Sàng lọc vi khuẩn sinh beta lactamase phổ rộng phân lập tại bệnh viện đa khoa trung ương thái nguyên bằng kỹ thuật multiplex pcr

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ KHÁNH LY SÀNG LỌC VI KHUẨN SINH BETA – LACTAMASE PHỔ RỘNG PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TRUNG ƢƠNG THÁI NGUYÊN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR Chuyên ngành: Công nghệ sinh Mã số : 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Đắc Trung Thái Nguyên, năm 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ i LỜI CẢM ƠN Lời cho gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Tiến sĩ Nguyễn Đắc Trung – Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành tốt luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới bác sĩ, kỹ thuật viên khoa Vi sinh – Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên, tới cán nhân viên Bộ môn Vi sinh – Đại học Y – Dược Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ, cho trình làm luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo, thầy cô giáo, cán giảng dạy Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên tận tình giảng dạy suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Lao Bệnh phổi Thái Nguyên, nơi công tác tạo điều kiện thời gian cho tơi suốt q trình nghiên cứu Thái Nguyên, tháng năm 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ii DANH MỤC BẢNG BẢNG TÊN BẢNG BIỂU Trang 2.1 Các dung dịch đệm sử dụng thí nghiệm 21 2.2 Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 22 2.3 Các giai đoạn trình nghiên cứu 28 2.4 Trình tự cặp mồi thiết kế để khuếch đại gen 29 2.5 Thành phần phản ứng PCR đơn mồi 30 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi gene blaTEM 30 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi gene blaCTX-M 31 2.8 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi gene blaSHV 31 2.9 Thành phần phản ứng multiplex - PCR 32 2.10 Chu trình nhiệt phản ứng multiplex - PCR 33 3.1 Cơ cấu loại vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập 34 3.2 Tỷ lệ đề kháng kháng kháng sinh E coli (43 chủng) 35 3.3 Tỷ lệ đề kháng kháng kháng sinh Klebsiella pneumoniae 37 3.4 Kiểu cách kháng kháng sinh E coli K pneumoniae 39 3.5 Tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL 41 3.6 Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng E coli ESBL 42 3.7 3.8 Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng K pneumoniae ESBL(+) Kiểu gene ESBL bla tìm thấy chủng vi khuẩn Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 43 52 iii DANH MỤC HÌNH TÊN HÌNH ẢNH HÌNH Trang 1.1 Phương pháp đĩa đơi xác định vi khuẩn sinh ESBL 17 1.2 E-test xác định vi khuẩn sinh ESBL 18 Sơ đồ bước thực trình nghiên cứu 27 3.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh E coli 36 3.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh Klebsiella pneumoniae 37 3.3 Kiểu cách kháng kháng sinh E coli K Pneumoniae 39 3.4 Kết Double-disk test chủng vi khuẩn ESBL(+) 41 3.5 Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng E coli ESBL(+) 42 3.6 Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng K pneumoniae ESBL(+) 44 3.7 Kết khuếch đại gene blaTEM PCR đơn gene 46 3.8 Kết khuếch đại gene blaCTX-M PCR đơn gene 47 3.9 Kết khuếch đại gene blaSHV PCR đơn gene 49 3.10 Kết khuếch đại gene blaTEM blaCTX-M multiplex- 51 PCR Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iv MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kháng sinh chế kháng thuốc vi khuẩn 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại phổ tác dụng chống định thuốc kháng sinh 1.1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.1.4 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn 1.2 Enzyme β – lactamase hoạt