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Giá đỡ cần cho phép TB bám dính khả thấm qua dễ dàng chất yếu tố sinh trưởng vật liệu di truyền [2] Màng ối giá đỡ với mơ hình cấu trúc tương tự chất gian bào tổ chức, quan TB biểu mô màng ối tiết thành phần ngoại bào collagen týp III, IV glycoprotein khác laminin, nidogen, fibronectin tạo nên màng màng ối Lớp xốp màng ối proteoglycan ưa nước glycoprotein chứa mạng lưới gồm chủ yếu collagen týp III Perlecan - heparan sulphate proteoglycan, thành phần chủ yếu màng nền, gắn yếu tố sinh trưởng với protein ngoại bào phân tử bám dính Màng ối toàn phần chứa nồng độ cao chất EGF, KGF, HGF bFGF so với màng ối nạo bỏ hết lớp biểu mơ [3] Điều chứng tỏ, TB biểu mô màng ối chế tiết yếu tố sinh trưởng Thêm vào đó, TNF-α, NGF, BDNF, noggin activin phát TBG biểu mơ [4] Vì vậy, TB biểu mơ màng ối sản xuất cytokine có vai trò quan trọng việc tạo mơi trường cho TBG tồn Trên thực tế, Grueterich chứng minh, ni cấy TBG vùng rìa giác mạc màng ối tồn phần, TB khơng thay đổi mặt hình thái, nuôi cấy màng ối loại bỏ hết biểu mơ, TB có kiểu hình giống giác mạc vùng trung tâm [5] Chúng thực đề tài nhằm: Xác định khả tồn tại, phát triển tăng sinh khả trì tính gốc TBG màng ối sau ni cấy màng ối đông khô Nghiên cứu thành công tạo nhiều triển vọng việc sử màng ối công nghệ mô ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Màng ối TBG phân lập từ màng ối sản phụ mổ đẻ, sàng lọc âm tính với HIV, HBV, HCV, giang mai Phƣơng pháp nghiên cứu * Chuẩn bị màng ối đông khô: Rửa màng ối thu dung dịch PBS tạo thành màng mỏng suốt, dàn màng ối vừa cắt giấy nhôm allumium Xử lý màng ối hệ thống đông khô, sau chiếu xạ từ chất phóng xạ Coban 60, liều chiếu 25 kGy Sau kết thúc trình xử lý phóng xạ, màng ối đơng khơ trở nên tuyệt đối vơ khuẩn khơng TB sống * Chuẩn bị TBG màng ối: TBG màng ối bảo quản nhiệt độ -80oC thu hoạch trực tiếp từ đĩa nuôi cấy, ly tâm với dung dịch NaCl 0,9% lần để loại bỏ hết môi trường bảo quản môi trường nuôi cấy Trộn TB dung dịch NaCl 0,9%, tỷ lệ 107 TB/ml * Nuôi cấy TBG màng ối màng ối đông khô: “Làm ướt” màng ối đông khô môi trường DMEM, sau dán lên đáy đĩa ni cấy Nhỏ TBG chuẩn bị môi trường lên đĩa nuôi cấy với mật độ khoảng 2.000 TB/cm2 Thay môi trường ngày/lần, ý cho môi trường vừa đủ để màng ối bám sát đáy đĩa ni cấy Thu hoạch màng ối có cấy TBG dung dịch trypsin 0,25% Làm tiêu nghiên cứu tách chiết ARNtt TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 * Kỹ thuật RT-PCR: Tách ARN toàn phần từ TB b»ng kít Qiagen theo quy trình kỹ thuật nhà cung cấp Xác định nồng độ chất lượng ARN hệ thống Nanodrop Agilent Tổng hợp sợi ADN bổ sung phản ứng chép ngược từ μg ARN tồn phần sử dụng kít Fermentas Thực phản ứng PCR máy luân nhiệt Biorad sử dụng kít Qiagen Cặp mồi đặc hiệu cho gen OCT-4 (Octamer-binding protein 4) mồi xuôi: 5'-GAGGAGTCCCAGGACATGAA-3'; mồi ngược: Reverse: 5'-GTGGTCTGGCTGAACACCTT-3' Sau