Nghiên cứu thu nhận enzym endolysin tái tổ hợp lyssa và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn staphylococcus aureus trong bảo quản sữa

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ XUÂN CÔNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME ENDOLYSIN TÁI TỔ HỢP LYSSA VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG BẢO QUẢN SỮA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS KHUẤT HỮU TRUNG HÀ NỘI – NĂM 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME ENDOLYSIN TÁI TỔ HỢP LYSSA VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG BẢO QUẢN SỮA Người hướng dẫn : PGS.TS KHUẤT HỮU TRUNG Học viên thực : LÊ XUÂN CÔNG Lớp : K20 Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn kết nghiên cứu cá nhân hướng dẫn PGS.TS Khuất Hữu Trung Các số liệu tài liệu trích dẫn luận văn trung thực Kết nghiên cứu không trùng với cơng trình cơng bố trước Tơi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan Hà Nội, 06 tháng năm 2018 Học viên Lê Xn Cơng LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Khuất Hữu Trung, ThS Nguyễn Thị Hồng Hải tồn thể cán Bộ mơn Vi sinh – Viện Di truyền Nông nghiệp tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ sinh học, Viện Sinh Thái Tài Nguyên Sinh Vật tận tình truyền đạt kiến thức hai năm học tập Với vốn kiến thức tiếp thu trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu luận văn mà cịn hành trang q báu để bước vào đời cách vững tự tin Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè, người cạnh tôi, động viên giúp đỡ suốt thời gian qua Cuối tơi kính chúc quý Thầy, Cô dồi sức khỏe thành công nghiệp cao q Đồng kính chúc Cơ, Chú, Anh, Chị Bộ môn Vi sinh – Viện Di truyền Nông nghiệp dồi sức khỏe, đạt nhiều thành công tốt đẹp công việc Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Lê Xuân Công MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU Chương 13: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tình hình ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus .3 1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus giới .3 1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus Việt Nam 1.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 1.2.1 Giới thiệu vê Staphylococcus .6 1.2.2 Hình thái đặc điểm sinh hóa 10 1.2.3 Điều kiện tăng trưởng phân bố 14 1.2.4 Tính kháng thuốc kháng sinh .15 1.3 Enzym tái tổ hợp 15 1.3.1 Hệ thống biểu hiện: 15 1.3.2.18Các vector biểu .18 1.4 Tổng quan enzym endolysin 21 1.4.1 Giới thiệu enzym endolysin 21 1.4.2 Vai trò ứng dụng 23 1.4.3 Tổng hợp nhân tạo endolysin kháng khuẩn .24 1.4.4 Ứng dụng endolysin công nghệ sinh học thực phẩm 26 1.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh enzym endolysin 27 1.5.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 27 1.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 27 1.5.3 Ảnh hưởng pH 28 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP28 NGHIÊN CỨU 28 2.1 Vật liệu 29 2.2 Hóa chất thiết bị 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phương pháp biểu gen LysSA vi khuẩn E.coli 30 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn E.coli BL21 tái tổ hợp đến sinh trưởng biểu endolysin .31 2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh enzyme endolysin LysSa tái tổ hợp 31 2.3.4 Phương pháp điện di SDS-PAGE .32 2.3.5 Phương pháp tinh enzyme endolysin cột sắc ký lực 34 2.3.6 Xác định hoạt độ enzym endolysin tái tổ hợp 34 2.3.