3. Nội dung nghiên cứu
2.1.2.Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm
STT Dung dịch Thành phần, nồng độ 1 Đệm TAE 242g Tris – Base 57,1 ml CH3COOH 100 ml 0,5 EDTA H2O vừa đủ 1000 ml pH = 8,5
2 Dung dịch nhuộm gel 0.1 µg/ml ethidium bromide
3 Loading dye
0,25 % bromophenol blue 40% sucrose
Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm
STT Thiết bị Hãng sản xuất ( nƣớc)
1 Box cấy vô trùng ESCO, Singapore
2 Cân điện tử Sartorious, Đức
3 Lò vi sóng Sharp – Malaysia
4 Nồi khử trùng ướt Tomy, Nhật Bản
5 Máy li tâm lạnh Eppendorf, Đức
6 Máy ủ nhiệt lắc rung Eppendorf, Đức
7 Máy PCR BIORAD, Mỹ
8 Hệ thống chụp ảnh điện di BioDoc-ItTM, Mỹ
9 Thiết bị điện di BIORAD, Mỹ
10 Buồng thao tác PCR ESCO, Singapore
11 Tủ lạnh -200C Frigor, Đan Mạch
12 Tủ lạnh -800C Frigor, Đan Mạch
13 Tủ ấm, tủ sấy Memmert, Đức
14 Máy định danh vi khuẩn
Vitek 2 Compact 60 Biomerieux, Pháp
15 Bình nón, đĩa petri, pipet,
2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy, phân lập vi khuẩn
Các loại thạch: Thạch dinh dưỡng, thạch máu, thạch Chocolate… các môi trường xác định tính chất sinh hóa của vi khuẩn: KIA, Ure - Indol, Mannit - Di động, Bộ thuốc nhuộm Gram, …
Môi trường MPA (Meat – Peptone – Agar), thành phần: - 0,5 % (w/v) NaCl
- 1 % (w/v) peptone - 0,5 % (w/v) cao thịt
Với môi trường đặc bổ sung 1,8 % (w/v) Agar. Chỉnh pH = 7, khử trùng 1210C trong 30 phút.
2.1.4. Vật liệu và môi trƣờng xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh
Môi trường thạch Mueller – Hinton (Oxoid, Anh) pha theo tiêu chuẩn 3,8g agar/ 100ml.
Khoanh giấy kháng sinh của BIORAD bao gồm 10 loại: amoxycillin/ acid clavuanate (AMC), cefuroxime (CXM), ceftriaxone (CRO), cefotaxime (CTX), ceftazidime (CAZ), cefepime (FEP), meropenem (MEM), doxycyline (DO), ciprofloxacin (CIP), ofloxacin (OFX). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Độ đục chuẩn McFarland 0,5 để xác định số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn, tương đương với 106 vi khuẩn/ml.
2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Phòng xét nghiệm Vi sinh - Sinh học phân tử, Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
* Lấy bệnh phẩm
Bệnh phẩm lâm sàng được lấy từ các bệnh nhân tới khám và điều trị tại theo thường quy.
Các bệnh phẩm được xét nghiệm trong vòng 1 giờ đầu sau khi lấy. Các loại bệnh phẩm :
+ Dịch hô hấp: Dịch rửa phế quản, dịch tỵ hầu… + Dịch sinh dục
+ Dịch khác: Mủ vết thương, vảy da, nước tiểu…
Kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp: Vi khuẩn bước đầu được nhuộm Gram để sơ bộ nhận định đặc điểm hình thể và định hướng nuôi cấy phân lập.
* Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập, xác định loại vi khuẩn:
Vi khuẩn được nuôi cấy thuần trên các đĩa thạch dinh dưỡng qua đêm sau đó được cấy trên các môi trường đặc biệt để xác định tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn hoặc định danh bằng hệ thống máy tự động Vitek 2 Compact 60.
