Biểu hiện, tinh sạch thrombin tái tổ hợp và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của băng gạc có gắn thrombin kết hợp với nano bạc

Mục lục MỞ ĐẦU....................................................................................................................................1 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................................3 1.1. Thrombin và cơ chế đông máu ....................................................................................3 1.1.1. Định nghĩa ............................................................................................................3 1.1.2. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của thrombin .........................................................4 1.1.2.1. Thành phần máu............................................................................................4 1.1.2.2. Cơ chế đông máu của thrombin ....................................................................5 1.1.2.3. Cấu trúc chức năng của thrombin .................................................................9 1.1.3. Ứng dụng của thrombin......................................................................................12 1.2. Nano bạc ....................................................................................................................12 1.2.1. Các đặc trưng, tính chất vật lý của hạt nano bạc ................................................12 1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn ...........................................................................................13 1.2.3. Các phương pháp chế tạo ...................................................................................15 1.3. Tổng quan về các chủng vi sinh vật...........................................................................15 1.3.1. Escherichia coli...................................................................................................15 1.3.2. Tụ cầu Staphylococcus.......................................................................................16 1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.............................................................................16 1.5. Tình hình nghiên cứu trong nước ..............................................................................18 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................................................20 2.1. Nguyên liệu và thiết bị...............................................................................................20 2.1.1. Chủng nuôi cấy...................................................................................................20 2.1.2. Hạt nano bạc .......................................................................................................20 2.1.3. Hóa chất..............................................................................................................20 2.1.4. Dung dịch và đệm...............................................................................................20 2.1.5. Môi trường nuôi cấy ...........................................................................................21 2.1.6. Thiết bị thí nghiệm .............................................................................................21 2.2. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................................22 2.2.1. Các phương pháp vi sinh vật ..............................................................................22 2.2.1.1. Hoạt hóa chủng giống .................................................................................22 2.2.1.2. Nuôi biểu hiện .............................................................................................22 2.2.2. Các phương pháp hóa sinh .................................................................................23 2.2.2.1. Điện di protein trên gel polyacrymide (PAGE) ..........................................23 2.2.2.2. Xác định nồng độ protein............................................................................24 2.2.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp.........................................................................25 2.2.2.4. Phương pháp loại đuôi histag ra khỏi protein tái tổ hợp............................25 2.2.2.5. Phương pháp xác định chuyển hóa fibrinogen............................................26 2.2.2.6. Phát hiện thrombin bằng cơ chất đặc hiệu Chromozym TH .......................26 2.2.3. Các phương pháp phân tích hạt nano .................................................................27 2.2.3.1. Phương pháp quang phổ UVVis................................................................27 2.2.3.2. Phương pháp nhiễu xạ ánh sáng..................................................................27 2.2.4. Các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn băng gạc có gắn nano bạc kết hợp với thrombin...............................................................................................................28 2.2.4.1. Gắn gắn nano bạc và thrombin lên hệ băng gạc và urgo.............................28 