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng endolysin LysSa với vi khuẩn gây bệnh có sữa với nồng độ endolysin thời gian bổ sung endolysin LysSa khác .35 2.3.8 Phương pháp đánh giá chất lượng sữa tươi nguyên liệu sau bổ sung enzyme endolysin LysSa 35 2.3.9 Phương pháp đánh giá chất lượng sữa tươi trùng sau bổ sung enzyme endolysin LysSa 35 Chương 3: KẾT QUẢ 36 3.1 Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn E.Coli BL21 tái tổ hợp biểu 36 3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ 36 3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy 37 3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng 39 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian cảm ứng thu hồi sinh khối 40 3.2 Nghiên cứu thu hồi enzym endolysin tái tổ hợp phương pháp phá tế bào 41 3.3 Kết nghiên cứu tinh enzyme endolysin tái tổ hợp 42 3.4 Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococus aureus enzym endolysin LysSa tái tổ hợp 44 3.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng phương pháp đếm khuẩn lạc 46 3.4.2 Phổ kháng khuẩn enzym endolysin 47 3.5 HoNK \l "_Toc3793088"vi khuẩn gây bệnh endolysin LysSapháp phá tế bàodolysin LysSan LysSa với 49 3.6 Chất lượng sữa tươi nguyên liệu sau bổ sung enzyme endolysin LysSa .51 3.7 Hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh có sữa tươi trùng endolysin LysSa 52 3.8 Chất lượng sữa tươi trùng sau bổ sung enzyme endolysin LysSa 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ .55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 M5AGER Hiện ngộ độc thực phẩm mối lo ngại nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng toàn giới Nguyên nhân người sử dụng loại thực phẩm bị nhiễm loài vi khuẩn gây bệnh hay độc tố chúng Mặc dù có cơng nghệ đại, phương pháp thực hành sản xuất tốt (GMP), kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn sản xuất đánh giá rủi ro (HACCP), số lượng trường hợp bị ngộ độc bị bệnh thực phẩm tăng lên suốt thập kỷ qua Ở châu Âu, năm ước tính có 380.000 người dân bị bệnh sử dụng sản phẩm thực phẩm nhiễm vi khuẩn, loại vi khuẩn gây bệnh như: Staphylococcus aureus, Salmonella, Listeria Staphylococcus aureus tác nhân phổ biến gây nhiễm trùng bệnh viện cộng đồng dân cư với tỷ lệ mắc tử vong cao toàn giới S aureus nhiễm độc thức ăn, đồ uống tiếp xúc người mang mầm bệnh dẫn đến viêm ruột cấp thức ăn có chứa độc tố ruột S aureus, gây nước điện giải dẫn tới sốc S aureus nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện Những chủng S aureus gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường có khả kháng lại nhiều kháng sinh S.aureus gây hội chứng sốc nhiễm độc tiết độc tố gây sốc Theo số quan quản lý thực phẩm châu Âu, vi sinh vật gây bệnh phổ biến có nguồn gốc từ thực phẩm bao gồm Salmonella, Escherichia coli O157:H7, S aureus Listeria với số loài khác Sử dụng chất hóa học để bảo quản thực phẩm chấp nhận nhiều chất bảo quản hóa học làm ảnh hưởng lâu dài tới sức khỏe cộng đồng Trong số chất bảo quản sinh học biết nay, endolysin thu hút quan tâm nhà khoa học có khả diệt ức chế vi sinh vật gây bệnh Endolysins (hay tên gọi khác lysins) enzym thủy phân có nguồn gốc từ thực khuẩn thể (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan thành tế bào vi khuẩn giai đoạn cuối chu trình sinh sản thực khuẩn thể Các enzyme làm giảm độ mạnh học thành tế bào dẫn đến dung giải tế bào giải phóng thực khuẩn thể hệ Do có mặt endolysins chúng phân hủy lớp peptidoglycan thành tế bào vi sinh vật chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết Do chúng coi chất thay kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọn lọc, không thay đổi đặc điểm cảm quan, kết cấu thực phẩm an toàn cho người Xuất phát từ lý tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzym Endolysin