phổ rộng 1.2.1 Lịch sử phát enzyme β- lactamase hoạt phổ rộng 1.2.2 Định nghĩa ESBL 10 1.3 Tình hình nghiên cứu khả sinh ESBL vi khuẩn gây bệnh 10 1.3.1 Trên giới 10 1.3.2 Tại Việt Nam 12 1.4 Các gen mã hóa ESBL 13 1.4.1 TEM 13 1.4.2 SHV 13 1.4.3 CTX – M 14 1.4.4 OXA 15 1.5 Một số phương pháp phát vi khuẩn sinh ESBL 16 1.5.1 Phương pháp đĩa đôi 17 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ v 1.5.2 Phương pháp đĩa kết hợp (Double disk test) 17 1.5.3 Phương pháp E-test 18 1.5.4 Vitek ESBL card 18 1.5.5 Hệ thống tự động BD Phoenix (Becton Dickinson Biosciences) 18 1.5.6 Các phương pháp sinh học phân tử 19 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1 Các chủng vi khuẩn 21 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 21 2.1.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn 23 2.1.4 Vật liệu môi trường xác định độ nhạy cảm vi khuẩn với 23 2.2 Địa điểm nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Gram âm 23 2.3.2 Kỹ thuật xác định độ nhạy cảm với kháng sinh 24 2.3.3 Kỹ thuật xác định vi khuẩn sinh ESBL 25 2.3.4 Sàng lọc vi khuẩn Gram âm sinh ESBL kỹ thuật multiplex-PCR 26 2.4 Xử lý số liệu 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tỷ lệ kiểu cách kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập 34 3.2 Tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL………… ……………….………… 40 3.3 Tỷ lệ mức độ kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm (E coli Klebsiella pneumoniae) sinh ESBL phân lập 42 3.3 Khuếch đại gene ESBL E coli Klebsiella pneumoniae 45 3.3.1 Kết khuếch đại gene ESBL kỹ thuật PCR 45 3.3.1.1 Gene blaTEM 46 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vi 3.3.1.2 Gene blaCTX-M 47 3.3.1.3 Gene blaSHV 48 3.3.2 Kết khuếch đại gene ESBL kỹ thuật multiplex – PCR 50 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ KẾT LUẬN 54 KHUYẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMC Amoxycillin/ Acid clavuanate DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid FEP Cefepime CTX Cefotaxime CAZ Ceftazidime CRO Ceftriaxone CXM Cefuroxime CIP Ciprofloxacin dNPTs Deoxyribonucleotide Triphosphate DO Doxycyline E coli Escherichia coli ESBL Extended-spectrum beta lactamase K pneumoniae Klebsiella pneumoniae MEM Meropenem MPA Meat – Peptone – Agar OFX Ofloxacin PABA Para - aminobenzoic acid PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris – Acetate - EDTA Bp Base pairs Taq – DNA polymerase Themus aquaticus DNA polymerase W/v Weight/volume Bla Số hóa trung tâm học liệu β- lactamase http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Việc phát minh kháng sinh năm 1928 làm tăng hiệu xử lý ổ nhiễm trùng Nhờ nhiều bệnh giải dựa vào việc điều trị phác đồ kháng sinh Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh tràn lan nhiều thập kỷ qua dẫn đến xuất nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh Nhiều bệnh dịch nhiễm trùng kháng thuốc lên kháng sinh dần hiệu lực điều trị Đây mối lo chung ngành y tế toàn xã hội Việc giới thiệu kháng sinh cephalosporin hệ thứ ba vào thực hành điều trị lâm sàng nhiễm khuẩn đầu năm 1980 dự báo bước đột phá chiến chống lại vi khuẩn gây bệnh sinh β-lactamase ESBL β-lactamase có khả tác động lên phân tử penicillin cephalosporin hệ 1, hệ 2, hệ aztreonam (trừ kháng sinh cefamycin carbapenem) chúng có khả ly giải kháng sinh chúng lại bị ức chế các chất ức chế β-lactamase acid clavulanic [1, 18] Nhiều gene mã hóa ESBL nằm phân tử plasmid lớn Các plasmid kháng thuốc tìm thấy vi khuẩn họ Entobacteriaceae, hay gặp E coli Klebsiella spp [2, 3, 4, 17, 20, 21, 23] Nhiễm trùng chủng vi khuẩn sinh β-lactamase phổ rộng dẫn đến gia tăng tỷ lệ thất bại điều trị kháng sinh, làm tăng cao tỷ lệ tử vong đặc biệt trường hợp nhiễm