làm biến tính 15 phút 95°C, thực 40 - 50 chu kỳ PCR (15 giây: 95°C, 25 giây: 58°C 20 giây: 72°C) Điện di sản phẩm PCR (154 pb) gel giải trình tự để kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng PCR * Kỹ thuật hóa miễn dịch DAB: Ni cấy mẫu TBG màng ối màng ối, đúc parafin, khử parafin xylen cồn, sau ức chế peroxydase nội bào H2O2 0,03% Ủ với kháng thể đơn dòng kháng Oct 3/4, sau ủ với kháng thể thứ hai có gắn biotin ủ với phức hợp streptavidine peroxydase Hiển thị màu với chất DAB (3,3-diaminobenzidine) nhuộm với HE tạo tương phản Sau nhuộm hóa mơ miễn dịch, kết âm tính có màu xanh tím HE nhuộm nhân Dương tính có diện kháng ngun TB, phức hợp kháng nguyên - kháng thể - streptavidine màu cho màu vàng nâu (màu DAB) TBG màng ối cấy mật độ thấp (25.000 TB/cm2 200 µl mơi trường) đĩa ni cấy microtest (96 giếng) Nuôi cấy TB 37°C thời gian 1, 3, 7, 10 14 ngày Tính tốn số lượng TB phương pháp MTS (Promega) Nguyên lý phương pháp giảm muối tetrazolium (sản phẩm hấp thụ ánh sáng bước sóng 490 nm) TB sống tỷ lệ với số lượng chúng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Khả tăng sinh TB màng ối 1.4 1.4 PL MO 1.2 1.2 490nm DO Do 490nm protein quy trình thực với màng ối thông thường 1 0.8 0.6 0.8 0.4 0.6 0.2 0.4 0.2 N1 N3 N7 N10 N14 N14 Hình 1: Tốc độ tăng sinh TBG màng ối đĩa plastic (PL) màng ối đông khô (MO) “làm ướt” phục hồi TB ni cấy màng ối có tốc độ tăng sinh chậm so với TB nuôi cấy đĩa plastic Đặc điểm hình thái dấu ấn sinh học TBG nuôi cấy màng ối Sau 24 ni cấy, TB bám dính lên bề mặt màng ối Thay môi trường ngày/lần Tốc độ tăng sinh TB nuôi cấy màng ối chậm nhiều so với TB nuôi cấy trực tiếp đĩa TB có nhiều hình thái khác * Đo tăng sinh TB: TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Hình 2: Hình ảnh TBG ni cấy màng ối đông khô “làm ướt” biểu dấu ấn OCT-4 A: Hình ảnh TB ni cấy màng ối, phần lớn TB có hình đa diện khơng nhất, có vài lớp TB mọc chồng lên B: TB nuôi cấy trực tiếp đĩa ni cấy, phần lớn TB có hình thoi tương tự nguyên bào sợi (độ phóng đại 400X) C: Nhuộm HE trực tiếp đĩa nuôi cấy màng ối (độ phóng đại 40X) D: Nhuộm HE cắt dọc màng ối nuôi cấy TB E: Tiêu màng ối nuôi cấy TBG ngày thứ 14, nhuộm hóa mơ miễn dịch TB DAB với OCT-4 TB dương tính với OCT-4 F: Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR OCT-4 Vị trí 2, mẫu TBG màng ối sau phân lập; 3,4 mẫu TB ni cấy màng ối Khơng có khác biệt biểu OCT-4 hình ảnh điện di sản phẩm PCR TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN Hiện nay, nước có y học phát triển Mỹ, Nhật, Pháp, Đức nghiên cứu tạo TBG người sử dụng giá đỡ khác để che phủ tổn thương lấp đầy tổ chức khuyết hổng Màng ối mơ có nguồn gốc bào thai, cấu tạo màng chính: màng biểu mô đơn, màng dày màng vô mạch Khơng có thần kinh, mạch máu hay bạch huyết màng ối Laminin thành phần màng tham gia vào q trình biệt hóa TB, trì hình dạng hoạt động TB, trì kiểu cấu