tái tổ hợp LysSa đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus bảo quản sữa.” MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tối ưu điều kiện nhân nuôi chủng tái tổ hợp E.coli BL21, thu nhận enzyme endolysin LysSa đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus endolysin LysSa tái tổ hợp bảo quản sữa NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng, xác định điều kiện tối ưu cho chủng E.coli BL21 sinh trưởng biểu enzym endolysin LysSa: - Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy - Ảnh hưởng nhiệt độ - Ảnh hưởng pH - Ảnh hưởng chất cảm ứng IPTG 2.2 Nghiên cứu thu hồi enzyme endolysin LysSa - Nghiên cứu phương pháp thu hồi enzyme endolysin LysSa - Nghiên cứu tinh enzyme endolsin LysSa 2.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus bảo quản sữa Chương Thương 1N TÀI LIsữ 1.1.Tình hình ngu LIsữaus tính khánStaphylococcus aureus 1.1.1 Tình hình ngus aureusc ph hình ngus aureuscus aureus theusius Theo WHO/FAO (tháng 5/2005), ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người kinh tế, làm 1,5 tỉ lượt người bệnh, nước công nghiệp 30% dân số bị ngộ độc thực phẩm hàng năm Trên giới, vụ ngộ độc lớn có liên quan đến tụ cầu xảy vào năm 1884 Michigan (Mỹ) phomai Tiếp đến Pháp vào năm 1894 thịt từ bị bị bệnh Khơ bị bị nhiễm tụ cầu gây ngộ độc Kalamazoo, Michigan vào năm 1907 Năm 1914, Philippines, Barbert xác định sữa lấy từ bò bị viêm vú gây ngộ độc người Năm 1930, Dark lại xác định vụ ngộ độc S aureus từ bánh giáng sinh (Reginald Bennett, 2001) Ở Pháp, số vụ ngộ độc báo cáo từ năm 1999-2000 cho thấy: 32% số vụ sản phẩm sữa đặc biệt phô mai, 22% thịt, 15% xúc xích, bánh pate; 11% hải sản; 11% trứng sản phẩm trứng; 9,5% gia cầm (Haeghebaert cs., 2002) Ngộ độc S aureus đứng hàng thứ hai sau Salmonella (bảng 1.1) Những thực phẩm bị nhiễm tụ cầu gây ngộ độc thường gặp thịt, cá, gà sản phẩm chúng, rau cải, trứng, nấm, sữa sản phẩm từ sữa, kem, phomai, thực phẩm lên men…(Normanno G cs, 2004) Ở Đài Loan, S aureus chiếm 30% số vụ dịch từ năm 1986 đến năm 1995 Vào tháng năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm tụ cầu trường trung học Taichung County làm 10 số 356 học sinh có biểu ngộ độc 2-3 sau ăn sáng (Wei H.L Chiou C.S., 2001) Tại Brazil, vào tháng tháng năm 1999 xảy hai vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc dùng phomai sữa tươi có nhiễm tụ cầu (Simễo L.C cs, 2001) Tại Pháp, năm 1997 người ta tìm thấy S aureus tác nhân gây 569 tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm ( Rosec J.P Gigaud O., 2002) Ở Nhật, từ năm 1994 đến năm 1998, số trường hợp ngộ độc tụ cầu chiếm 3,1-11,9% tổng số vụ ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Ngày 17/6/1999, 21 số 53 công nhân sau ăn trưa tin cơng ty Shizuoka Prefecter có biểu bệnh, có trường hợp phải nhập viện (Norinaga M cs, 2000) Bảng 1.1 Các tác nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm Pháp năm Tác nhân 1999-2000 (%) số vụ số trường Số nhập Số chết n=530 hợp n=6451 viện n=872 n=7 63,8 47,7 16,8 100 Staphylococcus aureus 16 25,6 17,1 Clostridium perfringens 5,1 12,3 0,5 Bacillus cereus 2,8 3,7 10,0 Histamin 3,8 1,4 30,4 Salmonella sp (Enteritidis, Typhimurium, Heidelberg số serotype khác) Các loại thực phẩm liên quan đến ngộ độc thực phẩm S.aureus khác quốc gia Chẳng hạn Mỹ, 50% số vụ ngộ độc báo cáo từ năm 1969-1990 từ sản phẩm thịt, ăn từ thịt đặc biệt thịt muối; 22% trường hợp gia cầm, ăn từ gia cầm, 8% từ sữa sản phẩm sữa; 7% cá tôm cua, ghẹ; 3,5% trứng Số vụ ngộ độc báo cáo từ năm 1975-1982 cho thấy: 36% thịt; 12,3% salad; 11,3% gia cầm; 5,1% bánh nướng, bánh bao