khuẩn huyết vi khuẩn sinh ESBL Khi chủng vi khuẩn sinh ESBL đồng nghĩa với việc chúng kháng lại nhiều loại kháng sinh, đặc biệt kháng sinh nhóm cephalosporin Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên bệnh viện hạng I trực thuộc Bộ Y tế, thành lập từ năm 1951, có nhiệm vụ khám chữa bệnh cho nhân dân dân tộc miền núi vùng Đông bắc Việt Nam Bệnh viện đóng địa bàn trung tâm tỉnh Thái Nguyên có trách nhiệm phục vụ trực tiếp Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ cho người dân tỉnh Lưu lượng bệnh nhân đến khám điều trị bệnh viện ngày tăng Nhiều nghiên cứu cấu vi khuẩn mức độ kháng kháng sinh vi khuẩn phân lập bệnh viện thực công bố tạp chí nước Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu điều tra vi khuẩn sinh β-lactamase phổ rộng thực bệnh viện Đó lý chúng tơi chọn tên đề tài “ Sàng lọc vi khuẩn sinh beta – lactamase phổ rộng phân lập bệnh viện Đa khoa trung ƣơng Thái Nguyên kỹ thuật multiplex - PCR” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định tỷ lệ kiểu cách kháng kháng sinh số vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập BVĐKTƯ Thái Nguyên Xác định tỷ lệ mức độ kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm sinh ESBL phân lập BVĐKTƯ Thái Nguyên Phát số gene ESBL chủng vi khuẩn phân lập kỹ thuật multiplex - PCR NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Thu thập bệnh phẩm từ mẫu bệnh hô hấp, sinh dục bệnh phẩm khác Nuôi cấy, phân lập xác định vi khuẩn Thực kỹ thuật kháng sinh đồ xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh ESBL kỹ thuật khoanh giấy đôi (double dist test) Sử dụng kỹ thuật muitiplex PCR để phát gene sinh ESBL (SHV, CTX TEM) Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 51 cho kết PCR dương tính blaTEM blaCTX-M để khuếch đại gene ESBL tương ứng M 10 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp ≈ 970 bp ≈ 540 bp 250 bp Hình 3.10 Kết khuếch đại gene blaTEM blaCTX-M multiplex-PCR M Marker GeneRulerTM 1kb; Chứng âm; B5(blaTEM); B5(blaCTX-M); B5(multiplex PCR blaTEM & blaCTX-M); A25(blaTEM); A25 (blaCTX-M); A25 (multiplex PCR blaTEM & blaCTX-M); C15(blaTEM); C15 (blaCTX-M); 10 C15 (multiplex PCR blaTEM&blaCTX-M); Kết điện di từ hình 3.5 cho thấy: - Chủng B5: đường chạy số (PCR với blaTEM) đường chạy số (multiplex - PCR) xuất băng DNA có kích thước 970 bp; đường chạy số (PCR với blaCTX-M) không xuất băng DNA Kết luận: chủng B5 mang gene blaTEM - Chủng A25: đường chạy số (PCR với blaTEM) đường chạy số (Multiplex - PCR) xuất băng DNA có kích thước 970 bp; đường chạy số (PCR với blaCTX-M) đường chạy số (multiplex - PCR) xuất Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 52 băng DNA có kích thước 540 bp Kết luận: chủng A25 mang gene blaTEM blaCTX-M - Chủng C15: đường chạy số (PCR với blaCTX-M) đường chạy số 10 (multiplex - PCR) xuất băng DNA có kích thước 540 bp; đường chạy số (PCR với blaTEM) không xuất băng DNA Kết luận: chủng B5 mang gene blaCTX-M Các phản ứng multiplex - PCR với tất chủng vi khuẩn ESBL(+) nghiên cứu cho kết phù hợp với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đơn lẻ (blaTEM blaCTX-M) Như vậy, cho kết giống nhận thấy việc tiến hành phản ứng multiplex - PCR để phát gene bla có hiệu cao so với việc tiến hành phản ứng PCR đơn mồi, hiệu quả: tiết kiệm thời gian thực phản ứng, tiết kiệm hóa chất, vật tư tiêu hao) Bảng 3.8 Kiểu gene ESBL bla tìm thấy chủng vi khuẩn Số chủng vi khuẩn mang gene Vi khuẩn (Số chủng) blaTEM blaCTX-M blaSHV blaTEM+CTX Âm tính E coli (17) 2 K pneumoniae (8) 0 Tổng số (25) 11(44%) (36 %) (%) (8%) (12%) Nhận xét: Bằng phản ứng PCR đơn mồi multiplex - PCR khuếch đại gene ESBL cần tìm, kết cho thấy gene blaTEM blaCTX-M tìm thấy vi khuẩn E coli Klebsiella pneumoniae Trong 