trúc mô, đồng thời thúc đẩy tồn mô thông qua thụ cảm thể TB integrin dystroglycan Vì vậy, màng ối giá đỡ sinh học lý tưởng in vitro in vivo cho tăng sinh biệt hóa TB [6] Chúng tạo màng ối đông khô sử dụng màng ối giá đỡ TBG màng ối bổ sung giá đỡ Điều quan trọng TBG khơng tồn mà tăng sinh (hình 1) So với đĩa plastic, ni cấy màng ối đông khô làm TB phát triển chậm lại, đồng thời trì tính gốc TB Dấu ấn OCT-4 biểu TB nuôi cấy ngày thứ 14 mức độ ARNtt (xác định RT-PCR) mức độ protein (hóa mơ miễn dịch TB) (hình 2) Những màng ối đơng khơ bổ sung TBG dễ xử lý gặp dạng tổn thương khác kích thước Những vật liệu mở hướng điều trị số mặt bệnh ngoại khoa Như vậy, màng ối nguồn nguyên liệu hấp dẫn lĩnh vực y học tái tạo Trong nghiên cứu trước, tạo màng ối đông khô đạt chất lượng tốt, đồng thời xây dựng quy trình phù hợp với điều kiện có Việt Nam Hiện nay, màng ối người sử dụng rộng rãi để điều trị số bệnh lĩnh vực nhãn khoa bỏng giác mạc, suy TB vùng rìa, sẹo giác mạc, bệnh pemphigoid hội chứng Stevens-Johnson [7] Chất gian bào màng ối người chứng minh có khả làm tăng sinh TB thần kinh ngoại vi, đồng thời giá đỡ sinh học tiêu hủy thể ghép mà không để lại di chứng Nghiên cứu mở hướng việc sử dụng màng ối TBG màng ối công nghệ mô TÀI LIỆU THAM KHẢO Young CS, et al Tissue-engineered hybrid tooth and bone Tissue Eng 2005, 11 (9-10), pp.1599-1610 Walgenbach KJ, et al Tissue engineering in plastic reconstructive surgery Anat Rec 2001, 263 (4), pp.372-378 Branski LK, et al Amnion in the treatment of pediatric partial-thickness facial burns Burns 2008, 34 (3), pp.393-399 Uchida S, et al Neurotrophic function of conditioned medium from human amniotic epithelial cells J Neurosci Res 2000, 62 (4), pp.585-590 Diaz-Prado S, et al Multilineage differentiation potential of cells isolated from the human amniotic membrane J Cell Biochem 111 (4), pp.846-857 Grueterich M, Espana EM, Tseng SC Ex vivo expansion of limbal epithelial stem cells: amniotic membrane serving as a stem cell niche Surv Ophthalmol 2003, 48, pp.631-646 Dua HS, A Azuara-Blanco Amniotic membrane transplantation Br J Ophthalmol 1999, 83 (6), pp.748-752 Ngµy nhËn bài: 19/10/2012 Ngày giao phản biện: 30/11/2012 Ngày giao th¶o in: 28/12/2012 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 ... tính gốc TBG màng ối sau nuôi cấy màng ối đông khô Nghiên cứu thành công tạo nhiều triển vọng việc sử màng ối công nghệ mô ỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ối tƣợng nghiên cứu Màng ối TBG... 0,9%, tỷ lệ 107 TB/ml * Nuôi cấy TBG màng ối màng ối đông khô: Làm ướt” màng ối đơng khơ mơi trường DMEM, sau dán lên đáy đĩa nuôi cấy Nhỏ TBG chuẩn bị môi trường lên đĩa nuôi cấy với mật độ khoảng... TB nuôi cấy đĩa plastic Đặc điểm hình thái dấu ấn sinh học TBG nuôi cấy màng ối Sau 24 nuôi cấy, TB bám dính lên bề mặt màng ối Thay môi trường ngày/lần Tốc độ tăng sinh TB nuôi cấy màng ối chậm