có 1,4% sữa sản phẩm hải sản 17,1% thực phẩm liên quan vụ ngộ độc (Genigeorgis, 1989) Sự khác biệt thói quen ăn uống khác theo nước Tụ cầu gây khoảng 14% vụ ngộ độc thực phẩm; hàng năm, Mỹ khoảng 1,5 tỉ đô la cho vụ ngộ độc tụ cầu Trong loại độc tố gây vụ ngộ độc SEA loại độc tố chiếm tỷ lệ cao (77,8%), SED (37,5%) SEB (10%) (Normanno G.và ctv, 2004) Theo kết 3.3 cho thấy, tất nồng độ enzym endolysin có hoạt tính kháng với vi khuẩn S aureus sau nuôi cấy Sau vi khuẩn Staphylococus aureus phát triển trở lại sau 22 vi khuẩn phát triển với mật độ 4,8.105cfu/ml đối chứng 9,5.109cfu/ml Hình 3.4 Khuẩn lạc vi khuẩn S aureus mẫu có xử lý khơng xử lý enzym endolysin LysSa Mật độ vi khuẩn S aureus giảm rõ rệt (gần vi khuẩn S aureus không phát triển được) sau khoảng nuôi cấy Ở nồng độ enzym endolysin là: 45, 50, 55, 60, 70 U/ml sau ni cấy có mật độ giảm nhiều khơng có sai khác nhiều nồng độ nồng độ 40 45 U/ml lại có sai khác rõ Vì vậy, nồng độ enzym endolysin có hoạt tính kháng với vi khuẩn S aureus (103cfu/ml) tốt 45U-55U/ml 3.4.2 Phu/ml) tốt 45U-55U/ml.ảng Các chủng vi khuẩn nuôi nhiệt độ 300C đến OD600: 1,5 hòa vào thạch mềm đến nồng độ khoảng 103cfu/ml, tương đương với mật độ 2x103 cfu/đĩa Dịch endolysin (45 U/ml) bổ sung vào giếng Sau để đĩa 40C chuyển sang tủ ấm 300C, quan sát vịng vơ khuẩn 47 Bảng 3.9 Khả ức chế vi khuẩn gây bệnh endolysin LysSa Chủng vi khuẩn Hoạt tính phân giải Staphylococus aureus + S aureus SA018 + Staphylococus epidermidis + Listeria monocytogenes - E coli - Salmonella enteritidis - Chú thích: - khơng có hoạt tính + có hoạt tính Kết bảng cho thấy endolysin LysSa có hoạt tính đối kháng với vi khuẩn Staphylococus - vi khuẩn chủ, mà khơng có hoạt tính với vi khuẩn gây bệnh khác Hình 3.5 Hoạt tính kháng với vi khuẩn S aureus vi khuẩn Listeria monocytogenes 48 3.5 Hoeria monocytogenesi khuẩn ạt tính với vi khuẩn gây bệnh khác đĩa 4à: 45, 50, 55, 60 Sữa tươi nguyên liệu sữa nguyên chất dạng lỏng thu từ bò, trâu, dê, cừu, chưa bổ sung tách bớt thành phần sữa, chưa xử lý qua phương pháp nào, dùng làm nguyên liệu để chế biến Sữa tươi thu từ sở chăn nuôi bảo quản lạnh q trình đưa phịng thí nghiệm Một phần sữa dùng để đánh giá mật độ vi sinh vật có sữa tươi nguyên liệu (mật độ vi sinh vật có sữa tươi nguyên liệu khoảng 10 – 107cfu/ml), phần lại đem lọc qua màng lọc vơ trùng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn enzym endolysin LysSa tái tổ hợp với vi khuẩn gây bệnh S aureus Trong thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng mơi trường LB, 45U/ml endolysin LysSa có khă tiêu diệt 103cfu/ml vi khuẩn Staphylococus aureus Dựa vào nồng độ biết này, endolysin LysSa pha tới nồng độ: 35, 40, 45, 50, 55U/ml bổ sung với 103cfu/ml vi khuẩn S aureus vào sữa tươi nguyên liệu để xác định hoạt tính kháng endolysin Đọc kết sau 30 phút, 1, 2, 4, 22 Kết lặp lại lần Bảng 3.10 Hoạt tính đối kháng endolysin LysSa với 103cfu/ml vi khuẩn S aureus sữa tươi nguyên liệu Nồng độ endolysin (U/ml) Mật độ vi khuẩn S aureus theo thời gian (cfu/ml) 30 phút giờ giờ 22 35 9,1.102 7,9.102 5,6.102 9,2.101 5,7.102 6,2.106 40 9,0.102 5,8.102 9,3.101 3,6.101 1,1.102 1,4.106 45 7,2.102 3,1.102 4,9.101 1,5.101 7,8.101 4,8.105 50 6,7.102 2,6.102 4,1.101 1,3.101 7,5.101 2,9.105 55 6,3.102 2,2.102 2,5.101 0,9.101 6,9.101 1,4.105 ĐC 2,1.103 8,6 103 3,2.104 1,1.105 2,5.106 1,6.109 49 Hình 3.6 Mật độ vi khuẩn S aureus sau bổ sung endolysin nồng độ khác sữa tươi nguyên liệu sau 22h Kết bảng cho thấy endolysin nồng độ 45 U/ml có hoạt tính đối kháng tốt gần hoạt tính nồng độ 55 U/ml Với kết này, chọn nồng độ 45U/ml nồng độ tối ưu Tại nồng