44% số chủng ESBL(+) mang gene blaTEM 36% mang gene blaCTX-M Gene blaTEM chủ yếu tìm thấy E coli, gene blaCTX-M lại thường tìm thấy vi khuẩn K Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 53 pneumoniae Gene blaSHV không xuất chủng vi khuẩn sinh ESBL Sự kết hợp hai gene blaTEM blaCTX-M tìm thấy chủng E coli Cả gene blaTEM, blaCTX-M blaSHV khơng tìm thấy chủng E coli chủng K pneumoniae Trong nghiên cứu này, tượng vi khuẩn E coli K pneumoniae mang chủ yếu gene blaTEM blaCTX-M tương ứng với kết nghiên cứu Van Cao cộng tiến hành Việt Nam năm 2001 [47] Trong nghiên cứu mình, nhóm tác giả cịn nhận thấy khơng có kết hợp hai gene blaTEM + blaCTX-M nghiên cứu chúng tơi mà cịn xuất vài kiểu kết hợp gene khác chủng vi khuẩn blaTEM + blaSHV, blaCTX-M + blaSHV blaTEM + blaCTX-M + blaSHV Ngoài gene blaTEM, blaCTX-M blaSHV, nhóm nghiên cứu cịn tìm thấy gene blaVEB chủng vi khuẩn nghiên cứu Tuy nhiên, có chủng K pneumoniae chủng E coli sinh ESBL khơng tìm thấy gene bla tương tự kết nghiên cứu chúng tơi Điều chủng vi khuẩn có mang gene ESBL khơng nằm kiểu gene đích mà tác giả nhằm tới Đây hướng nghiên cứu cần bổ sung để xây dựng đồ dịch tễ học đầy đủ phân bố kiểu gene ESBL quần thể vi khuẩn gây bệnh khu vực nghiên cứu Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 54 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ KẾT LUẬN Tỷ lệ kiểu cách kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm gây bệnh - Trong vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập chủ yếu E coli (43 chủng; 48,31%) Klebsiella pneumoniae (24 chủng; 26,97%) - Đề kháng với kháng sinh phổ rộng cephalosporin hệ 3: 39,53 % đến 51,16 % E Coli, K pneumoniae 37,5% đến 50% Tỷ lệ mức độ kháng kháng sinh E coli Klebsiella pneumoniae sinh ESBL - 17 chủng E coli (39,53%) chủng Klebsiella pneumoniae (33,33%) sinh ESBL - Vi khuẩn ESBL(+) có tỷ lệ đề kháng cao với kháng sinh cephalosprin hệ 3 Kết phát số gene ESBL chủng E coli Klebsiella pneumoniae phản ứng multiplex - PCR - Gene blaTEM (kích thước 970 bp) gene blaCTX-M (kích thước 540 bp) tìm thấy số chủng vi khuẩn sinh ESBL - Gene blaSHV khơng tìm thấy chủng vi khuẩn ESBL(+) - Gene blaTEM tìm thấy 9/17 chủng E coli ESBL(+) 2/8 chủng Klebsiella pneumoniae ESBL(+) - Gene blaCTX-M tìm thấy 4/17 chủng E coli ESBL(+) 5/8 chủng Klebsiella pneumoniae ESBL(+) - Có chủng E coli ESBL(+) mang hai gene blaTEM blaCTX-M - Có chủng E coli ESBL(+) chủng Klebsiella pneumoniae ESBL(+) không tìm thấy gene bla Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 55 KHUYẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu thêm phân bố gene ESBL chủng vi khuẩn gây bệnh - Nghiên cứu đặc điểm phân tử gene ESBL tìm thấy Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Hồi Anh, Ngơ Qúy Châu (2011), “ Đặc điểm lâm sàng vi khuẩn bệnh nhân viêm phổi bệnh viện”, Tạp chí nghiên cứu y học- Bộ y tế, ĐH Y Hà Nội - Số 2/Tháng Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, chủ biên - Bộ y tế, NXB Y học, Hà Nội , tr.109- 135 Nguyễn Hữu Hồng, Phạm Văn Ca (1999) “ Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn phân lập Việt Nam giai đoạn 1898- 1994”, Một số cơng trình nghiên cứu độ nhạy cảm vi khuẩn với thuốc kháng sinh, Viện thông tin thư viện y học trung ương, tr 3-13 Lê Minh Nguyệt (2002), Vi sinh vật y học, Bộ y tế, NXB y học, Hà Nội , tr 38-86 Kiều Chí Thành, Lê Thu Hồng (2012) “Nghiên cứu cấu vi khuẩn gây bệnh tỷ lệ đề kháng kháng sinh chủng phân lập Bệnh viện 103 từ 6/2010-12/2011” Tạp chí Y học thực hành, 848:tr 12-14 Nguyễn Thái Sơn, Nguyễn Văn Việt, Lê Thu Hồng (2012), “Vi khuẩn gây bệnh đặc điểm kháng thuốc kháng sinh chúng Bệnh viện 103 (20072011)” Báo cáo Hội nghị Vi sinh lâm sàng, Bộ môn-Khoa Vi sinh, Bệnh viện 103, Học