luận văn thạc sĩ xác định thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của polysaccharide sulfate từ hải sâm stichopus horrens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Dương Khánh Minh XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Nha Trang - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Dương Khánh Minh XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS Chun ngành: Hóa Phân Tích Mã số: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Phạm Đức Thịnh Nha Trang – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu hướng dẫn TS Phạm Đức Thịnh, giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu công tác Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang; Viện Vắc xin Sinh phẩm y tế Các số liệu kết luận văn trung thực chưa công bố Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Khánh Hòa, ngày tháng năm Tác giả Dương Khánh Minh LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Đức Thịnh Phó Viện trưởng, Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang, trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, kiến thức quý báu suốt q trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Viện Vắc xin Sinh phẩm y tế, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa học luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Học viện Khoa học Cơng nghệ tận tình giảng dạy, truyền đạt, trang bị cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập Và cuối xin dành lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln đồng hành, động viên giúp đỡ suốt q trình học tập hồn thành luận văn Luận văn hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số 106.02-2019.34 Tôi xin chân thành cám ơn Khánh Hòa, ngày tháng Học viên Dương Khánh Minh năm Danh mục kí hiệu chữ viết tắt Kí hiệu Tiếng Anh Tên đầy đủ HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao IC Ion Chromatography Sắc kí trao đổi ion GC-FID Gas Chromatography – Flame Ionization Detector Sắc kí khí – đầu dị ion hóa lửa NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) 13 Carbon-13 NMR Spectroscopy Phổ CHTHN carbon 13 Proton NMR Spectroscopy Phổ CHTHN proton IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại Fuc Fucose Đường fucose Gal Galactose Đường galactose Glc Glucose Đường glucose N-Acetyl-galactosamine Đường N-Acetyl galactosamine GlcA Glucuronic acid Đường Glucuronic axit PS Polysaccharide sulfate FCS Fucosylated chondroitin sulfate FS Fucan sulfate C-NMR H-NMR GalNAc CS Chondroitin sulfate EtOH Ethanol TCA Triclorua acetic acid TFA Triflorua acetic acid Cetavlon Hexadecyl trimethyl ammonium bromide DEAE – Macro prep Diethylaminoethyl - Macro prep DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng protein lipid hải sâm số vùng biển giới Bảng 1.2 Thành phần monosaccharide nhóm sulfate FCS từ số loài hải sâm 14 Bảng 1.3 Các dạng sulfate hóa đơn vị phân nhánh FCS từ loài hải sâm khác 20 Bảng 2.1 Các đỉnh phổ, vùng phổ đặc trưng fucoidan xuất phổ hồng ngoại (IR) 39 Bảng 3.1 Hiệu suất chiết polysaccharide sulfate số loài hải sâm 43 Bảng 3.2 Thành phần hóa học PS dạng thơ hải sâm Stichopus horrens 44 Bảng 3.3 Thành phần hóa học PS phân đoạn F1, F2 hải sâm Stichopus horrens 49 DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình thái chung bên ngồi hải sâm Hình 1.2 Hải sâm Stichopus horrens,Selenka,1867 11 Hình 1.3 Cấu trúc fucan sulfate từ hải sâm Stichopus horrens 15 Hình 1.4 Cấu trúc fucan sulfate từ hải sâm Stichopus japonicus, Kariya cộng 16 Hình 1.5 Cấu trúc fucan sulfate từ hải sâm Stichopus japonicus, Long Yu cộng 16 Hình 1.6 Cấu trúc fucan sulfate từ hải sâm Isostichopus badionotus 17 Hình 1.7 Cấu trúc fucan sulfate từ hải sâm Ludwigothurea grisea … 18 Hình 1.8 Cấu trúc fucosylate chondroitin sulfate 19 Hình 1.9 Cấu trúc đơn vị chuỗi fucosylated chondroitin sulfate…… .19 Hình 1.10 Cấu trúc đặc trưng fucosylated chondroitin sulfate số loài hải sâm nghiên cứu nhiều tác giả (a) β-D-glucuronic acid, (GlcA) (b) N-acetyl- β-D-galactosamine, (GalNAc) (c) mạch nhánh fucose, α-L-fucose… 21 Hình 2.1 Nguyên liệu hải sâm Stichopus horrens 29 Hình 2.2 Quy trình chiết tách thu polysaccharide sulfate dạng thô từ hải sâm Stichopus horrens 33 Hình 2.3 Quy trình tinh polysaccharide sulfate kỹ thuật sắc ký trao đổi anion nhựa DEAE Macro-prep 35 Hình 3.1 Tách phân đoạn PS từ hải sâm Stichopus horrens phương pháp sắc ký trao đổi ion 47 Hình 3.2 Sắc ký đồ IC thu dung dịch chuẩn đường đơn 50 Hình 3.3 Sắc ký đồ IC thành phần đường đơn phân đoạn F1 51 Hình 3.4 Sắc ký đồ IC thành phần đường đơn phân đoạn F2 51 Hình 3.5 Phổ hồng ngoại IR phân đoạn F1 (A) F2 (B) PS hải sâm Stichopus horrens 54 Hình 3.6 Phổ 1H-NMR phân đoạn F1 (A) F2 (B) PS hải sâm Stichopus horrens 57 Hình 3.7 Cấu trúc phân đoạn F1 (FCS1) PS hải sâm Stichopus horrens 58 Hình 3.8.Phổ 13C-NMR phân đoạn F2 PS hải sâm Stichopus horrens.59 Hình 3.9 Cấu trúc phân đoạn F2 (FS2) PS hải sâm Stichopus horrens 59 MỤC LỤC MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI: MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU: 3.1 Đối tượng nghiên cứu: 3.2 Phạm vi nghiên cứu: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 5.1 Ý nghĩa khoa học: 5.2 Ý nghĩa thực tiễn: CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ HẢI SÂM 1.1.1 Giới thiệu chung hải sâm 1.1.2 Hải sâm Stichopus horrens 10 1.1.2.1 Phân loại 10 1.1.2.2 Đặc điểm hình thái sinh sản 11 1.1.2.3 Phân bố môi trường sống 12 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM 12 1.2.1 Thành phần hóa học polysaccharide sulfate từ hải sâm 12 1.2.2 Thành phần đa dạng cấu trúc polysaccharide sulfate từ hải sâm 15 1.2.2.1 Các nghiên cứu thành phần Fucan sulfate 15 1.2.2.2 Các nghiên cứu thành phần Fucosylate chondroitin sulfate18 1.2.3 Hoạt tính sinh học ứng dụng polysaccharide sulfate hải sâm 22 1.2.3.1 Hoạt tính chống đơng tụ máu hình thành huyết khối FCS 22 1.2.3.2 Hoạt tính gây ức chế tổn thương mô 23 71 [69] Alves A.P., Mulloy B., Diniz J.A., Mourão P.A.S., 1997, Sulfated polysaccharides from the Egg Jelly Layer are species-specific inducers of acrosomal reaction in sperms of sea urchins, The Journal of Biological Chemistry, 272 (11), pp 6965 – 6971 [70] Mohamed Ben Mansour, Rafik Balti, Lamia Yacoubi, Véronique Ollivier, Frédéric Chaubet, Raoui Mounir Maaroufi, 2019, Primary structure and anticoagulant activity of fucoidan from the sea cucumber Holothuria polii, International Journal of Biological Macromolecules, 121, pp 1145 – 1153 [71] Joanne Katherine Talens Manlusoc, Chieh-Lun Hsieh, Cheng-Yang Hsieh, Ellen San Nicolas Salac, Ya-Ting Lee, Po-Wei Tsai, 2019, Pharmacologic Application Potentials of Sulfated Polysaccharide from Marine Algae, Polymers MDPI, 11(7), pp 1163 [72] Dai-Hung Ngo, Se-Kwon Kim, 2013, Sulfated