độ endolysin thể hoạt tính bổ sung vào sữa tươi nguyên liệu hoạt tính trì khoảng đầu bổ sung enzym Hình 3.7 Sữa tươi nguyên liệu có bổ sung endolysin vi khuẩn S aureus 50 Hình 3.8 Số lượng vi khuẩn S.aureus có mẫu sữa sau bổ sung endolysin Như vậy, nồng độ tối ưu bổ sung vào sữa tươi nguyên liệu để ức chế 103cfu/ml tế bào vi khuẩn S.aureus S.aureus 45U/ml 3.6 Ch45U/ml ưu bổ sung vào sữa tươi nguyên liệu để ức chế Sữa tươi nguyên liệu bổ sung endolysin hỗn hợp với hàm lượng 150 µg/lít (40U), 200 µg/lít (45U), 300 µg/lít (50U) Đánh giá chất lượng sữa qua tiêu như: chất béo (Fat), chất khô không béo (SNF), tỷ trọng, nước thêm vào ( Add, Wetter) protein sau 3h, 8h bổ sung endolysin Các tiêu đo máy tự động Bảng 3.11 Chỉ tiêu phân tích thành phần sữa sau bổ sung endolysin Thời gian (giờ) Hàm lượng endolysin (U/ml) Sau 40 Chỉ tiêu phân tích Fat SNF Tỷ trọng Add Watter Protein 4,20 8,29 26,9 2,08 54,4 3,14 45 4,20 8,30 26,9 1,97 54,5 3,15 50 4,15 8,31 27,0 1,85 54,6 3,14 ĐC 4,12 8,37 27,3 1,18 54,9 3,17 51 Sau 22 40 4,10 8,46 27,6 1,93 55,5 3,2 45 3,87 8,50 28,0 1,95 55,8 3,21 50 ĐC 4,02 4,04 8,52 8,13 28,0 26,4 1,82 3,81 55,9 53,5 3,22 3,08 Kết bảng cho thấy bổ sung enzym endolysin LysSa vào sữa với nồng độ có hoạt tính kháng với vi khuẩn S aureus không làm thay đổi số chất lượng sữa như: chất béo, chất khô không béo, tỷ trọng, nước thêm vào protein so với đối chứng Điều cho thấy enzym endolysin sử dụng bảo quản sữa tươi nguyên liệu 3.7 Ho béo, chất khô không béo, tỷ trọng, nước thêm vào protein so với đối chứng Điều n Sau thu sữa tươi nguyên liệu từ sở chăn ni bị sữa, sữa trùng 600C 30 phút (thanh trùng tiêu chuẩn sữa trùng) Tuy nhiên, kiểm tra mật độ vi sinh vật có sữa tươi trùng cịn cao (khoảng 103 - 104 cfu/ml) Vì vậy, để có sữa tươi trùng nghiên cứu phải tiến hành lọc sữa qua màng lọc vô khuẩn trùng 600C 30 phút Sau bổ sung 103cfu/ml vi khuẩn S aureus vào sữa tươi trùng với endolysin LysSa với nồng độ: 35, 40, 45, 50, 55U/ml để xác định hoạt tính kháng endolysin LysSa Hình 3.9 Mật độ vi khuẩn S aureus sau bổ sung endolysin nồng độ khác sữa tươi trùng 52 Kết hình cho thấy, bổ sung enzym endolysin Lys Sa với nồng độ khác có hoạt tính ức chế với vi khuẩn S Aureus sữa tươi trùng Sau 10 ngày bảo quản nhiệt độ 40C, vi khuẩn S Aureus bị ức chế (mật độ vi khuẩn chưa cao lúc đưa vào) Ở nồng độ endolysin 50U/ml có khả ức chế rõ so với nồng độ 45U/ml lại không tốt rõ rệt so với nồng độ 50 55U/ml Nếu sử dụng enzym endolysin chất bảo quản sữa nồng độ 50U/ml nồng độ tốt để ức chế vi khuẩn S Aureus bảo quản sữa trùng Hình 3.10 Số lượng vi khuẩn S.aureus có mẫu sữa tranh trùng sau ngày bổ sung endolysin 3.8 Chtrong mẫu sữa tranh trùng sau ngày bổ sung endolysin/ml nồng độ Sữa tươi trùng bổ sung endolysin hỗn hợp với hàm lượng 150 µg/lít (40U), 200 µg/lít (45U), 300 µg/lít (50U) Đánh giá chất lượng sữa qua tiêu như: chất béo (Fat), chất khô không béo (SNF), Tỷ trọng, nước thêm vào ( Add, Wetter) protein sau 3h, 8h bổ sung endolysin Các tiêu đo máy tự động 53 Bảng 3.12 Chỉ tiêu phân tích thành phần sữa sau bổ sung endolysin Thời gian (giờ) Chỉ tiêu phân tích Tỷ Add Watter Protein trọng Fat SNF Sau Hàm lượng endolysin (µg/lít) 45 4,12 8,33 27,2 1,98 54,7 3,13 20 50 4,20 8,31 26,9 1,96 54,6 3,14 55 4,16 8,31 27,1 1,84 54,7 3,14 ĐC 4,12 8,37 27,3 1,18 54,9 3,17 Sau 45 4,11 8,46 27,6 1,92 55,5 3,2 10 50 3,89 8,51 28,1 1,95 55,8 3,21 55 4,03 8,51 28,0 1,82 55,9 3,20 ĐC 4,03 8,12 26,3 3,82 53,6 3,09 ngày Khi bổ sung enzym endolysin LysSa với nồng độ có hoạt tính kháng với vi khuẩn S aureus vào sữa tươi trùng bảo quản nhiệt độ 40C, thời gian 10 ngày, chất