Sàng lọc vi khuẩn sinh Beta Lactamase phổ rộng phân lập tại Bệnh viện đa khoa trung ương Thái Nguyên bằng kỹ thuật Multiplex PCR

DANH MỤC HÌNH 1.1 Phương pháp đĩa đôi xác định vi khuẩn sinh ESBL 17 2 Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu 27 3.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae 3

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ KHÁNH LY

SÀNG LỌC VI KHUẨN SINH BETA – LACTAMASE PHỔ RỘNG PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN BẰNG KỸ THUẬT

MULTIPLEX – PCR

Chuyên ngành: Công nghệ sinh

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Đắc Trung

Thái Nguyên, năm 2013

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Tiến sĩ Nguyễn Đắc Trung – Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên,

đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các bác sĩ, kỹ thuật viên khoa Vi sinh – Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên, tới các cán bộ nhân viên của Bộ môn Vi sinh – Đại học Y – Dược Thái Nguyên đã hết sức tạo điều kiện giúp đỡ, cho tôi trong quá trình làm luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáo, cán bộ giảng dạy của Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

đã tận tình giảng dạy trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Nguyên, nơi tôi đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2013

DANH MỤC BẢNG

2.1 Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm 21

2.4 Trình tự các cặp mồi được thiết kế để khuếch đại gen 29

2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi gene blaTEM 30 2.7 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi gene blaCTX-M 31 2.8 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi gene blaSHV 31

3.1 Cơ cấu các loại vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập được 34 3.2 Tỷ lệ đề kháng kháng kháng sinh của E coli (43 chủng) 35 3.3 Tỷ lệ đề kháng kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae 37 3.4 Kiểu cách kháng kháng sinh của E coli và K pneumoniae 39

3.6 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E coli ESBL 42

3.7 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K pneumoniae

3.8 Kiểu gene ESBL bla được tìm thấy ở các chủng vi khuẩn 52

DANH MỤC HÌNH

1.1 Phương pháp đĩa đôi xác định vi khuẩn sinh ESBL 17

2 Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu 27

3.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae 37 3.3 Kiểu cách kháng kháng sinh của E coli và K Pneumoniae 39 3.4 Kết quả Double-disk test ở chủng vi khuẩn ESBL(+) 41 3.5 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E coli ESBL(+) 42

3.6 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K pneumoniae

3.7 Kết quả khuếch đại gene blaTEM bằng PCR đơn gene 46 3.8 Kết quả khuếch đại gene blaCTX-M bằng PCR đơn gene 47 3.9 Kết quả khuếch đại gene blaSHV bằng PCR đơn gene 49 3.10 Kết quả khuếch đại gene blaTEM và blaCTX-M bằng multiplex-

PCR

51

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kháng sinh và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Phân loại phổ tác dụng và chống chỉ định của thuốc kháng sinh 3

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 6

1.1.4 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn 7

1.2 Enzyme β – lactamase hoạt phổ rộng 9

1.2.1 Lịch sử phát hiện enzyme β- lactamase hoạt phổ rộng 9

1.2.2 Định nghĩa ESBL 10

1.3 Tình hình nghiên cứu khả năng sinh ESBL ở vi khuẩn gây bệnh 10

1.3.1 Trên thế giới 10

1.3.2 Tại Việt Nam 12

1.4 Các gen mã hóa ESBL 13

1.4.1 TEM 13

1.4.2 SHV 13

1.4.3 CTX – M 14

1.4.4 OXA 15

1.5 Một số phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 16

1.5.1 Phương pháp đĩa đôi 17

1.5.2 Phương pháp đĩa kết hợp (Double disk test) 17

1.5.3 Phương pháp E-test 18

1.5.4 Vitek ESBL card 18

1.5.5 Hệ thống tự động BD Phoenix (Becton Dickinson Biosciences) 18

1.5.6 Các phương pháp sinh học phân tử 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21

2.1.1 Các chủng vi khuẩn 21

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 21

2.1.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn 23

2.1.4 Vật liệu và môi trường xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với 23

2.2 Địa điểm nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Gram âm 23

2.3.2 Kỹ thuật xác định độ nhạy cảm với kháng sinh 24

2.3.3 Kỹ thuật xác định vi khuẩn sinh ESBL 25

2.3.4 Sàng lọc vi khuẩn Gram âm sinh ESBL bằng kỹ thuật multiplex-PCR 26

2.4 Xử lý số liệu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tỷ lệ và kiểu cách kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập được 34

3.2 Tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL………… ……….………… 40

3.3 Tỷ lệ và mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm (E coli và Klebsiella pneumoniae) sinh ESBL phân lập được 42