polysaccharides as bioactive agents from marine algae, International Journal of Biological Macromolecules, 62, pp 70 – 75 [73] http://www.nitra.ac.vn/tabid/63/id/329/language/vi-VN/Default.aspx [74] http://baochinhphu.vn/Bien-Viet-Nam/Da-xac-dinh-danh-muc-gan12000-loai-sinh-vat-bien-Viet-Nam/330856.vgp [75] Pham Duc Thinh, Bui Minh Ly, Roza V Usoltseva, Natalia M.Shevchenko, Anton B Rasin, Stanislav D Anastyuk, Olesya S.Malyarenko, Tatiana N Zvyagintseva, Pham Trung San, Svetlana P Ermakova, 2018, A novel sulfated fucan from Vietnamese sea cucumber Stichopus variegatus: Isolation, structure and anticancer activity in vitro, International Journal of Biological Macromolecules, 117, pp 1101 – 1109 [76] Pham Duc Thinh, Tran Thanh Huyen, Tran Thi Thanh Van, Cao Thi Thuy Hang, Dinh Thanh Trung, Pham Trung San, 2019, Extraction and structural characteristic of polysaccharide sulfate from sea cucumber Holothuria spinifera, Vietnam Journal of Chemistry, 57(4E1,2):108-13 [77] Mai Ngơ Thương Hồi, 2019, Nghiên cứu chiết tách phân tích đặc trưng cấu trúc glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra, Luận văn 72 thạc sĩ, Học viện khoa học công nghệ, Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam [78] Dong X., Pan R., Deng X., Chen Y., Zhao G., Wang C., 2014, Separation purification, anticoagulant activity and preliminary structural characterization of two sufated polysaccharides from sea cucumber Acaudina molpadioidea and Holothuria nobilis, Process Biochemistry, 49, pp 1352 – 1361 [79] Storer A.C., Ménard R., 2013, Papain, Handbook of Proteolytic Enzymes, Chapter 419, pp 1858 – 1861 [80] Qin Y., Yuan Q., Zhang Y., Li J., Zhu X., Zhao L., Wen J., Liu J., Zhao L., Zhao J., 2018, Enzyme-Assisted Extraction Optimization, Characterization and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Sea Cucumber Phyllophorus proteus, Molecules MDPI, 23(3), 590, pp – 19 [81] Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F., 1956, Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances Analytical Chemistry, 28(3), pp 350 – 356 [82] Dodgson K.S., Price R.G., 1962, A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides, Biochemical Journal, 84(1), pp 106 – 110 [83] Bitter T., Muir H.M., 1962, A modified uronic acid carbazole reaction Analytical Biochemistry, 4(4), pp 330 – 334 [84] Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.l., Randall R.J., 1951, Protein measurement with the Folin phenol reagent, Journal of Biological Chemistry, 193(1), pp 265 – 275 [85] Thermo Scientific, 2013, Column Product Manual, Dionex CarboPac MA1, 18 pages [86] Phạm Đức Thịnh, 2015, Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học fucoidan có hoạt tính sinh học từ số lồi rong nâu Vịnh Nha Trang, Luận án tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội 73 [87] Yang D., Lin F., Huang Y., Ye J., Xiao M., 2020, Separation, purification, structural analysis and immune-enhancing activity of sulfated polysaccharide isolated from sea cucumber viscera, International Journal of Biological Macromolecules, 115, pp 1003 – 1018 [88] Song S., Wu S., Ai C., Xu X., Zhu Z., Cao C., Yang J., Wen C., 2018, Compositional analysis of sulfated polysaccharides from sea cucumber (Stichopus japonicus) released by autolysis reaction, International Journal of Biological Macromolecules, 114, pp 420 – 425 [89] Zhao L., Liu