lượng gần không thay đổi so với sữa không bổ sung enzym endolysin Cụ thể số chất béo, chất khô không béo, tỷ trọng, nước thêm vào protein gần không thay đổi so với đổi so với đối chứng Điều cho thấy enzym endolysin sử dụng bảo quản sữa tươi trùng 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KLUẬN VÀ Xác định điều kiện nuôi cấy biểu enzyme endolysin LysSa tối ưu: Nhiệt độ nuôi cấy biểu tối ưu: 320C pH tối ưu: 7,0 Thời gian thu hồi enzym sau cảm ứng: 3h-4h Nồng độ chất cảm ứng IPTG : 1mM Môi trường ni cấy thích hợp cho phát triển chủng vi khuẩn tái tổ hợp E.coli BL21 môi trường LB có cải tiến số thành phần như: cao nấm men 8g/l, trypton 8g/l, NaCl 10g/l - Phá tế bào vi khuẩn E.coli BL21để thu hồi enzym endolysin phương pháp siêu âm cho hiệu cao đạt 22,3 U/ml dịch lên men Hiệu suất thu hồi enzym endolysin sau tinh 65,7%, tinh 4,1 lần hoạt độ tổng 100ml dịch lên men 1465U Enzym endolysin LysSa có hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh S aureus Với nồng độ endolysin từ 40 U/ml-70 U/ml có khả ức chế 103 cfu/ml vi khuẩn S aureus - nhiệt độ thường Enzym endolysin LysSa có hoạt tính kháng với vi khuẩn S aureus (vi khuẩn chủ) mà khơng có hoạt tính kháng với lồi vi khuẩn gây bệnh khác - 45U/ml enzym endolysin LysSa nồng độ tối ưu để ức chế 103 cfu/ml vi khuẩn S aureus sữa tươi nguyên liệu sau bảo quản nhiệt độ thường mà không làm thay đổi thành phần chất lượng sữa Ở nồng độ 50U/ml enzym endolysin Lys Sa có hoạt tính kháng tốt với vi khuẩn S aureus (103 cfu/ml) sau 10 ngày bảo quản nhiệt độ oC sữa tươi trùng, đồng thời không làm thay đổi thành phần chất lượng sữa tươi trùng KI sữa tư Được tiếp tục nghiên cứu enzyme endolysin LysSa tái tổ hợp quy mô lớn hơn, ứng dụng bảo quản sữa bảo quản thực phẩm 55 TÀI LII) sau 10 ng Tiếng Việt Bùi Thế Hiền, Tô Thị Thu Cộng (2005),‖ Tình hình nhiễm thực phẩm vi sinh vật hai xã huyện Kiến Xương tỉnh Thái Bình năm 2001‖, Trung tâm y tế dự phịng Thái Bình, Thơng tin khoa học, Cục an tồn vệ sinh thực phẩm, 2005 Đỗ Thị Hòa, (2006), Phòng chống tụ cầu trùng vàng Khoa học phổ thông, số 30/06 Nguyễn Lý Hương, Nguyễn thị Phấn Bùi Thị Kim Dung (2005), Khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật số mặt hàng thực phẩm ăn liền bán chợ Tp.Hồ Chí Minh năm 2002-2004, Trung tâm y tế dự phòng Tp.Hồ Chí Minh, Thơng tin khoa học, Cục an tồn vệ sinh thực phẩm, 2005 Nguyễn Thị kê, Nguyễn Xuân Mai, Nguyễn đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương, Bùi Thị Kiều Nương, Nguyễn Trần Chính, Cao Minh Nga, cao Ngọc Nga, (2006), Khảo sát tính chất kháng kháng sinh số chủng vi sinh vật lây qua đường tiêu hóa‖, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, số đặc biệt chuyên đề Y tế công cộng Y học dự phòng, phụ tập 10 (số 4), tr 406-411 Nguyễn Thị Kê, Cao Minh Nga (2006), Áp dụng kỹ thuật ELISA, PCR để xác định số vi khuẩn độc tố ruột vi khuẩn S.aureus gây bệnh truyền qua đường thực phẩm, Đề tài sở Khoa Học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương Bùi Kiều Nương (2003) - Đánh giá mức độ ô nhiễm vi sinh vật thức ăn đường phố thành phố Hồ Chí Minh năm 2002, Viện Vệ Sinh Y tế Công Cộng Tp HCM, Thơng tin khoa học, Cục an tồn vệ sinh thực phẩm, 2003 Nguyễn Đỗ Phúc, Nguyễn Thị Kê, Trần Linh Thước (2006), Mối tương quan đậm độ khả sinh độc tố ruột (enterotoxin) S.aureus hai môi trường nuôi cấy TSGM BHI, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, số đặc 56 biệt chuyên đề Y tế công cộng Y học dự phòng, phụ tập 10, (số 4), tr 412-417 Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nxb Giáo dục 230 trang Tiếng Anh Briers, Y., Volckaert, G., Cornelissen, A., Lagaert, S., Michiels, C W,Hertveldt, K.Molecular Microbiology , 65, 1334-1344 Muralytic activity and modular structure of the endolysins of Pseudomonas aeruginosa bacteriophages phiKZ and EL.