3.3 Khuếch đại gene ESBL ở E coli và Klebsiella pneumoniae 45

3.3.1 Kết quả khuếch đại gene ESBL bằng kỹ thuật PCR 45

3.3.1.1 Gene blaTEM 46

3.3.1.2 Gene blaCTX-M 47

3.3.1.3 Gene blaSHV 483.3.2 Kết quả khuếch đại gene ESBL bằng kỹ thuật multiplex – PCR 50

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ

KẾT LUẬN 54 KHUYẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

K pneumoniae Klebsiella pneumoniae

Taq – DNA polymerase Themus aquaticus DNA polymerase

Bla β- lactamase

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc phát minh ra kháng sinh năm 1928 đã làm tăng hiệu quả xử lý các ổ nhiễm trùng Nhờ đó nhiều căn bệnh được giải quyết dựa vào việc điều trị bằng những phác đồ kháng sinh Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong nhiều thập kỷ qua dẫn đến xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh Nhiều bệnh dịch nhiễm trùng kháng thuốc đang nổi lên và kháng sinh dần mất hiệu lực trong điều trị Đây là mối lo chung của ngành y tế và của toàn xã hội Việc giới thiệu các kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ ba vào thực hành điều trị lâm sàng các nhiễm khuẩn trong đầu những năm 1980 đã được dự báo như là một bước đột phá trong cuộc chiến chống lại các vi khuẩn gây bệnh sinh β-lactamase ESBL là các β-lactamase có khả năng tác động lên các phân tử penicillin và các cephalosporin thế hệ 1, thế hệ 2, thế hệ 3 và các aztreonam (trừ kháng sinh cefamycin và carbapenem) do chúng có khả năng ly giải các kháng sinh này nhưng chúng lại bị ức chế bởi các các chất ức chế β-lactamase như acid clavulanic [1, 18] Nhiều gene mã hóa ESBL nằm trên các phân tử plasmid lớn Các plasmid đã kháng thuốc này đều được tìm thấy ở các vi khuẩn họ

Entobacteriaceae, trong đó hay gặp nhất là E coli và Klebsiella spp [2, 3, 4, 17,

20, 21, 23] Nhiễm trùng do các chủng vi khuẩn sinh β-lactamase phổ rộng dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ thất bại trong điều trị bằng kháng sinh, trong đó làm tăng cao tỷ lệ tử vong đặc biệt ở những trường hợp nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn sinh ESBL Khi các chủng vi khuẩn sinh ESBL cũng đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều loại kháng sinh, đặc biệt là các kháng sinh nhóm cephalosporin Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên là bệnh viện hạng I trực thuộc Bộ Y tế, được thành lập từ năm 1951, có nhiệm vụ khám chữa bệnh cho nhân dân các dân tộc miền núi vùng Đông bắc Việt Nam Bệnh viện đóng trên địa bàn trung tâm của tỉnh Thái Nguyên có trách nhiệm phục vụ trực tiếp

cho người dân của tỉnh Lưu lượng bệnh nhân đến khám và điều trị tại bệnh viện ngày một tăng Nhiều nghiên cứu về cơ cấu vi khuẩn và mức độ kháng kháng sinh của các vi khuẩn phân lập tại bệnh viện cũng đã được thực hiện và công bố trên các tạp chí trong nước Tuy nhiên, vẫn chưa có một nghiên cứu nào điều tra

về vi khuẩn sinh β-lactamase phổ rộng được thực hiện tại bệnh viện Đó là lý do

chúng tôi chọn tên đề tài “ Sàng lọc vi khuẩn sinh beta – lactamase phổ rộng phân lập tại bệnh viện Đa khoa trung ƣơng Thái Nguyên bằng kỹ thuật multiplex - PCR”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định tỷ lệ và kiểu cách kháng kháng sinh của một số vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập tại BVĐKTƯ Thái Nguyên

Xác định tỷ lệ và mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm sinh ESBL phân lập tại BVĐKTƯ Thái Nguyên

Phát hiện một số gene ESBL ở các chủng vi khuẩn phân lập bằng kỹ thuật multiplex - PCR

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Thu thập bệnh phẩm từ các mẫu bệnh hô hấp, sinh dục và các bệnh phẩm khác

Nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn

Thực hiện kỹ thuật kháng sinh đồ xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁNG SINH VÀ CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN

1.1.1 Định nghĩa

Kháng sinh là chất được chiết xuất từ vi sinh vật hoặc được tổng hợp hóa học, với liều rất nhỏ có tác dụng ức chế hoặc giết chết vi sinh vật, có thể dùng tại chỗ hoặc toàn thân, ít độc hoặc không độc cho cơ thể

1.1.2 Phân loại

Có nhiều cách phân loại kháng sinh: phân loại theo nguồn gốc, phân loại theo phổ tác dụng hoặc phân loại theo cấu trúc hóa học Trong đó phân loại theo cấu trúc hóa học được coi là khoa học nhất vì nó cho phép lựa chọn kháng sinh cùng nhóm thay thế hoặc phối hợp kháng sinh sao cho hiệu quả và hợp lý [3] Theo đó kháng sinh được phân vào 8 nhóm chính như sau:

+ Penicillin M (tổng hợp): Bao gồm các methycillin, oxacillin, nafcillin,…

có phổ hẹp tác dụng lên các tụ cầu, đặc biệt với các tụ cầu kháng với penicillin

G và V

+ Monobactam: Bao gồm các aztreonam… tác dụng mạnh lên các vi khuẩn Gram âm

+ Carbapenem: đại diện là imipenem có tác dụng lên nhiều loại vi khuẩn đặc biệt là các vi khuẩn Gram âm

+ Acid Clavulanic, sulbactam: các chất này có khả năng ức chế enzyme của

vi khuẩn dùng kết hợp làm tăng hiệu lực của kháng sinh

+ Carboxypenicillin: Bao gồm các carbenicillin, ticarcillin

+ Ureidopenicillin: Bao gồm các mezlocillin, piperracillin… có hiệu lực diệt khuẩn lên vi khuẩn mủ xanh và một số vi khuẩn Gram âm

+ Thế hệ 4: Bao gồm các cefepim, cefpirom, phổ tác dụng giống như thế hệ

3 nhưng thời gian xuyên thấm qua vách tế bào nhanh hơn

* Nhóm Aminosid

- Những loại kháng sinh ban đầu là streptomycin, neomycin

- Thế hệ mới hơn là gentamycin, amikacin, netilmicin

Hai nhóm này có tác dụng diệt khuẩn mạnh Tuy nhiên, dùng loại kháng sinh này liều cao và kéo dài dễ gây ảnh hưởng tới thận, thính giác, tiền đình