2.3.2. Kỹ thuật xác định độ nhạy cảm với kháng sinh
Tiến hành theo kỹ thuật kháng sinh đồ phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch (Kỹ thuật Kirby – Bauer) [43]. Dùng khoanh giấy có tẩm sẵn kháng sinh ở một nồng độ nhất định đặt vào mặt đĩa thạch đã được cấy vi khuẩn ở một nồng độ 106 tế bào/ ml. Để tủ ấm 370C/ 18 - 20 giờ cho vi khuẩn mọc, đọc kết quả sau 24 giờ và đo đường kính vòng vô khuẩn xung quanh khoanh kháng sinh. So sánh kết quả đo được với giới hạn chuẩn của kháng sinh tương ứng để xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn đó với kháng sinh được thử.
Quy trình kỹ thuật
Khoanh giấy kháng sinh được lấy ra khỏi tủ lạnh và để ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi đặt.
Dùng que cấy vô trùng lấy vài khuẩn lạc trên đĩa thạch cấy qua đêm, nghiền vào ống nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều, so sánh với độ đục chuẩn để có được nồng độ vi khuẩn khoảng 106
tế bào/ ml.
Dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào hỗn dịch vi khuẩn, ria đều tăm bông lên mặt đĩa Mueller - Hinton. Chờ se mặt thạch, đặt các khoanh giấy kháng sinh đã lựa chọn phù hợp với từng loại vi khuẩn lên bề mặt thạch. Khoảng cách giữa các khoanh giấy kháng sinh từ 20 – 25mm, cách thành đĩa 15mm. Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng 30 phút cho kháng sinh khuếch tán, sau đó để tủ ấm 370C qua đêm.
Đọc kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn từ phía sau đĩa thạch bằng thước đo tính bằng mm. So sánh kết quả đo được với giới hạn chuẩn của kháng sinh tương ứng, đánh giá kết quả cho từng loại kháng sinh.
Kiểm soát chất lượng:
Hai chủng chuẩn quốc tế Escherichia coli ATCC 25922 và Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 được thử nghiệm song song với các chủng vi khuẩn nghiên cứu nhằm đảm bảo sự chính xác của kết quả. So sánh kết quả nhạy cảm của chủng chuẩn với bảng giới hạn chuẩn. Nếu phù hợp nghĩa là qui trình thực hiện với các chủng vi khuẩn nghiên cứu là đúng. Nếu không phù hợp, qui trình thực hiện chưa đúng hoặc hóa chất sinh phẩm hỏng, không phù hợp, cần phải tiến hành lại.
2.3.3. Kỹ thuật xác định vi khuẩn sinh ESBL
Bước 1: Sàng lọc chủng sinh ESBL
- Làm kháng sinh đồ theo kỹ thuật Kirby – Bauer.
+ Cefotaxime ≤ 27mm + Ceftriaxone ≤ 25mm + Ceftazidime ≤ 22mm
Bước 2: Kỹ thuật 2 khoanh giấy (Double- disk test) để xác định sự có mặt của ESBL [6, 43] :
Pha chủng vi khuẩn thành hỗn dịch theo độ đục chuẩn. Cấy láng đều vi khuẩn lên mặt đĩa thạch Mueller - Hinton. Đặt khoanh giấy amoxycillin - clavulanate (AMC) 20/10 µg vào mặt đĩa thạch tại vị trí trung tâm của đĩa. Xung quanh đặt 2 khoanh ceftazidime (CAZ) 30 µg và ceftriaxone (CRO) 30 µg cách khoanh AMC 20mm và trên cùng một đường thẳng. Để đĩa môi trường ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi để tủ ấm 370
C, sau 24 giờ đọc kết quả.
Đọc kết quả: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ESBL(+) khi ccid clavulanic (Clavulanate) từ khoanh AMC khuếch tán đến vùng thạch gần khoanh giấy CAZ và CRO, ức chế ESBL do vi khuẩn ở vùng thạch này giải phóng ra, kháng sinh ceftazidime (từ khoanh CAZ) và ceftriaxone (từ khoanh CRO) sẽ thoát tác động của ESBL nên đã ức chế vi khuẩn tại vùng thạch này dẫn đến hình thành một vùng vô khuẩn quanh khoanh CRO và CAZ mở rộng về phía khoanh AMC. Vùng vô khuẩn này thường méo mó hay có hình elip.