viện Quân Y Tháng Đoàn Mai Phương (2012), “Cập nhật đề kháng kháng sinh Bệnh viện Bạch Mai” Báo cáo Hội nghị Vi sinh lâm sàng, Bộ môn-Khoa Vi sinh, Bệnh viện 103, Học viện Quân Y Tháng Phan Quốc Hoàn, Nguyễn Kim Phương (2012), “Xu hướng đề kháng kháng sinh chủng vi khuẩn gây bệnh Bệnh viện Trung ương quân đội Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 57 108; năm 2008-2011” Báo cáo Hội nghị Vi sinh lâm sàng, Bộ môn-Khoa Vi sinh, Bệnh viện 103, Học viện Quân Y Tháng Đoàn Thu Hà, Đỗ Thị Sâm, Vũ Thị Hà (2012), “Sự phân bố vi khuẩn tình trạng kháng kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập Bệnh viện Saint-Paul năm 2011” Báo cáo Hội nghị khoa học vi sinh Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Hà Nội Tháng 11 10 Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, Tập 2, Nxb Khoa học Tự nhiên Công nghệ 11 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen – nguyên lý ứng dụng, Nxb Khoa học Kỹ thuật 12 Nguyễn Vũ Trung, Lê Huy Chính, Lê Văn Phủng, Andrej weintraub (2003), “Phát triển ứng dụng PCR đa mồi chẩn đoán E coli gây tiêu chảy từ phân”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, tr – 14 B Tài liệu tiếng Anh: 13 Roberto V., Maricel., Rossana L., Myron L., Valeria P (2004), “Multiplex PCR for diagnosis of enteric infections associated with diarrheagenic Escherichia coli”, J Clin Microbiol, Vol.42, No.4, pp.17871789 14 Wang G., Clart C.G., Rodgers F.G (2002), “Detection in Escherichia coli of the genes encoding the major virulence factors, the gene defining the 0157:H7 serotype, and components of the type Shiga toxin family by Multiplex PCR”, J Clin Microbiol, Vol.44, pp.3613-3619 15 Shima K., Kawamura N., Hineoya A., Sugimoto N., Wu Y., Asakura M., Nishimura K., Nair G.B., Yamasaki S (2008), “Rapid culture-free indentification and mocular typing of Shiga toxin-producing Escherichia coli by PCR-RFLP”, Microbiol Immunol, Vol.52, No.6, pp.310-315 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 58 16 Steingrube V.A., Wilson R.W., Brown B.A., Jost K.C., Blacklock Z., Gibson J.L (1997), “Wallace R.J., Rapid indentification of the clinically singnificant species and taxa of aerobic actinomycetes, including Actinomadur, gordona, Nocardia, Rhodocuccus, Streptomyces, and Tsukamurella isolates, by DNA amplification and restriction endonuclease analysis”, J Clin Microbiol, Vol.35, pp.817-822 17 Ava B., Mohammad R., Jalil V Y (1999), “Frequency of extended spectrum beta-lactamase (ESBLs) producing Escherichia coli and Klebsiella pneumonia isolated from urine in an Iranian 1000-bed tertiary care hospital”, African Journal of Mircobiology Research, vol 4, no 4, pp 881-884 18 Bauernfeind A., I, Stemplinger., R Jungwirth., P Mangold., S Amann., E Akalin., O Ang,, C Bal., and J M Casellas (1996), “Characterization of beta-lactamase gene blaPER-2, which encodes an extended-spectrum class A beta-lactamase”, Antimicrob Agents Chemother, vol.40, pp: 616-620 19 Bonnet, R (2004), “Growing group of extended-spectrum beta-lactamases: the CTX-M enzymes”, Antimicrob Agents Chemother, vol.48,pp:1-14 20 Bonnet, R., J L Sampaio., C Chanal., D Sirot., C De Champs., J L Viallard., R Labia., and J Sirot (2004), “A novel class A extended-spectrum beta-lactamase (BES-1) in Serratia marcescens isolated in Brazil”, Antimicrob Agents Chemother, vol,44, pp: 3061-3068 21 Bradford, P A (2001), “Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat”, Clin Microbiol Rev, vol.14, pp: 933-951 22 Cao V., Lambert T., Nhu D.Q., Loan H.K., Hoang N.K., Arlet G., Courvalin P (2002),“Distribution of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Enterobacteriaceae in Vietnam” Antimicrob Agents Chemother, vol.46, no.12, pp: 