Q., Yang X., Cao R., 2018, Comparative Study on Antineoplastic Activity of Polysaccharide from Four Kinds of Sea Cucumber, Journal of Ocean University of China, 17, pp 1473 – 1478 [90] Ustyuzhanina N.E., Bilan M.I., Dmitrenok A.S., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I., 2018, Two structurally similar fucosylated chondroitin sulfates from the holothurian species Stichopus chloronotus and Stichopus horrens, Carbohydrate Polymers, 189, pp 10 – 14 [91] Wu N., Chen S., Ye X., Li G., Yin L., Xue C., 2014, Identification of fucans from four species of sea cucumber by high temperature 1H-NMR, Journal of Ocean University of China, 13(5), pp 871 – 876 [92] Jiaojiao Mou, Cong Wang, Wenjing Li, Jie Yang, 2017, Purification, structural characterization and anticoagulant properties of fucosylated chondroitin sulfate isolated from Holothuria mexicana, International Journal of Biological Macromolecules, 98, pp 208 – 215 [93] Nahla El-Sayed El-Shazly Omran, 2013, Nutritional value of some Egyptian sea cucumbers, African Journal of Biotechnology, 12(35), pp 5466 – 5472 [94] Wu M., Xu S., Zhao J., Kang H., Ding H., 2010, Preparation and characterization of molecular weight fractions of glycosaminoglycan from sea cucumber Thelenata ananas using free radical depolymerization, Carbohydrate Research, 345, pp 649 – 655 74 [95] Tapon-Bretaudiere J., Chabut D., Zierer M., Matou S., Helley D., Bros A., Mourão P.A., Fischer A.M., 2002, A fucosylated chondroitin sulfate from echinoderm modulates in vitro fibroblast growth factor 2-dependent angiogenesis, Molecular Cancer Research, 1(2), pp 96 – 102 [96] Pang Myron, Shafiquzzaman Siddiquee, Sujjat Al Azad, 2017, Partial structural studies of fucosylated chondroitin sulfate (FuCS) using attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) and chemometrics, Vibrational Spectroscopy, 89, pp 26 – 36 [97] Mohamed Ben Mansour, Rafik Balti, Véronique Ollivier, Hichem Ben Jannet, Frédéric Chaubet, Raoui Mounir Maaroufi, 2017, Characterization and anticoagulant activity of a fucosylated chondroitin sulfate with unusually procoagulant effect from sea cucumber, Carbohydrate Polymers, 174, pp 760 – 771 [98] Yu L., Xue C., Chang Y., Xu X., Ge L., Liu G., Wang Y., 2014, Structure elucidation of fucoidan composed of a novel tetrafucose repeating unit from sea cucumber Thelenota ananas, Food Chemistry, 146, pp 113 – 119 [99] Pereira M.S., Oehninger S., Barnett T., Williams R.L., Clark G.F., 1999, Structure and anticoagulant activity of sulfated fucans Comparison between the regular, repetitive, and linear fucans from echinoderms with the more heterogeneous and branched polymers from brown algae, Journal of Biological Chemistry, 247(12), pp 7656 – 7667 75 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đồ thị xây dựng đường chuẩn dung dịch chuẩn D-Glucose phân tích hàm lượng carbohydrate mẫu PS dạng thơ OD 490 nm Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Carbohydrate 1,8 1,6 1,4 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 0.0084x - 0.0364 R² = 0.9989 50 100 150 200 250 Nồng độ dung dịch chuẩn D-Glucose (ug/ml) Phụ lục 2: Đồ thị xây dựng đường chuẩn dung dịch chuẩn K2SO4 phân tích hàm lượng sulfate mẫu PS dạng thô Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng sulfate 0,35 y = 0.0005x - 0.0779 R² = 0.9957 OD 360 nm 