Gồm có lincomycin, clindamycin, tác dụng chủ yếu lên các vi khuẩn Gram

dương Dùng kéo dài có thể gây viêm đại tràng chảy máu có màng giả

* Nhóm Macrolide

Những kháng sinh ban đầu là erythromycin, thế hệ sao có phổ rộng hơn Các kháng sinh như: roxithromycin, clarithromycin, đặc biệt có azithromycin tác dụng mạnh, khả năng thấm và tạo nồng độ kháng sinh cao có tác dụng tốt trên các loại vi khuẩn như: chlamydia, mycoplasma…

* Nhóm Cycline

Thế hệ đầu là tetracycline, thế hệ sau là doxycicline, minocyline có tác dụng

ức chế nên nhiều loại vi khuẩn khác nhau Nhóm này khi sử dụng dễ gây tổn thương men răng, tổn thương tới chức năng gan và màng xương

* Nhóm kháng sinh chống nấm

Kháng sinh đầu tiên tìm ra là nystatin có tác dụng chống nấm tại chỗ và không ngấm qua niêm mạc ruột Các kháng sinh mới là ketoconazole, fluconazole…có phổ rộng, hấp thu tốt , có thể dùng tại chỗ hoặc toàn thân

* Các nhóm khác

- Các quinolon: Thế hệ I là các nalidixic acid… có tác dụng hạn chế, độc

tính cao Thế hệ II như ciprofloxacin, ofloxacin… tác dụng trên nhiều loại vi

khuẩn Các quinolon thế hệ mới nhất mở rộng phổ kháng khuẩn

- Các Nitroimidazol: metronidazol, tinidazol, secnidazol…Phổ tác dụng

khá rộng Độc tính gây ra là buồn nôn, hạ huyết áp, gây viêm thần kinh

- Các Sulfamid: Phổ kháng khuẩn của sulfamid rộng nhưng tỷ lệ kháng

thuốc và kháng chéo giữa các loại sulfamid khá cao nên thường ít sử dụng

- Các Glycopeptide: Gồm các loại như vancomycin, teicoplanin… có hiệu

lực diệt khuẩn mạnh lên các cầu khuẩn Gram dương Vancomycin được coi như

là kháng sinh dự trữ điều trị tụ cầu kháng thuốc [1]

- Các polypeptide :Đại diện là polymycin có hiệu lực diệt khuẩn trên nhiều

loại vi khuẩn nhưng độc tính cao nên hiện nay ít dùng

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Kháng sinh có thể tác dụng lên vi khuẩn bằng nhiều cơ chế hoặc bằng một trong các cơ chế dưới đây:

a Ức chế tổng hợp vách tế bào

Vách tế bào ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương đều được cấu tạo bởi các phức hợp Peptidoglycan Các phức hợp Peptidoglycan được trùng hợp bởi các enzyme transpeptidase Các kháng sinh thuộc nhóm β - lactamin gắn chọn lọc vào các transpeptidase này làm cho vách tế bào của vi khuẩn không được tổng hợp hoặc bị tan rã Khi vách tế bào bị tổn thương và mất đi sẽ làm cho tế bào chết Nhóm kháng sinh tác động theo cơ chế này có hiệu quả mạnh Các kháng sinh thuộc nhóm này như: penicillin, bacitracin, vancomycin [1]…

b Ức chế chức năng của màng tế bào

Các kháng sinh loại này sẽ gắn lên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm chọn lọc của màng bào tương, làm mất chức năng của màng, thất thoát nội chất Tế bào vi khuẩn khi mất đi các chất cần thiết sẽ bị chết Các kháng sinh thuộc nhóm này gồm polymycin, gentamycin, amphotericin…

c Ức chế tổng hợp protein

Thuộc cơ chế này lại được chia làm hai loại chính: làm ngừng quá trình tổng hợp protein hoặc tạo nên những loại protein bất thường, vô dụng

* Làm ngừng quá trình tổng hợp protein: Các kháng sinh thuộc loại này

gắn vào tiểu phần 50S của Ribosom vi khuẩn, ngăn cản giải phóng các acid amin ra khỏi tARN, làm ngừng quá trình tổng hợp protein Kháng sinh có cơ chế này thuộc nhóm phenicol như chloramphenicol…

* Tổng hợp nên các protein bất thường: Các kháng sinh này gắn vào các

tiểu phần 30S của Ribosom vi khuẩn dẫn đến rối loạn sự đọc mã mRNA, do đó gắn sai vị trí axit amin tạo nên protein bất thường Các kháng sinh thuộc nhóm này như streptomycin, tetracycline…

d Ức chế tổng hợp acid nucleic

Nhóm Rifamycin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao

mã tạo mRNA Kháng sinh thuộc nhóm này như rifampicin…Nhóm quinolon ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm quá trình tổng hợp DNA bị ngừng Kháng sinh thuộc nhóm này như ciprofloxacin, ofloxacin…Nhóm sulfamide có tác dụng cạnh tranh đối kháng Các sulfamide có cấu trúc hóa học tương tự PABA- Para - aminobenzoic acid nên cạnh tranh thay thế PABA dẫn đến ngừng tổng hợp Acid nucleic của vi khuẩn Nhóm trimethoprim tác động vào các enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân Purin làm ức chế quá tình tạo Acid nucleic Các kháng sinh có cơ chế tác động này như: proloprim, monotrim và

triprim

1.1.4 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn

Nhân tố kháng thuốc, được gọi là nhân tố R, sẽ tạo cho vi khuẩn kháng lại các kháng sinh bằng các cách sau:

a Tạo ra các enzyme làm biến đổi hoặc phá hủy phân tử kháng sinh

Một số vi khuẩn sản xuất ra β-lactamase, enzyme này sẽ mở vòng β- lactam làm mất hoạt tính của các kháng sinh thuộc nhóm β-lactamin