3739-3743 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 59 23 Datta, N., and P Kontomichalou (1965), “Penicillinase synthesis controlled by infectious R factors in Enterobacteriaceae”, Nature, vol.208, pp: 239-241 24 Enno S., Dietrich M (2003), “Extended-spectrum β-lactamases: implications for the clinical microbiology laboratory, therapy, and infection control”, Journal of infection, vol.47, no.4, pp 273-295 25 Faustine N., Roland J., Stig H., Willy U., Nina L (2005), “Extended spectrum β-lactamases among Gram-negative bacteria of nosocomial origin from an Intensive Care Unit of a tertiary health facility in Tanznia”, BMC Infectious Diseases, vol.5, no.85 26 Hawkey, P.M (2008), “Prevalence and clonality of extended-spectrum beta-lactamases in Asia”, Clin Microbiol Infec, vol.14, no.5, pp: 21-24 27 Heritage, J., F H M'Zali, D Gascoyne-Binzi, and P M Hawkey (1999), “Evolution and spread of SHV extended-spectrum beta-lactamases in gram-negative bacteria”, J Antimicrob Chemother, vol.44, pp: 309-318 28 Maysaa E S Z (2007), “Extended spectrum β- lactamase among Gramnegative bacteria from an Egyptian pediatric hospital: a two-year experience”, J Infection Developing Countries, vol.1, no.3, pp 269-274 29 Nashwan A.N., Birgitta D.A., Aldert B (2006), “A CTX-M extendedspectrum β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia”, Journal of Medical Microbiology, vol.55, no.11, pp 1607-1608 30 Jones S.L., Nguyen V.K., Nguyen T.M., Athan E (2006), “Prevalence of multiresistant Gram-negative organisms in a surgical hospital in Ho Chi Minh City, Vietnam”, Trop Med Int Health, vol.11, no.11, pp: 1725-1730 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 60 31 Supriya S T., Suresh V J., Sarfraz A., Umesh H (2004), “Evaluation of extended spectrum beta lactamase in urinary isolates”, Indian J Med Res, vol 120, pp 553-556 32 Stephen P.H., Samuel K.B., Daryl J.H et all (2009), “Emergence of high levels of extended-spectrum beta-lactamase-producing Gram-negative bacilli in the Asia-Pacific region: Data from the study for monitoring antimicrobial resistance trends (SMART) program, 2007”, Antimicrobial agents and chemotherapy, vol.53, no.8, pp 3280-3284 33 Tzouvelekis, L S., and R A Bonomo (1999), “SHV-type betalactamases”, Curr Pharm Des, vol.5, pp 847-864 34 Zohresh A., Mohtaram S K., Minoosh A (2008), “Bacteriuria by Extended- spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumonia isolates in a governmental hospital in south of Tehran, Iran”, Iranian Journal of Kidney Diseases, vol.2, no.4, pp 197-200 35 Barthélémy M., Péduzzi J., Labia R (1985), Distinction entre les structures primaires des β-lactamases TEM-1 et TEM-2 Ann Inst Pasteur Microbiol 136A: 311–321 36 Bauernfeind A., Casellas J M., Goldberg M., Holley M., Jungwirth R., Mangold P., Röhnisch T., Schweighart S., Wilhelm R (1992), A new plasmidic cefotaximase from patients infected with Salmonella typhimurium Infection 20:158–163 37 Bedenic B, Zagar Z (1998), Extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae from Zagreb, Croatia J Chemother 10: 449 – 459 38 Bonnet R Sampaio J L M., Labia R., Champs C D., Sirot D., Chanel C., Sirot J (2000), A novel CTX-M β-lactamase (CTX-M-8) in cefotaxime-resistant Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 61 Enterobacteriaceae isolated in Brazil Antimicrob Agents Chemother 44:1936– 1942 39 Bradford P A., Yang Y., Sahm D., Grope I., Gardovska D., Storch G CTX-M-5 (1998), a novel cefotaxime-hydrolyzing β-lactamase from an outbreak of Salmonella typhimurium in Latvia Antimicrob Agents Chemother 42: 1980–1894 40 Bush K., Jacoby G A., Medeiros A A (1995), A functional classification scheme for β-lactamases and its