(2007) 10 Briers Y, Walmagh M, Lavigne R Use of bacteriophage endolysin EL188 and outer membrane permeabilizers against Pseudomonas aeruginosa.J.Appl Microbiol 2011; 110(3):778-785 11 Collins, C H., Patricia M L and Grange, J M (1995), Staphylococcus and Micococcus, Collines and Lyne’s Microbiological Methods,),pp.353-359 12 Diaz E, Lopez R, Garcia JL Chimeric phage-bacterial enzymes: a clue to the modular evolution of genes Proc Natl Acad Sci USA.1990; 87(20):81258129 13 Gaeng, S., scherer, S., Neve, H., & Loessner, M J (2000) Gene cloning and expression and secretion of Listeria monocytogenes bacteriophage-lytic enzymes in Lactococcus lactic Applied and Environmental Microbiology,66, 2951-2958 14 Garcia, P., Martinez, B., Rodriguez, L., & Rodriguez, A (2010) Synergy between the phage endolysin LysH5 and nisin to skill Staphylococcus aureus in pasteurized milk International Journal of Food Microbiolohy, 141,151-155 15 Genigeorgis, A.A (1989), Present state of knowledge on staphylococcal intoxication, Int J Foof Microbiol.9, pp 327-360 57 16 Haeghebaert, S., Le Querrec, F., Gallay, A., Bouvet, P., Gomez, M., and Vaillant, V., (2002) Les toxi-infections alimentaies collectives en France en 1999-2000, Bull Epide’miol Hebdo.23, pp.105-109 17 Hendrix RW Bacteriaophages: evolution of the majority Theor Popul Biol 2002; 61(4):471-480 18 Kenneth Todar, (2005) Todar’s Online Textbook of Bacteriology University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology (Staphylococcus) Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology 19 20 Kretzer, J W., Lehmann, R., Schmelcher, M., Banz, M., Kim, K P., Korn, C., et al (2007) Use of high-affinity cell wall-binding domains of bacteriophage endolysins for immobilization and separation of bacterial cells Applied and Environmental Microbiology, 73, 1992-2000 21 Larsen, H.D., Huda, A., Eriksen, N.H.R and Jensen, N.E (2000), differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolated in possession of superantigens, Vet Microbiol 76, pp 153-162 22 Loeffer, J.M, Djurkovic, S., Fischetti, V.A., (2003), Phage lytic enzyme Cpl- as a novel antimicrobial for pneumococ- cal bacteremia Infect Immun, 71: 6199- 6204 23 Loessner, M.J., Kramer, K., Ebel, F., Scherer, S (2002), C-terminal domains of Listeria monocytogenes bacteriophage murein hydrolases determine specific recognition and highaffinity binding to bacterial cell wall carbohydrates Mol Microbiol; 44:335-349 24 Liu B., Wu, S., Song, Q., Zhang, X., & Xie, L (2006) Two novel bacteriophages of thermophilic bacteria isolated from deep-sea hydrothermal fields Current Microbiology, 53, 163-166 58 25 Mary K Sandel and John L McKillip (2002), Virulence and recovery of Staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional approaches Food control 15, pp 5-10 26 Mayer, M J., Payne, j., Gasson, M J., &Narbad, A (2010) Genomic sequence and characterization of the virulent bacteriophage phiCTP1 from Clostridium tyrobutyricum and heterologous expression of its endolysin Applied and Enviromental Microbiology, 76, 5415-5422 27 Norinaga Miwa, Asako Kawamura, Takashi Masuda Masato Akiyama, (2000), An outbreak of food poisoning due to egg yolk reaction-negative Staphylococcus aureus International Journal of Food Microbiology 64, pp 361-366 28 Normanno, G., Firinu, A., Virgilio, S Mula, G., Dambrosio, A., Poggiu, A., Decastelli, L., Mioni, R., scuota, S., Bolzoni, G., Di Giannatale, E., Salinetti, A.P., La Salandra, G., bartoli, M., Zuccon, F , Pirino, T., Sias, S., Parisi, A., Quaglia N.C and Celano, G.V (2004), Coagulase-positive Staphylococci and Staphylococcus aureus in food products marketed in Italy International Journal of Food Microbiology 98, pp 73-79 29 Obeso, J M., Martinez, B., Rodriguez, A., & Garcia, P.