2.3.4. Sàng lọc vi khuẩn Gram âm sinh ESBL bằng kỹ thuật multiplex-PCR
* Kỹ thuật multiplex - PCR
Phát hiện gene mã hóa ESBL ở các chủng vi khuẩn Gram âm phân lập được, bao gồm các gene blaTEM, blaCTX-M và blaSHV.
Với mục tiêu ứng dụng kỹ thuật multiplex - PCR nhằm phát hiện gene mã hóa ESBL ở các chủng vi khuẩn Gram âm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu theo quy trình sau:
Hình 2. Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu
Tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc Bệnh phẩm nhiễm trùng
Xử lý theo quy trình
Nhuộm soi, nuôi cấy
Định danh vi khuẩn Gram âm gây bệnh
Kháng sinh đồ
Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh
Phát hiện vi khuẩn sinh ESBL
PCR đơn mồi phát hiện gene
blaTEM, blaCTX-M, blaSHV
Multiplex-PCR phát hiện gene
blaTEM, blaCTX-M, blaSHV
Toàn bộ quá trình nghiên cứu được chia làm 5 giai đoạn, với nội dung nghiên cứu và mục tiêu cụ thể sau:
Bảng 2.3. Các giai đoạn trong quá trình nghiên cứu
Giai đoạn Nội dung nghiên cứu Mục tiêu
Giai đoạn 1
Phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh
Lựa chọn chủng vi khuẩn Gram âm gây bệnh
Giai đoạn 2
Kỹ thuật kháng sinh đồ và kỹ thuật Double - disk test
Xác định mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn và phát hiện vi khuẩn sinh ESBL
Giai đoạn 3
Tách DNA tổng số từ vi khuẩn Gram âm
Thu nhận DNA dùng làm khuôn cho các phản ứng PCR và multiplex PCR
Giai đoạn 4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khuếch đại các gen ESBL của các chủng vi khuẩn bằng phản ứng PCR đơn gene
Kiểm tra sự có mặt của các gen ESBL (blaTEM, blaCTX-M và
blaSHV)
Giai đoạn 5
Khuếch đại các gene ESBL của các chủng vi khuẩn bằng phản ứng multiplex PCR
Kiểm tra sự có mặt của các gen ESBL (blaTEM, blaCTX-M và
blaSHV) trong cùng một phản ứng
* Phƣơng pháp tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc
Với mục đích thu DNA để làm khuôn cho các phản ứng PCR và multiplex PCR, chúng tôi tiến hành tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc theo phương pháp của
Cebula và cộng sự (1995), có thay đổi cho phù hợp với điều kiện nghiên cứu. Các bước tiến hành như sau:
(1) Nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa petri trong môi trường MPA đặc ở 370C để chúng phát triển, tạo khuẩn lạc.
(2) Từ đĩa thạch MPA đặc, 5 – 7 khuẩn lạc được lấy ra bằng tăm vô trùng sau đó được chuyển sang các ống eppendorf chứa sẵn 10µl nước khử ion vô trùng.
(3)Biến tính ở 990C trong 10 phút. Sau khi biến tính, nước bị bay hơi hoàn toàn, tiến hành bổ sung thêm 10µl nước khử ion vô trùng và đặt vào trong tủ - 800C trong 10 phút để tăng hiệu suất phá vỡ tế bào.
(4)Hỗn hợp sau rã đông ở nhiệt độ phòng sẽ được đảo đều và li tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút để kết tủa cặn tế bào. Hút 6µl phần dịch lỏng chứa DNA để làm khuôn cho các phản ứng PCR.
* Khuếch đại các gene đặc hiệu bằng phản ứng PCR
Để khuếch đại các gene blaTEM, blaCTX và blaSHV ở các chủng vi khuẩn Gram âm phân lập được bằng phản ứng PCR và multiplex - PCR, chúng tôi đã sử dụng các cặp mồi tham khảo đặc hiệu cho gene blaTEM [47], blaCTX-M và
blaSHV [46] từ các nghiên cứu đã công bố, sau đó đặt mua các cặp mồi này và PCR Master Mix cho các phản ứng từ hãng Thermo Scientific.