correlation with molecular structure Antimicrob Agents Chemother 39: 1211 – 1233 41 Doucet-Populaire F., Ghnassia J C., Bonnet R., Sirot J (2000), First isolation of a CTX-M-3-producing Enterobacter cloacae in France Antimicrob Agents Chemother 44 : 3239 – 3240 42 Danel F., Hall L M C., Duke B., Gur D., Livermore D M (1999), OXA17, a further extended-spectrum variant of OXA-10 β-lactamase, isolated from Pseudomonas aeruginosa Antimicrob Agents Chemother 43 : 1362 –1366 43 Clinical and Laboratory Standard Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, Twenty-first informational supplement CLSI document M100-S21 (ISBN 1-56238-742-1) Clinical and Laboratory Standard Institute 940 West Valley Road Suite 1400 Wayne Pennsylvania 19087 USA 2011 44 Gazouli M., Sidorenko S V., Tzelepi E., Kozlova N S., Gladin D P., Tzouvelekis L S (1998), A plasmid-mediated β-lactamase conferring resistance to cefotaxime in a Salmonella typhimurium clone found in St Petersburg, Russia J Antimicrob Chemother 41: 119 – 121 45 Gazouli M., Tzelepi E., Markogiannakis A., Legakis N J., Tzouvelekis L S (1998), Two novel plasmid-mediated cefotaxime-hydrolyzing β-lactamases Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 62 (CTX-M-5 and CTX-M-6) from Salmonella typhimurium FEMS Microbiol Lett 165 : 289 – 293 46 Jemima SA., Verghese S (2008), Multiplex PCR for blaCTX-M and blaSHV in the extended spectrum beta lactamase (ESBL) producing Gram-negative isolates Indian J Med Res 128: 313-317 47 Cao V., Lambert T., Nhu DQ (2002), et al Distribution of extendedspectrum β-lactamases in clinical isolates of Enterobacteriaceae in Vietnam Antimicrobial agents and chemotherary 46(12): 3739-3743 48 Gniadkowski M., Schneider I., Palucha A., Jungwirth R., Mikiewicz B., Bauernfeind A (1998), Cefotaxime-resistant Enterobacteriaceae isolates from a hospital in Warsaw, Poland: Identification of a new CTX-M-3 cefotaximehydrolyzing β-lactamase that is closely related to the CTX-M-1/MEN-1 enzyme Antimicrob Agents Chemother 42:827–832 49 Hall L M C., Livermore D M., Gur D., Akova M., Akalin H E (1993), OXA-11, an extended-spectrum variant of OXA-10 (PSE-2) β-lactamase from Pseudomonas aeruginosa Antimicrob Agents Chemother 37:1637–1644 50 Huletsky A., Knox J R., Levesque R C (1993), Role of Ser-238 and Lys240 in the hydrolysis of 3rd-generation cephalosporins by SHV-type betalactamases probed by site-directed mutagenesis and 3-dimensional modeling J Biol Chem 268:3690–3697 51 Ishii Y., Ohno A., Taguchi H., Imajo S., Ishiguro M., Matsuzawa H (1995), Cloning and sequence of the gene encoding a cefotaxime-hydrolyzing class A β-lactamase isolated from Escherichia coli Antimicrob Agents Chemother 39: 2269–2275 52 Jacoby G A., Sutton L (1991), Properties of plasmids responsible for production of extended-spectrum β-lactamases Antimicrob Agents Chemother 35:164 –169 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 63 53 Livermore D M (1995), β-Lactamases in laboratory and clinical resistance Clin Microbiol Rev 8:557–584 54 Mugnier P., Podglajen I., Goldstein F W., Collatz E (1998), Carbapenems as inhibitors of OXA-13, a novel integron-encoded β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa Microbiology 144 : 1021 – 1031 55 Philippon L N., Naas T., Bouthors A-T., Barakett V., Nordmann P (1997), OXA-18, a class D clavulanic acid-inhibited extended-spectrum βlactamase from Pseudomonas aeruginosa Antimicrob Agents Chemother 41:2188–2195 56 Bonner R (2004), Growing group of extended-spectrum β-lactamase: the CTX-M enzymes Antimicrob Agents Chemother 48:1-14 57 Ma L., Ishii Y., Ishiguro M., Matsuzawa H., Yamaguchi K (1998), Cloning and sequencing of the gene encoding Toho-2, a class