Nghiên cứu phân loại cá tiểu bạc ở hồ thác bà yên bái

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ðỖ VĂN SƠN NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CÁ TIỂU BẠC Ở HỒ THÁC BÀ – YÊN BÁI LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan những số liệu viết trong bản luận văn này là trung thực và chưa từng ñược công bố ở bất kỳ công trình nào. Kết quả có ñược ở luận văn do sự cố gắng làm việc, nghiên cứu và học hỏi một cách nghiêm túc của bản thân. Tác giả ðỗ Văn Sơn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… ii LỜI CẢM ƠN Lời ñầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS.Thái Thanh Bình, người ñã ñịnh hướng cũng như tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ và tạo ñiều kiện ñể tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Mark Schultz, cán bộ Trung tâm công nghệ sinh học - Trường ðại học Charles Darwin Australia người ñã giúp tôi trong quá giải trình tự ADN cá Tiểu bạc. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới KS.Nguyễn Văn Hảo, CN.Nguyễn Phương Hồng người ñã trực tiếp giúp ñỡ, hộ trợ tôi hoàn thành các thí nghiệm. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ công nhân viên phòng Khoa học và Hợp tác Quốc tế, phòng thí nghiêm công nghệ sinh học Thuỷ Sản - trường Cao ðẳng Thuỷ Sản - Bắc Ninh, cán bộ công nhân viên Công ty Cá tầm phương bắc và ban chủ nhiệm ñề tài “ðánh giá tác ñộng của việc di giống, thuần hoá cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà và ñề xuất hướng phát triển” ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội; Phòng ñào tạo và hợp tác quốc tế - Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 ñã tạo ñiều kiện ñể tôi có ñược khoá học này. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm tới các anh chị ñồng nghiệp, bạn bè, gia ñình ñã cổ vũ và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tác giả ðỗ Văn Sơn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan .i Lời cảm ơn ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH SÁCH CÁC HÌNH .vii PHẦN I. MỞ ðẦU .1 PHẦNII. TỔNG QUAN .3 2.1. Một số ñặc ñiểm sinh học của cá Tiểu bạc .3 2.1.1. Vị trí phân loại 3 2.1.2. Phân bố và di giống cá Tiểu bạc ở Trung Quốc .3 2.1.3. ðặc ñiểm dinh dưỡng 5 2.1.4. ðặc ñiểm sinh trưởng 5 2.1.5. ðặc ñiểm sinh sản .6 2.2. Quá trình di giống thuần hóa cá Tiểu bạc vào Việt Nam 6 2.3. Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở ngoài nước và trong nước 8 2.3.1. Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở ngoài nước 8 2.3.2. Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở trong nước .9 2.4. Một số ứng dụng di truyền phân tử ADN ở ty thể trong nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam 10 2.5. Tổng quan phương pháp sử dụng ñể phân loại . 11 2.5.1. Tách chiết ADN 11 2.5.2. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 12 2.5.3. ðoạn mồi (Primer) 14 2.5.4. ðiện di 16 2.5.5. Xây dựng quan hệ phả hệ 16 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 18 3.1. Thời gian, ñịa ñiểm thực hiện ñề tài 18 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… iv 3.2. ðối tượng nghiên cứu 18 3.3. Phương pháp thu mẫu 18 3.4. Phương pháp phân loại hình thái . 22 3.5. Phương pháp phân loại bằng giải trình tự ADN . 26 3.5.1. Tách chiết ADN . 26 3.5.2. Phản ứng PCR . 28 3.5.3. ðiện di 29 3.5.4. Làm sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit QIAGEN . 30 3.5.5. Giải trình tự ADN . 31 3.6. Phương pháp xử lý số liệu . 32 PHẦN IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 33 4.1. Kết quả nghiên cứu hình thái cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà 33 4.2. Kết quả nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc bằng giải trình tự ADN ở ty thể vùng gen Cytochrome b . 