Ngoài khả năng sinh β- lactamase thì một số vi khuẩn Gram âm có thể sản xuất được các enzyme khác như adenylate cyclase, phosphorylase… phá hủy các aminoglycoside hoặc chloramphenicol acetyltranferase kháng lại các kháng sinh thuộc nhóm chloramphenicol

b Làm giảm tính thấm của màng tế bào

Theo cơ chế này vi khuẩn có thể làm giảm nồng độ kháng sinh bên trong tế bào bằng các con đường sau:

- Làm giảm tính thấm của màng tế bào với các chất kháng sinh này, bảo vệ

tế bào vi khuẩn tránh khỏi sự tác động xấu bởi chất kháng sinh

- Nhờ hệ thống bơm chủ động: các chất kháng sinh trong tế bào bị giảm nồng độ do bị tế bào đưa ngược ra ngoài môi trường Ví dụ sự đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh thuộc nhóm tetracycline, quinolon…

- Làm mất hệ thống vận chuyển qua màng do đó làm cho kháng sinh không xâm nhập được vào tế bào vi khuẩn như các kháng sinh thuộc nhóm oxacillin

c Làm thay đổi vị trí tác động của kháng sinh làm kháng sinh không gắn đƣợc vào đích

Là hiện tượng vi khuẩn thay đổi cấu trúc của một thành phần nào đó làm cho các kháng sinh mất tác dụng Các vi khuẩn làm mất hay thay đổi protein đặc hiệu trên phần 30S hoặc thay đổi các thụ thể trên phần 50S của Ribosom làm thay đổi vị trí bám của kháng sinh loại erythromycin

d Vi khuẩn thay đổi con đường chuyển hóa làm cho thuốc kháng sinh không tác động được vào quá trình chuyển hóa của vi khuẩn:

Một số vi khuẩn kháng với các sulfonamid không cần sử dụng tới aminobenzoic acid (PABA) mà chúng sử dụng luôn acid folic có sẵn trong môi trường, do vậy các kháng sinh thuộc nhóm này bị vô hiệu lực

para-e Vi khuẩn tăng tổng hợp enzyme chuyển hóa để bù vào lượng enzyme

* Vi khuẩn đa đề kháng: hầu như chưa có định nghĩa rõ ràng nào về vi

khuẩn đa đề kháng tuy nhiên phần lớn xác định vi khuẩn đa đề kháng là loại vi

khuẩn kháng với ba hay nhiều hơn ba loại kháng sinh [20]

Phương pháp chủ yếu để xác định vi khuẩn có đa đề kháng hay không là căn

cứ vào kết quả thử nghiệm tính nhạy cảm của vi khuẩn đó với các loại kháng sinh thử nghiệm trong phòng thí nghiệm Vi khuẩn xếp vào loại đa đề kháng nếu như kết quả thử nghiệm cho thấy nó kháng ba hay trên ba loại kháng sinh trở lên

1.2 ENZYME β – LACTAMASE HOẠT PHỔ RỘNG

1.2.1 Lịch sử phát hiện enzyme β- lactamase hoạt phổ rộng

Năm 1963 người ta đã phân lập được enzyme này từ một chủng E coli kháng với ampicillin từ máu của môt bệnh nhân có tên là Temoniera Chủng E coli này kháng với kháng sinh do có sinh β- lactamase Sau đó enzyme này được

đặt tên là TEM-1 theo tên bệnh nhân Enzyme này thường gặp hơn ở các vi

khuẩn Gram âm Có tới trên 90% các chủng E coli kháng kháng sinh Ampicillin

là do sinh loại enzyme này [21]

Năm 1974, phát hiện ra một β- lactamase loại khác ở K pneumonia và E coli đặt tên là SHV-1, có nguồn gốc từ TEM-1 do 1 axit amin bị thay thế Các

enzyme này kháng cao với các kháng sinh penicillin và cephalosporin thế hệ 1[21]

Năm 1983 tại Đức người ta phát hiện ra thêm một loại enzyme khác là kết quả của sự đột biến các axit amin ở các vị trí khác nhau từ các loại cũ do vậy chúng tăng phổ tác dụng của enzyme Chúng không phân hủy cephamycin và carbapenem nhưng bị ức chế bởi acid clavulanic

Đặc biệt các chủng sinh ESBL thường là các chủng đa đề kháng do gen mã hóa các ESBL thì cũng có những gen kháng các loại kháng sinh khác như tetracycline, aminoside,… do vậy việc điều trị càng thêm khó khăn Hiện nay loại kháng sinh chủ yếu dùng để điều trị là nhóm carbapernem

gia khác nhau cho thấy sự phân bố rộng rãi của các vi khuẩn sinh ESBL Các loại ESBL bao gồm các nhóm: SHV, TEM, CTX-M và Toho β-lactamases, OXA, PER, VEB-1, BES-1 và các ESBL khác Nhiều gene mã hóa ESBL nằm trên các phân tử plasmid lớn Các plasmid đã kháng thuốc này đều được tìm

thấy ở các vi khuẩn họ Entobacteriaceae, trong đó hay gặp nhất là E coli và Klebsiella spp [18, 19, 21, 23, 27, 28, 33]