Bảng 2.4. Trình tự các cặp mồi được thiết kế để khuếch đại gene
Gene Cặp mồi Trình tự mồi ( 5’→ 3’ ) Đoạn DNA khuếch đại (bp) blaTEM TEM-F TEM-F TCGGGGAAATGTGCGCG TGCTTAATCAGTGAGGCACC 972 blaCTX CTX-M-F CTX-M-R ATGTGCAGYACCAGTAARGT TGGGTRAARTARGTSACCAGA 544 blaSHV SHV-F ATTTGTCGCTTCTTTACTCGC 1018
SHV-F TTTATGGCGTTACCTTTGACC Bảng 2.5. Thành phần các phản ứng PCR đơn mồi STT Thành phần Thể tích (µl) 1 PCR Buffer (10X) MgCl2 (25mM) dNTPs (2,5mM) 25 2 Mồi xuôi (10pM/µl) 2 3 Mồi ngược (10pM/µl) 2 4 DNA khuôn (0,5 - 1µg/ µl) 6
5 Taq – polymerase (5U/1 µl) 1
6 H2O khử ion 14
Tổng số 50
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi gene blaTEM
Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tác dụng
1 940C 2 phút 1 Biến tính 2 940C 520C 720C 45 giây 1 phút 1 phút 30 Biến tính Gắn mồi Tổng hợp chuỗi
3 720C 10 phút 1 Tổng hợp chuỗi
4 40C ∞ Ổn định mẫu
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi gene blaCTX-M
Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tác dụng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 940C 7 phút 1 Biến tính 2 940C 500C 720C 50 giây 40 giây 1 phút 30 Biến tính Gắn mồi Tổng hợp chuỗi 3 720C 5 phút 1 Tổng hợp chuỗi 4 40C ∞ Ổn định mẫu
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi gene blaSHV
Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tác dụng
1 940C 5 phút 1 Biến tính 2 940C 500C 720C 30 giây 30 giây 50 giây 30 Biến tính Gắn mồi Tổng hợp chuỗi 3 720C 10 phút 1 Tổng hợp chuỗi 4 40C ∞ Ổn định mẫu Phản ứng multiplex - PCR:
Trong phản ứng multiplex - PCR, chúng tôi sử dụng 3 cặp mồi là: blaTEM, blaCTX
và blaSHV (có trình tự như trình bày ở bảng 2.4) và DNA khuôn được tách trực tiếp từ khuẩn lạc để xác định 3 gene tương ứng. Phản ứng multiplex - PCR này có thành phần như sau: Bảng 2.9. Thành phần phản ứng multiplex - PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 PCR buffer (10X) MgCl2 (2,5mM) dNTPs(25mM) 25 2 Mồi (10 pmol/ µl) TEM-F 1 TEM-R 1 CTX-M-F 1 CTX-M-R 1 SHV-F 1 SHV-R 1 4 DNA khuôn 6
5 Taq – polymerase (5U/ µl) 1
6 H2O khử ion 12
Bảng 2.10. Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex - PCR
Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tác dụng
1 940C 7 phút 1 Biến tính 2 940C 500C 720C 50 giây 40 giây 1 phút 30 Biến tính Gắn mồi Tổng hợp chuỗi 3 720C 5 phút 1 Tổng hợp chuỗi 4 40C ∞ Ổn định mẫu
Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di
Sau khi kết thúc phản ứng PCR và multiplex - PCR, 7µl sản phẩm PCR (hay sản phẩm multiplex - PCR) + 5 µl loading dye được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0 % trong đệm TAE 1X cùng với marker chuẩn GeneRulerTM 1kb.
Thời gian điện di là 60- 90 phút ở 100V.
Gel điện di được ngâm trong 5 phút với dung dịch Ethidium bromide. Sau đó rửa sạch bằng nước, kiểm tra và chụp gel bằng máy BioDoc-ItTM. Các băng DNA được xác đinh bằng cách so sánh với thang marker chuẩn.
2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tỷ lệ và kiểu cách kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập đƣợc
Bệnh phẩm lâm sàng: Mủ, dịch tỵ hầu, dịch sinh dục - tiết niệu, phân, v.v… Sau khi được xử lý và nuôi cấy trên các đĩa môi trường chọn lọc được đã được để trong tủ ấm 370
C/18 - 24 giờ. Khuẩn lạc vi khuẩn nghi ngờ được nhận diện và định danh bằng hệ thống tự động Vitek. Các loài vi khuẩn Gram âm gây bệnh được phân bố như bảng sau.