40 4.2.1. Phân loại cá Tiểu bạc dựa trên cây phả hệ . . 41 4.2.2. Kết quả phân tích sự sai khác giữa các loài cá Tiểu bạc . 46 4.2.3. Kết quả phân tích khoảng cách di truyền giữa các nhóm loài cá Tiểu bạc. . 47 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 50 5.1. Kết luận . 50 5.2. Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 51 PHỤ LỤC . 56 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADN : Acid desoxyribonucleic PCR : Polymerase Chain Reaction V : ðơn vị ño hiệu ñiên thế Marker: Thang chuẩn dNTP : Deoxy nucleoside triphosphate Taq : Thermus aquaticus Min : Nhỏ nhất Max : Lớn nhất TB : Trung bình NXB : Nhà xuất bản Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2. 1. Các loài cá trong giống Neosalanx ở Trung Quốc . 4 Bảng 3. 1. ðịa ñiểm, code mẫu, số lượng mẫu cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà ñược phân loại bằng hình thái và giải trình tự ADN . 21 Bảng 3. 2. Các chỉ tiêu phân loại hình thái . 22 Bảng 4. 1. Các chỉ tiêu hình thái của cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà năm 2009, các ký hiệu ñược trình bày ở bảng 3.2 37 Bảng 4. 2. Chỉ tiêu ñếm của cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà năm 2009 38 Bảng 4. 3. ðối chiếu cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà với khóa phân loại 39 Bảng 4. 4. Các loài cá Tiểu bạc trên ngân hàng gen ñược sử dụng ñể so sánh với cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà 41 Bảng 4. 5. Số base sai khác giữa các loài cá Tiểu bạc 47 Bảng 4. 6. Khoảng cách di truyền giữa loài cá Tiểu bạc so với cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà. . 48 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2. 1. Cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà – Yên Bái 3 Hình 2.2. Sơ ñồ nguyên lý của phản ứng PCR 14 Hình 3.1. ðịa ñiểm thu mẫu cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà – Yên Bái 20 Hình 3. 2. Sơ ñồ giải mã trình tự ADN của cá Tiểu bạc . 26 Hình 3. 3. Máy PCR . 29 Hình 3. 4. Máy ñiện di kiểm tra sản phẩn PCR . 30 Hình 4. 1. Cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà – Yên Bái . 34 Hình 4. 2. Mẫu a là cá ñực và b là cá cái; a 1 là vây hậu môn của cá ñực, b 1 là vây hậu môn của cá cái. 36 Hình 4. 3. Cây Neigbor Joining ñược xây dựng từ các trình tự ADN của cá Tiểu bạc vùng gen Cytochrome b với giá trị bootstrap ñược tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu ñược trình bày ở Bảng 3.1 . 42 Hình 4. 4. Cây Minimun Evolution ñược xây dựng từ các trình tự ADN của cá Tiểu bạc vùng gen Cytochrome b với giá trị bootstrap ñược tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu ñược trình bày ở Bảng 3.1 . 43 Hình 4. 5. Cây Unweighted Pain Group Method using Arithmetic mean ñược xây dựng từ các trình tự ADN của cá Tiểu bạc vùng gen Cytochrome b với giá trị bootstrap ñược tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu ñược trình bày ở Bảng 3.1. . 44 Hình 4. 6. Cây Neigbor Joining – dạng vòng ñược xây dựng từ các trình tự ADN của cá Tiểu bạc vùng gen Cytochrome b với giá trị bootstrap ñược tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu ñược trình bày ở Bảng 3.1 45 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 1 PHẦN I. MỞ ðẦU Phân loại cá là một ngành khoa học có lịch sử phát triển lâu ñời trên thế giới. Phân loại là nghiên cứu khởi ñầu cho những nghiên cứu khác về các loài cá. Phân loại góp phần quan trọng lựa chọn loài trong nuôi trồng thủy sản và bảo tồn. Công trình ñầu tiên ñược bắt ñầu từ thời Aristofel trước công nguyên ñến khi