(2008) Lytic activity of the recombinant staphylococcal bacteriophage PhiH5 endolysin active against Staphylococcus aureus in milk International Journal of Food Microbiology, 128, 212-218 30 Oliveira, H., Azeredo, J., Lavigne, R., and Kluskens, L.D (2012) Bacteriophage endolysins as a response to emerging foodborne pathogens 31 Reginald W Bennett Gayle A Lancette (2001), Bacteriological Analytical Manual Online (Chapter12: Staphylococcus aureus) Center for Food Safety & Applied Nutrition, U.S.Food and Drug Administration 59 32 Rosamund, M B and Lee, W.H (1995), Media used in the detection and enumeration of Staphylococcus aureus International Journal of Food Microbiology 26, pp.15-24 33 Rosec, J.P and Gigaud, O (2002), Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France, Int J Food Microbiol 35, pp 61-70 34 Scott E M., John J I., Harvey, J., Gilmour, A., Sita R T., Reginald Bennett and Bergdoll, M.S (2000), Staphylococcus Encyclopedia of Food Microbiology, Academic Press, San Diego - San Francisco - New Yolk – Boston – London – Sydney - Tokyo p.2062-2083 35 Simeão L C, Souza Dias, R., Roberto Linardi, V., Jose de Sena M., Aparecida dos Santos, D., Eduardo de Faria, M., Castro Pena, E., Jett M and Guilherme Heneine, L., ( 2001), Food poisoning enterotoxigenic strains of Staphylococcus present in Minas cheese and raw milk in Brazil Food Microbiology19, pp 9-14 36 Sass, P., Beierbaum, G., (2007), Lytic activity of recombinant bac- teriophage phi 11 and phi 12 endolysins on whole cells and biofimls of Staphylococcus aureus Appl Environ Microbiol, 73(1): 347- 352 37 Wei H.-L.and Chiou, C.S (2001), Molecular subtyping of Staphylococcus aureus from an outbreak associated with a food handler Epidemiol Infect 128, pp 15-20 38 Yoong, P., Schuch, R., Nelson, D., & Fischetti, V A (2006) PlyPH, a bacteriolytic enzyme with a broad pH range of activity and lytic action against Bacillus anthracis Journal of Bacteriology, 188, 2711-2714 39 Yin, J., Li, G., Ren, X., & Herrler, G (2007) Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes Journal of Biotechnology, 127(3), 335-347 60 40 Zhang, H., Bao, H., Billington, C., Hudson, J A., & Wang, R (2012) Isolation and lytic activity of the Listeria bacteriophage endolysin LysZ5 against Listeria monocytogenes in soya milk Food Microbiology, 31, 133136 41 Zimmer, M., Vukov, N., Scherer, S., Loessner, M.J (2002), The murein hydrolase of the bacteriophage phi3626 dual lysis system is active against all tested Clostridium perfringens strains Appl Environ Microbiol, 68(11):5311-5317 61 ... tái tổ hợp LysSa đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus bảo quản sữa. ” MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tối ưu điều kiện nhân nuôi chủng tái tổ hợp E.coli BL21, thu nhận enzyme endolysin. .. thu nhận enzyme endolysin LysSa đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus endolysin LysSa tái tổ hợp bảo quản sữa NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng, xác định... 3.4 Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococus aureus enzym endolysin LysSa tái tổ hợp 44 3.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng phương pháp đếm khuẩn lạc 46 3.4.2 Phổ kháng