A β-lactamase preferentially inhibited by tazobactam Antimicrob Agents Chemother 42 : 1181 –1186 58 Pitout JD., Wei Y., Church DL., Gregson DB (2008), Surveillance for plasmid-mediated quinolone resistance determinants in Enterobacteriaceae within the Calgary Health Region, Canada: the emergence of aac(6’)-Ib-cr J Antimicrob Chemother 61: 999-1002 59 Sougakoff W., Goussard S., Courvalin P (1988), The TEM-3 βlactamase, which hydrolyzes broad-spectrum cephalosporins, is derived from the TEM-2 penicillinase by two amino acid substitutions FEMS Microbiol Lett 56 : 343–348 60 Paterson DL., Bonomo RA (2005), Extended-spectrum beta-lactamase: a clinicl update Clin Microbiol Rev 18: 657-686 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 64 61 Sabaté M., Tarragó R., Navarro F., Miró E., Vergés C., Barbé J., Prats G (2000), Cloning and sequence of the gene encoding a novel cefotaximehydrolyzing β-lactamase (CTX-M-9) from Escherichia coli in Spain Antimicrob Agents Chemother 44:1970–1973 62 Canton R., Novais A., Valverde A., Machado E., Peixe L., Baquero F et all (2008), Prevalence and spread of extended-spectrum beta-lactamaseproducing Enterobacteriaceae in Europe Clin Microbiol Infect 14(1): 144-153 63 Tzouvelekis L S., Bonomo R A (1999), SHV-type β-lactamases Curr Pharm Des : 847 – 864 64 Abouddihaj B., Fatima EO., Mustapha T., Fatna B., Fatima H., Khalid Z et all (2011), Characterization of extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates from the community in Morocco Journal of Medical Microbiology 60: 1344-1352 65 Tzouvelekis L S., Gazouli M., Markogiannakis A., Paraskaki E., Legakis N J., Tzelepi E (1998), Emergence of resistance to third-generation cephalosporins amongst Salmonella typhimurium isolates in Greece: report of the first three cases J Antimicrob Chemother 42 : 273 – 275 66 Jacob S., Shiri NV., Inna C., Orly HM., Azita L., Howard SG et al (2005), Extended-spectrum beta-lactamases among Enterobacter isolates obtained in Tel Aviv, Israel Antimicrobial agents and chemotherapy 49(3): 1150-1156 67 Adrada K.R., Katia R.S., Sandra H.F., Ulysses F., Isabel C., Scaletsky A (2007), Single Multiplex assay to indentifi simultaneously enteropathogenic, enteroaggregative, entrotoxigenic, entroinvasive and Shiga toxin – producing Escherichia coli strains in Brazilian children, FEMS Micro Lett, Vol.267l, No.2, pp.145-150 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 65 68 Bii C.C., Taguchi H., Ouko T.T., Muita W., Wamae N., Kamiya S (2005), Detection of virulencerelated gene by Multiplex PCR in Multidrugresistant diarrhoeagenic Escherichia coli isolates from Kenya and Japan, Epidemiol Infect, Vol.133, No.4, pp.627-633 69 http://www.cdc.gov/HAI/settings/lab/lab_esbl.html 70 http://www.hopkinsmedicine.org/heic/ID/esbl/ 71 http://www.uptodate.com/contents/extended-spectrum-beta-lactamases 72.http://www.bioquell.com/technology/microbiology/extended-spectrumbeta-lactamase-producing-gram-negative-bacteria/ 73 http://www.medscape.com/viewarticle/414417_5 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ... β -lactamase phổ rộng thực bệnh vi? ??n Đó lý chúng tơi chọn tên đề tài “ Sàng lọc vi khuẩn sinh beta – lactamase phổ rộng phân lập bệnh vi? ??n Đa khoa trung ƣơng Thái Nguyên kỹ thuật multiplex - PCR? ?? MỤC... 04/2013 - Vi khuẩn gây bệnh từ mẫu bệnh phẩm định danh Khoa Vi sinhBệnh vi? ??n Đa khoa Trung ương Thái Nguyên Phòng xét nghiệm Vi sinhSinh học phân tử, Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên. .. 2.1.1 Các chủng vi khuẩn Đối tượng nghiên cứu chủng vi khuẩn Gram âm gây bệnh thường gặp phân lập từ loại bệnh phẩm lâm sàng Khoa Vi sinh - Bệnh vi? ??n Đa khoa Trung ương Thái Nguyên từ tháng 4/2012