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 200 300 400 500 600 Nồng độ dung dịch chuẩn K2SO4 (ug/ml) 700 800 76 Phụ lục 3: Đồ thị xây dựng đường chuẩn dung dịch chuẩn D-Glucuronic acid phân tích hàm lượng uronic acid mẫu PS dạng thô Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Uronic acid 0,6 y = 0.0041x + 0.0011 R² = 0.996 OD 525 nm 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ dung dịch chuẩn D-Glucuronic acid (ug/ml) Phụ lục 4: Đồ thị xây dựng đường chuẩn dung dịch chuẩn BSA phân tích hàm lượng protein mẫu PS dạng thô Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Protein 1,000 y = 0.0065x + 0.0702 R² = 0.9991 OD 750 nm 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 Nồng độ dung dịch chuẩn BSA (ug/ml) 100,00 120,00 77 Phụ lục 5: Đồ thị xây dựng đường chuẩn dung dịch chuẩn D-Glucose phân tích hàm lượng carbohydrate phân đoạn PS Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Carbohydrate 1,8 y = 0.0083x + 0.0333 R² = 0.999 OD 490 nm 1,6 1,4 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 0 50 100 150 200 250 Nồng độ dung dịch chuẩn D-Glucose (ug/ml) Phụ lục 6: Đồ thị xây dựng đường chuẩn dung dịch chuẩn K2SO4 phân tích hàm lượng sulfate phân đoạn PS Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng sulfate 0,35 y = 0.0005x - 0.0526 R² = 0.9955 OD 360 nm 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 200 300 400 500 600 Nồng độ dung dịch chuẩn K2SO4 (ug/ml) 700 800 78 Phụ lục 7: Đồ thị xây dựng đường chuẩn dung dịch chuẩn D-Glucuronic acid phân tích hàm lượng uronic acid phân đoạn PS Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Uronic acid 0,6 y = 0.0042x + 0.0009 R² = 0.9974 OD 525 nm 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ dung dịch chuẩn D-Glucuronic acid (ug/ml) Phụ lục 8: Đồ thị xây dựng đường chuẩn dung dịch chuẩn BSA phân tích hàm lượng protein phân đoạn PS Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Protein 1,000 y = 0.0065x + 0.0681 R² = 0.9983 OD 750 nm 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 Nồng độ dung dịch chuẩn BSA (ug/ml) 120,00 79 Phụ lục 9: Sắc ký đồ IC PS dạng thô từ hải sâm Stichopus horrens 80 Phụ lục 10: Sắc ký đồ IC phân đoạn PS F1 từ hải sâm Stichopus horrens 81 Phụ lục 11: Sắc ký đồ IC phân đoạn PS F2 từ hải sâm Stichopus horrens 82 Phụ lục 12: Phổ IR mẫu PS dạng thô từ hải sâm Stichopus horrens 83 Phụ lục 13: Phổ IR phân đoạn PS F1 từ hải sâm Stichopus horrens Phụ lục 14: Phổ IR phân đoạn PS F2 từ hải sâm Stichopus horrens 84 Phụ lục 15: Phổ 1H-NMR phân đoạn PS F1 từ hải sâm Stichopus horrens Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR phân đoạn PS F2 từ hải sâm Stichopus horrens 85 Phụ lục 17: Phổ 13C-NMR phân đoạn PS F2 từ hải sâm Stichopus horrens ... ? ?Xác định thành phần hóa học đặc điểm cấu trúc polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens? ?? nhằm thu nhận, nghiên cứu đặc điểm cấu trúc PS loài Stichopus horrens vùng biển Nha Trang, từ. .. 46 3.2.2 Thành phần hóa học phân đoạn thu polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens 48 3.3 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE CÓ NGUỒN GỐC TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS ... POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM 12 1.2.1 Thành phần hóa học polysaccharide sulfate từ hải sâm 12 1.2.2 Thành phần đa dạng cấu trúc polysaccharide sulfate từ hải sâm