Để xác định sự tồn tại và mô tả đặc điểm của các β - lactamase ở các vi khuẩn Gram âm phân lập tại một Bệnh viện nhi đồng ở Ai Cập, Maysaa đã thu thập các mẫu máu từ những bệnh nhi nghi ngờ bị nhiễm khuẩn bệnh viện từ tháng 1/2005 - tháng 12/2006 Trong số 1.600 bệnh nhi nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết có 816 trường hợp (45%) nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gram âm; phổ

biến nhất là Klebsiella (38,2%), tiếp theo là Enterobacter (32,4%), Serratia (16,2%) và Burkholderia cepacia (10,3%); Tỷ lệ vi khuẩn đề kháng cao nhất là

với cefazolin và ampicillin/sulbactam (75,5%), kháng với cefuroxime là 70,3%

và với cetriaxone là 63,5% ESBL được tìm thấy ở 44,5% các chủng kháng cefotaxime và 50% với các chủng kháng ceftazidime bằng phương pháp khoanh giấy đôi [19] Trong một nghiên cứu được tiến hành năm 2004, các chủng vi khuẩn đề kháng với cefotaxime được phân lập từ những bệnh nhân bị nhiễm khuẩn tiết niệu tại bệnh viện trường cao đẳng y tế Indira Gandhi, Nagpur, Ấn

Độ, đã được kiểm tra khả năng sinh ESBL bằng phương pháp khoanh giấy đôi cộng hưởng Kết quả cho thấy trong số 87 chủng vi khuẩn Gram âm kháng

Cefotaxime có 42 chủng (48,3%) sinh ESBL đó là E coli, K pneumonia và Acinetobacter Sự đa đề kháng được tìm thấy phổ biến ở các vi khuẩn sinh

ESBL (90,5%) cao hơn hẳn các vi khuẩn không sinh ESBL (68,9%), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,05 [31]

Để xác định tần số các chủng E coli và K pneumonia sinh ESBL được phân

lập từ nước tiểu của những bệnh nhân nhiễm khuẩn tiết niệu tại một bệnh viên công ở nam Tehran ( Iran), Zohreh đã kiểm tra độ nhạy cảm với kháng sinh và

khả năng sinh ESBL của 124 chủng E coli và 40 chủng K pneumonia Sự đề kháng có sinh ESBL đã được phát hiện ở 52,5% chủng K pneumonia và 45,2% chủng E coli Kiểu cách đa đề kháng kháng sinh ESBL được tìm thấy ở 30% chủng K pneumonia và 25,8% chủng E coli [29]

Ba mươi chín chủng vi khuẩn Gram âm được phân lập từ 39 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn bệnh viện của một bệnh viện cấp 3 Tazania đã được Faustine

và cộng sự xác định sự nhạy cảm kháng sinh và khả năng sinh ESBL Trong số

các chủng vi khuẩn được phân lập, gồm E coli, Enterobacter spp, Pseudomonas spp, Proteus spp, K pneumonia, C freundii và Chryseomonas luteola thì 28,2%

các chủng này sinh ESBL Các gen ESBL đã được mô tả là SHV-28 và

CTX-M-15 Các chủng vi khuẩn sinh ESBL kháng với gentamicin và ciprofloxacin cao hơn các chủng không sinh ESBL [25]

Các loài vi khuẩn sinh ESBL cũng được tìm thấy tại các nước khu vực châu

Á - Thái Bình Dương Một số nghiên cứu đã cho thấy mức độ kiểu hình cao của

ESBL, đặc biệt là ở Klebsiella, đáng chú ý nhất là ở Trung Quốc, Hàn Quốc,

Nhật Bản và Ấn Độ [26] Trong một nghiên cứu của Stephen và cộng sự về khả

năng sinh ESBL ở vi khuẩn E coli và Klebsiella spp., trong tổng số 3.004 chủng

vi khuẩn Gram âm phân lập từ các nhiễm khuẩn bụng tại khu vực châu Á - Thái

Bình Dương (2007); 42,2% chủng E coli và 35,8% chủng Klebsiella sinh ESBL Tại Ấn Độ, tỷ lệ sinh ESBL lần lượt là 79%, 69,4% và 100% với E coli,

K pneumonia và K oxytoca Trong khi đó 55% chủng E coli ở Trung Quốc và

50,8% vi khuẩn này ở Thái Lan sinh ESBL Kết quả cũng cho thấy Imipenem là loại kháng sinh hiệu quả nhất có khả năng ức chế trên 90% các chủng vi khuẩn

kể cả các vi khuẩn sinh ESBL [32]

1.3.2 Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, một số nghiên cứu về vi khuẩn sinh ESBL cũng đã thực hiện Trong 350 chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm lâm sàng tại 1

bệnh viện ở Thành phố Hồ Chí Minh, kết quả cho thấy: 36,7% các vi khuẩn Gram âm kháng với cephalosporin thế hế thứ 3 Tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL là 14,7% [30] Một nghiên cứu khác tại 7 bệnh viện ở Thành phố Hồ Chí Minh từ

08/2000 đến 08/2001 cũng cho thấy: có 32/730 chủng E coli sinh ESBL, kết quả này ở K pneumonia là 13/438 chủng và ở Proteus mirabilis là 10/141 chủng

[6,7, 8, 22, 30]