Bảng 3.1. Cơ cấu các loại vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập được
Vi khuẩn Gram âm Số chủng phân lập Tỷ lệ %
E. coli 43 48,31 Klebsiella pneumoniae 24 26,97 Pseudomonas aeruginosa 9 10,11 Enterobacter aerogenes 6 6,74 Citrobacter freundii 4 4,49 Acinetobacter baumanii 3 3,37 Tổng số 89 100
Nhận xét: Trong tổng số 89 chủng vi khuẩn Gram âm phân lập được, E. coli là vi khuẩn chiếm đa số từ các mẫu bệnh phẩm (48,31%). Tiếp theo là Klebsiella pneumoniae (26,97%) và Pseudomonas aeruginosa (10,11%). Cơ cấu vi khuẩn Gram gây bệnh trong nghiên cứu này gần giống với kết quả nghiên cứu của Kiều Chí Thành và Lê Thu Hồng tại Bệnh viện 103 năm 2011 [5].
Sau khi được định danh, các chủng vi khuẩn được kiểm tra mức độ nhạy cảm với các kháng sinh bằng kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy kháng sinh
khuếch tán Kirby - Bauer. Đường kính vòng vô khuẩn xung quanh mỗi khoanh giấy kháng sinh sẽ được so sánh với bảng giới hạn chuẩn của kháng sinh tương ứng để phân lại mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn là nhạy cảm (S), trung gian (I) hay đề kháng (R) [43]. Mức độ nhạy cảm với kháng sinh chỉ được xác định với 2 loại vi khuẩn gây bệnh chiếm đa số là E. coli và Klebsiella pneumoniae.
Bảng 3.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E. coli (43 chủng)
STT Kháng sinh Mức độ nhạy cảm kháng sinh n (%)
S I R 1 Amoxycillin/A.Clavulanic (AMC) 25 (58,14) 3 (6,98) 15 (34,88) 2 Cefuroxime (CXM) 15 (34,88) 6 (13,96) 22 (51,16) 3 Ceftriaxone (CRO) 17 (39,53) 5 (11,64) 21 (48,83) 4 Cefotaxime (CTX) 22 (51,16) 4 (9,31) 17 (39,53) 5 Ceftazidime (CAZ) 21 (48,83) 3 (6,99) 19 (44,18) 6 Cefepime (FEP) 31(72,09) 0 (0,0) 12 (27,9) 7 Meropenem (MEM) 39 (90,69) 3 (6,69) 1 (2,32) 8 Doxycycline (DO) 15 (34,88) 5 (11,64) 23 (53,48) 9 Ciprofloxacin (CIP) 19 (44,18) 2 (4,66) 22 (51,16) 10 Ofloxacin (OFX) 19 (44,18) 3 (6,69) 21 (48,83)
34.88 51.16 48.83 39.53 44.18 27.9 2.32 53.48 51.1648.83 0 20 40 60 80 100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
AMC CXM CRO CTX CAZ FEP MEM DO CIP OFX
Kháng sinh
T
ỷ
lệ
%
Hình 3.1. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E. coli
Nhận xét: Từ bảng 3.2. và hình 3.1. cho thấy Vi khuẩn E. coli có tỷ lệ kháng với các kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 (ceftriaxone, cefuroxime, ceftazidime, cefotaxime) ở mức độ trung bình (từ 39,53 % đến 51,16 %). cefepime (kháng sinh cephalosporin thế hệ 4) cũng đã bị đề kháng với tỷ lệ 27,9 %, đây là kháng sinh lựa chọn thay thế trên lâm sàng khi các kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 bị vi khuẩn đề kháng. Tỷ lệ vi khuẩn còn nhạy cảm meropenem (kháng sinh β- lactam thuộc nhóm carbapenem) vẫn còn cao (90,96%). Tỷ lệ đề kháng với các kháng sinh nhóm fluoroqiunolon (ciprofloxacin, ofloxacin) khoảng 50%.
Bảng 3.3. Tỷ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae (24 chủng) STT Kháng sinh Mức độ nhạy cảm kháng sinh n (%) S I R