thực sự phát triển vào thế kỷ XVI. Những tác giả như Petri Artedi và Hunter ñược xem là người cha ñẻ của ngư loại học (phân loại cá), ñã cho ra ñời hệ thống phân loại cá, trong ñó bậc phân loại mới chỉ xác lập ñến giống. ðến thế kỷ XVIII, Linnaeus vẫn giữ hệ thống của Artedi nhưng ñã có sự thay ñổi và bổ sung quan trọng. ðặc biệt tên mỗi loài ñược sử dụng tên gọi kép: tên giống và tên loài, công trình này ñược xem là cơ sở của phân loại học. Trên cơ sở hệ thống này Linnaeus ñã mô tả 2.600 loài cá [16]. Từ ñó cho ñến nay ñã có nhiều công trình nghiên cứu phân loại cá ñược công bố và bổ sung vào thành phần, số lượng các loài cá hiện nay. Ở Việt Nam việc phân loại cá ñược biết ñến qua sử sách ghi lại từ rất sớm, bắt ñầu từ thời Lê Quý ðôn, song những nghiên cứu thực sự về phân loại từ cuối thế kỷ XIX, ñặc biệt là nghiên cứu phân loại các loài cá nước ngọt. ðầu tiên là tác giả E. Sauvage năm 1881; sau ñó ñến G. Tirant năm 1883, L. Vaillant từ năm 1881 – 1904, P. Chevey từ năm 1930 - 1937. Công trình nghiên cứu khu hệ cá của P. Chevey và J. Lemasson với tác phẩm “Góp phần nghiên cứu các loài cá Bắc Bộ Việt Nam” ñược coi là nghiên cứu lớn nhất ở thời kỳ này. Công trình ñã xác ñịnh ở Miền Bắc Việt Nam có 98 loài trong 71 giống, 17 họ và 10 bộ [5], [6]. Những năm kế tiếp ñã có nhiều tác giả Việt Nam tiến hành phân loại cá như: Mai ðình Yên năm 1987 ñã phân loại ñược 210 loài, 27 họ và 11 bộ. Công trình nghiên cứu này ñã bổ sung và thay thế P. Chevey và J. Lemasson. Ngoài ra còn nhiều tác giả khác như Nguyễn Thái Tự (1983), Nguyễn Hữu Dực (1995), Võ Văn Phú (1998), Ngô Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 2 Sỹ Vân (1999), Nguyễn Thị Thu Hè (2000), Vũ Trung Tạng, Nguyễn Văn Hảo (2001, 2005) . ðã phân loại ñược khu hệ cá nước ngọt Việt Nam có 540 loài, 228 giống, 57 họ thuộc 18 bộ. Có thể nói, phân loại cá ở Việt Nam ñã có ñạt ñược thành tích lớn. Xong chưa thể phân loại ñược hết các loài cá, ñặc biệt là các loài cá di nhập từ nhiều khu vực khác nhau trên thế giới ngày càng ñược phát triển. Tuy nhiên việc phân loại bằng hình thái gặp nhiều khó khăn ở một số loài có kích thước nhỏ, ở các giai ñoạn trứng, ấu trùng, hình thái thay ñổi theo môi trường. ðể khắc phục những hạn chế của phương pháp phân loại cá dựa vào hình thái, việc kết hợp ứng dụng marker phân tử, ñặc biệt ADN ở ty thể trong phân loại cá là rất cần thiết. Vì ADN ở ty thể di truyền theo dòng mẹ, không có sự trộn lẫn. Giải mã trình tự ADN các vùng gen ở ty thể cho kết quả nhanh chính xác, thu mẫu không gây hại ñến ñộng vật. Cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà là ñối tượng ñược di nhập vào Việt Nam ở dạng trứng từ Trung Quốc, khi trưởng thành cá có kích thước nhỏ, mình trong suốt và hầu như không có vẩy do ñó khó phân loại. Từ khi ñược di nhập ñến nay chưa có một công trình nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà nào ñược công bố. Xuất phát từ vấn ñề trên chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà - Yên Bái”. Mục tiêu Phân loại ñược cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà - Yên Bái Nội dung nghiên cứu Phân loại cá Tiểu bạc dựa vào hình thái Phân loại cá Tiểu bạc bằng giải trình tự ADN ở ty thể vùng gen Cytochrome b. . phân loại cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà - Yên Bái . Mục tiêu Phân loại ñược cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà - Yên Bái Nội dung nghiên cứu Phân loại cá Tiểu bạc dựa vào. khai thác. 2.3. Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở ngoài nước và trong nước 2.3.1. Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở ngoài nước Nghiên cứu phân loại cá Tiểu