1.4 Các gen mã hóa ESBL

1.4.1 TEM

TEM-1 β lactamase thường gặp nhất trong các vi khuẩn Gram âm Lên đến

90% sức đề kháng ampicillin trong E coli là do TEM-1 sản xuất [53] Loại

enzyme này cũng chịu trách nhiệm cho sự đề kháng ampicillin và kháng

penicillin được tìm thấy trong H influenzae, N gonorrhoeae với số lượng ngày

càng tăng TEM-1 có thể thủy phân các penicillin và cephalosporin (cephalothin

và cephaloridine) TEM-2, phát sinh đầu tiên của TEM-1, đã có một sự thay thế acid amin từ β - lactamase ban đầu [35] Điều này gây ra một sự thay đổi trong điểm đẳng điện pI của 5,4 - 5,6, nhưng nó đã không thay đổi bản chất chất nền TEM-3, ban đầu được báo cáo vào năm 1989, là loại TEM-β-lactamase đầu tiên hiển thị kiểu hình ESBL [59] Trong những năm kể từ báo cáo đầu tiên, hơn 90 dẫn xuất TEM bổ sung đã được mô tả (đối với chuỗi axit amin cho TEM, SHV,

và OXA mở rộng phổ kháng thuốc ức chế β - lactamase, http://www.lahey.org / studies / webt.htm ) Có một số β-lactamase kháng thuốc ức chế enzyme, nhưng phần lớn là dẫn xuất mới của các ESBLs

1.4.2 SHV

ampicilin qua trung gian

[63] Trong nhiều chủng K pneumoniae, blaSHV-1 hoặc gen có liên quan được

- Dư lượng serine ở vị trí

238 là rất quan trọng cho quá trình thủy của ceftazidime và dư lượng lysine là rất quan trọng cho quá trình thủy phân của cefotaxim [50]

Salmonella enterica serovar Typhimurium [36, 39, 44, 45, 64]

dịch ( bùng phát, bộc phát) S enterica serovar Typhimurium

1.5 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI KHUẨN SINH ESBL

Phát hiện chủng vi khuẩn sinh ESBL dựa vào sự phát hiện cộng hưởng giữa cephalosporin và clavulanate

1.5.1 Phương pháp đĩa đôi ( Double – dist test )

Phương pháp này còn gọi là phương pháp khuếch tán mặt thạch Cấy vi khuẩn thuần khiết lên mặt thạch rồi đặt các khoanh kháng sinh Ở giữa đĩa thạch

đặt khoanh amoxycillin/clavulanate, các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin

đặt xung quanh khoanh amoxycillin/clavulanate theo một đường thẳng cách

nhau 20mm Đĩa thạch sau đó được để vào tủ ấm 370

C trong 24 giờ Khi có sự

mở rộng vòng vô khuẩn của khoanh kháng sinh cephalosporin về phía tiếp giáp

với khoanh kháng sinh amoxycillin/ clavulanate, chứng tỏ chúng có sự cộng

hưởng hay vi khuẩn đó sinh ESBL Phương pháp này dễ thực hiện, độ nhạy

79-99%, độ đặc hiệu 94-100%

Độ nhạy có thể giảm nếu hoạt tính ESBL thấp Nếu trường hợp nghi ngờ âm

tính giả, có thể làm lại với khoảng cách các khoanh kháng sinh gần nhau hơn

Hình 1.1 Phương pháp đĩa đôi xác định vi khuẩn sinh ESBL [20]

1.5.2 Phương pháp đĩa kết hợp

Dùng một đĩa chỉ chứa khoanh kháng sinh nhóm cephalosporin và một đĩa

chứa phối hợp cả cephalosporin với clavulanate Vi khuẩn sinh ESBL khi có sự

chênh lệch đường kính vòng vô khuẩn của hai đĩa kháng sinh: đĩa có clavulanate

có đường kính vòng vô khuẩn ≥ 5mm so với đĩa tương ứng không có

clavulanate [1]

1.5.3 Phương pháp E-test

Thanh thử 1 đầu có chứa một kháng sinh loại Cephalosporin như

Ceftazidime (TZ) hoặc Cefotaxime một đầu chứa Ceftazidime và Clavuanate

(TZL) hoặc Cefotaxime và Clavulanate (CTL) Khi đầu chứa Clavulanate chỉ MIC giảm ≥ 3 lần so với đầu chứa Cephalosporin chứng tỏ vi khuẩn đó có sinh ESBL Phương pháp này có độ nhạy 87- 100%, độ đặc hiệu 95-100%

Hình 1.2 E-test xác định vi khuẩn sinh ESBL [15]

1.5.4 Vitek ESBL card

Sử dụng cephalosporin 0,5μg/ml và cephalosporin phối hợp clavulanate 4μg/ml Vi khuẩn sinh ESBL khi MIC với cephalosporin 8μg/ml Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này là 90%

1.5.5 Hệ thống tự động BD Phoenix (Becton Dickinson Biosciences)

Có năm giếng, mỗi giếng chứa một loại kháng sinh sau: cefpodoxime, cefazidime, ceftazidime + clavulanate, cefotaxime + clavulanate, ceftriaxone + clavulanate Sau khi ủ với chủng vi khuẩn thử nghiệm được đưa vào máy để theo dõi vi khuẩn mọc Kết quả đọc tự động trên máy

1.5.6 Các phương pháp sinh học phân tử

Để khắc phục nhược điểm của các phương pháp truyền thống như: Cho kết quả chậm, thời gian lâu, độ chính xác chưa cao, không phát hiện được gene cần nghiên cứu…, người ta có thể sử dụng những kỹ thuật chẩn đoán nhanh, với độ

chính xác cao Đó là các phương pháp sinh học phân tử Một số phương pháp sinh học phân tử tiêu biểu thường dùng như:

* Các dạng PCR

a Phương pháp PCR

Khái niệm: PCR (Polymerase Chain Reaction), là phản ứng chuỗi trùng hợp (phản ứng chuỗi polymerase) nhân bội (khuếch đại, nhân bản) số lượng một phân đoạn DNA nào đó trong ống nghiệm để tạo ra một số lượng lớn hơn hàng triệu đến hàng tỷ lần so với số lượng ban đầu nhằm các mục đích khác nhau như: nhân dòng, đọc trình tự, phát hiện sự có mặt (bệnh tật, pháp y, nhân chủng học, phả hệ, an toàn thực phẩm), phân biệt cá thể hoặc quần đàn (di truyền quần đàn, tiến hóa, chọn giống) [10]

PCR là phương pháp đang được áp dụng rộng rãi vì cho kết quả nhanh, chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao Hiện nay, trên thế giới, PCR đang được nghiên cứu và ứng dụng trong chẩn đoán vi khuẩn

- Ưu điểm của PCR: Thao tác trực tiếp trên vật liệu di truyền của vi khuẩn

là DNA để phát hiện gene chịu trách nhiệm cho các yếu tố độc lực của vi khuẩn

Vì vậy, dùng PCR có thể chẩn đoán chính xác các loại vi khuẩn cần tìm

- Nhược điểm: Bình thường trong một phản ứng PCR, người ta dùng một cặp mồi để khuếch đại một đoạn gene đặc hiệu Để chẩn đoán 1 trong 6 chủng vi khuẩn cần ít nhất 6 đến 8 phản ứng PCR riêng rẽ do đó rất tốn kém [11]

Phương pháp Multiplex - PCR

Multiplex PCR là PCR khuếch đại đồng thời nhiều đoạn DNA đích bằng cùng một loại phản ứng Do đó, multiplex PCR có thể sử dụng để phân tích đột biến và nhận dạng mầm bệnh [10] Trong nghiên cứu chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh, multiplex PCR là phương pháp được sử dụng phổ biến [12], [13], [14], [67], [68] Đây được coi là phương pháp tối ưu trong chẩn đoán vi khuẩn gây

bệnh vì nó cho kết quả nhanh, chính xác và có độ đặc hiệu cao, chỉ với một phản ứng có thể xác định được sự có mặt của nhiều tác nhân vi khuẩn gây bệnh

Phương pháp PCR lồng (Nested PCR)

PCR lồng là kỹ thuật thực hiện hai lần PCR kế tiếp nhau Trong đó lần PCR thứ 2 (Nested 2) sử dụng cặp mồi thứ 2 và kết quả khuếch đại các đoạn DNA của lần PCR thứ nhất (Nested 1) làm khuôn, để nhân các đoạn DNA có tính đặc hiệu cao PCR lồng được sử dụng phổ biến trong phân loại phân tử, cho phép khuếch đại cả đoạn DNA đặc trưng cho các đơn vị dưới loài, phân biệt sự khác nhau giữa các giống động vật, các chủng vi sinh vật v v…[11]

Phương pháp PCR – RFLP( RFLP: Rectriction Fragment Length Polymorphisms)

Với phương pháp này, đoạn DNA xác định được nhân bằng phản ứng PCR sau đó nó được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn đặc hiệu (RFLP) Tiếp theo, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose hoặc polyacylamide để phân tích sự

đa hình Dựa trên kết quả phân tích phổ điện di cho phép định loại chính xác

nhiều loại vi khuẩn gây bệnh như: E coli, Actinomadura, Gordona, Rhodoccocus, Tsukamurella [15], [16] Kết quả phân tích của kỹ thuật này khá

chính xác Tuy nhiên, khả năng phân biệt các dòng, các loài khác phụ thuộc vào các loại enzyme cắt giới hạn sử dụng Thông thường, để phân biệt và xác định chính xác dòng cần sử dụng nhiều enzyme cắt giới hạn khác nhau

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Các chủng vi khuẩn

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn Gram âm gây bệnh thường gặp được phân lập từ các loại bệnh phẩm lâm sàng tại Khoa Vi sinh - Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên từ tháng 4/2012 đến tháng 04/2013

- Vi khuẩn gây bệnh từ mẫu bệnh phẩm được định danh tại Khoa Vi sinh- Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên và Phòng xét nghiệm Vi sinh- Sinh học phân tử, Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên

TAE 1X vừa đủ 100%

Bảng 2.2 Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm

6 Máy ủ nhiệt lắc rung Eppendorf, Đức

8 Hệ thống chụp ảnh điện di BioDoc-ItTM, Mỹ

10 Buồng thao tác PCR ESCO, Singapore

14 Máy định danh vi khuẩn

Vitek 2 Compact 60 Biomerieux, Pháp

15 Bình nón, đĩa petri, pipet,

đầu côn các loại, v…v, Trung Quốc, Đức, Việt Nam

2.1.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

Các loại thạch: Thạch dinh dưỡng, thạch máu, thạch Chocolate… các môi trường xác định tính chất sinh hóa của vi khuẩn: KIA, Ure - Indol, Mannit - Di động, Bộ thuốc nhuộm Gram, …

Môi trường MPA (Meat – Peptone – Agar), thành phần:

Độ đục chuẩn McFarland 0,5 để xác định số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn, tương đương với 106 vi khuẩn/ml

2.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Phòng xét nghiệm Vi sinh - Sinh học phân tử, Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.3.1 Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Gram âm

+ Dịch khác: Mủ vết thương, vảy da, nước tiểu…

Kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp: Vi khuẩn bước đầu được nhuộm Gram để sơ bộ

nhận định đặc điểm hình thể và định hướng nuôi cấy phân lập

* Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập, xác định loại vi khuẩn:

Vi khuẩn được nuôi cấy thuần trên các đĩa thạch dinh dưỡng qua đêm sau đó được cấy trên các môi trường đặc biệt để xác định tính chất sinh vật hóa học của

vi khuẩn hoặc định danh bằng hệ thống máy tự động Vitek 2 Compact 60

2.3.2 Kỹ thuật xác định độ nhạy cảm với kháng sinh

Tiến hành theo kỹ thuật kháng sinh đồ phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch (Kỹ thuật Kirby – Bauer) [43] Dùng khoanh giấy có tẩm sẵn kháng sinh ở một nồng độ nhất định đặt vào mặt đĩa thạch đã được cấy vi khuẩn ở một nồng độ 106 tế bào/ ml Để tủ ấm 370C/ 18 - 20 giờ cho vi khuẩn mọc, đọc kết quả sau 24 giờ và đo đường kính vòng vô khuẩn xung quanh khoanh kháng sinh So sánh kết quả đo được với giới hạn chuẩn của kháng sinh tương ứng để xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn đó với kháng sinh được thử

Quy trình kỹ thuật

 Đĩa thạch Mueller Hinton đặt trong tủ ấm 15 phút trước khi cấy vi khuẩn

 Khoanh giấy kháng sinh được lấy ra khỏi tủ lạnh và để ở nhiệt độ phòng

370C qua đêm

 Đọc kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn từ phía sau đĩa thạch bằng thước đo tính bằng mm So sánh kết quả đo được với giới hạn chuẩn của kháng sinh tương ứng, đánh giá kết quả cho từng loại kháng sinh

Kiểm soát chất lượng:

Hai chủng chuẩn quốc tế Escherichia coli ATCC 25922 và Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 được thử nghiệm song song với các chủng vi khuẩn

nghiên cứu nhằm đảm bảo sự chính xác của kết quả So sánh kết quả nhạy cảm của chủng chuẩn với bảng giới hạn chuẩn Nếu phù hợp nghĩa là qui trình thực hiện với các chủng vi khuẩn nghiên cứu là đúng Nếu không phù hợp, qui trình thực hiện chưa đúng hoặc hóa chất sinh phẩm hỏng, không phù hợp, cần phải tiến hành lại

2.3.3 Kỹ thuật xác định vi khuẩn sinh ESBL

Bước 1: Sàng lọc chủng sinh ESBL

- Làm kháng sinh đồ theo kỹ thuật Kirby – Bauer

- Nghi ngờ chủng có sinh ESBL nếu có đường kính vùng ức chế [43]:

+ Cefotaxime ≤ 27mm + Ceftriaxone ≤ 25mm + Ceftazidime ≤ 22mm

Bước 2: Kỹ thuật 2 khoanh giấy (Double- disk test) để xác định sự có mặt của ESBL [6, 43] :

Pha chủng vi khuẩn thành hỗn dịch theo độ đục chuẩn Cấy láng đều vi khuẩn lên mặt đĩa thạch Mueller - Hinton Đặt khoanh giấy amoxycillin - clavulanate (AMC) 20/10 µg vào mặt đĩa thạch tại vị trí trung tâm của đĩa Xung quanh đặt 2 khoanh ceftazidime (CAZ) 30 µg và ceftriaxone (CRO) 30 µg cách khoanh AMC 20mm và trên cùng một đường thẳng Để đĩa môi trường ở nhiệt

thường méo mó hay có hình elip

2.3.4 Sàng lọc vi khuẩn Gram âm sinh ESBL bằng kỹ thuật multiplex-PCR

* Kỹ thuật multiplex - PCR

Phát hiện gene mã hóa ESBL ở các chủng vi khuẩn Gram âm phân lập

được, bao gồm các gene blaTEM, blaCTX-M và blaSHV

Với mục tiêu ứng dụng kỹ thuật multiplex - PCR nhằm phát hiện gene mã hóa ESBL ở các chủng vi khuẩn Gram âm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu theo quy trình sau:

Hình 2 Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu

Tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc

Bệnh phẩm nhiễm trùng

Xử lý theo quy trình

Nhuộm soi, nuôi cấy

Định danh vi khuẩn Gram âm gây bệnh

Kháng sinh đồ

Xác định mức độ nhạy cảm

kháng sinh

Phát hiện vi khuẩn sinh ESBL

PCR đơn mồi phát hiện gene

blaTEM, blaCTX-M, blaSHV

Multiplex-PCR phát hiện gene

blaTEM, blaCTX-M, blaSHV

Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose

Toàn bộ quá trình nghiên cứu được chia làm 5 giai đoạn, với nội dung nghiên cứu và mục tiêu cụ thể sau:

Bảng 2.3 Các giai đoạn trong quá trình nghiên cứu

Giai đoạn

1

Phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh

Lựa chọn chủng vi khuẩn Gram

Giai đoạn

3

Tách DNA tổng số từ vi khuẩn Gram âm

Thu nhận DNA dùng làm khuôn cho các phản ứng PCR và multiplex PCR

Giai đoạn

4

Khuếch đại các gen ESBL của các chủng vi khuẩn bằng phản ứng PCR đơn gene

Kiểm tra sự có mặt của các gen ESBL (blaTEM, blaCTX-M và

Kiểm tra sự có mặt của các gen ESBL (blaTEM, blaCTX-M và

blaSHV) trong cùng một phản ứng

* Phương pháp tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc

Với mục đích thu DNA để làm khuôn cho các phản ứng PCR và multiplex PCR, chúng tôi tiến hành tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc theo phương pháp của