2.2.4.2. Đánh giá hiệu suất kháng khuẩn của băng gạc gắn hệ nano .......................28 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................................................30 3.1. Biểu hiện thrombin tái tổ hợp ....................................................................................30 3.2. Tinh sạch thrombin tái tổ hợp....................................................................................32 3.3. Hoạt tính chuyển hóa fibrinogen của thrombin .........................................................34 3.4. Xác định hoạt tính với cơ chất đặc hiệu Chromzym TH ...........................................36 3.5. Xác định hàm lượng và kích thước nano bạc ............................................................37 3.6. Hoạt tính Agthrombin trên băng gạc ........................................................................39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................................44 TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................................45 PHỤ LỤC ................................................................................................................................47 MỞ ĐẦU Bị thương, chảy máu là một việc không hiếm gặp trong cuộc sống sinh hoạt hàng ngày. Với những vết thương trầy da thông thường thì chỉ cần băng kín vết thương trong một thời gian ngắn sẽ ngừng chảy máu và không có gì nguy hiểm. Tình hình trở nên nguy hiểm đối với những người mắc chứng rối loạn đông máu, máu khó đông, những vết thương nặng hơn hoặc những vết thương ở vị trí khó băng bó như ở cổ hay nách. Đặc biệt với những vết thương có nguy cơ nhiễm trùng hay ở nơi thiếu thốn trang thiết bị y tế, thì việc nhanh chóng khử trùng và cầm máu cho vết thương đóng vai trò sống còn với người bị thương. Trước thực tế trên đặt ra yêu cầu về một sản phẩm sơ cứu y tế nhỏ gọn, tiện lợi để sử dụng trên mọi vị trí và có thể mang theo bất kỳ đâu. Sản phẩm có khả năng cầm máu nhanh và sát trùng hiệu quả. Đặc biệt phải có giá thành hợp lý và có thể sử dụng trong thời gian dài. Thrombin là một serine protease có tác dụng quan trọng trong việc cầm máu. Dưới tác dụng của thrombin, fibrinogen ở dạng hòa tan chuyển thành fibrin đơn phân tử dạng không hòa tan. Các fibrin đơn phân tử hợp thành các sợi fibrin nhờ yếu tố XIII. Giai đoạn này cũng có sự tham gia của Ca2+. Các tế bào máu được giữ lại trên lưới fibrin và tạo nên cục máu đông để chống lại hiện tượng chảy máu của cơ thể. Thông thường cơ thể động vật và con người sẽ tự tổng hợp ra thrombin để cầm máu cho cơ thể. Tuy nhiên, quá trình hình thành thrombin trong cơ thể mất khá nhiều thời gian khiến máu không được cầm ngay lập tức. Các bệnh viện dân sự đã ứng dụng trong quá trình điều trị, song các bác sĩ dân sự chỉ dùng thrombin dạng lỏng để ngâm miếng gạc rồi đặt lên vết thương. Mang theo thrombin dạng lỏng đến chiến trường là việc khó khăn đối với binh lính và bác sĩ quân y. Do đó việc nghiên cứu chế tạo ra một loại băng gạc đã gắn thrombin là hết sức cần thiết. Bên cạnh đó việc kết hợp thrombin với hạt nano bạc trên băng gạc cầm máu hứa hẹn tạo ra một sản phẩm có giá trị kinh tế rất cao. Một sản phẩm rất tiện lợi và được ưa chuộng tại các gia đình hiện nay là miếng urgo nhỏ gọn và băng gạc để băng các vết thương lớn hơn. Tuy nhiên các sản phẩm trên có khả năng cầm máu khá chậm và nguy cơ nhiễm trùng là rất cao với băng gạc thông thường khi vết thương không được khử trùng đúng cách. Qua đó băng gạc gắn thrombin kết hợp với nano bạc không chỉ là một sản phẩm cầm máu máu nhanh hơn, sử dụng được trên nhiều vị trí hơn, mà còn có tác dụng kháng khuẩn với sự có mặt của nano bạc. Hệ vật liệu được tích hợp nhỏ gọn lại với các sản phẩm băng gạc hay urgo với giá thành hợp lý chắc chắn sẽ rất được ưa chuộng. Trước thực trạng trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp “ Biểu hiện, tinh sạch thrombin tái tổ hợp và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của băng gạc có gắn thrombin kết hợp với nano bạc”. Với các mục tiêu sau: 1) Biểu hiện, tinh sạch thrombin tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli BL21. 2) Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của băng gạc cầm máu có gắn thrombin kết hợp với nano bạc 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Thrombin và cơ chế đông máu 1.1.1. Định nghĩa Thrombin có vai trò quan trọng trong y, sinh học. Do đó thrombin là một trong những enzyme được nghiên cứu rộng rãi nhất trong các protease. Thrombin bản chất là một serine protease (nhóm enzyme tách liên kết peptide của protein nhờ vào tương tác đặc hiệu của các nhóm axit amin) đa chức năng có liên quan tới một số hoạt động trong cơ thể. Thrombin có nhiều điểm tương đồng với serine protease khác như trypsin, được tìm thấy trong dạ dày của nhiều sinh vật với vai trò hỗ trợ phân giải một phần protein trong quá trình tiêu hóa của cơ thể. Trong đó chức năng được quan tâm nhất khi nói tới thrombin là khả năng tách phân tử fibrinogen thành fibrin monomer ở dạng sợi có tác dụng tạo thành mạng lưới liên kết các hồng cầu và các thành phần trong máu lại với nhau để hình thành cục máu đông 5 Hình 1. 1. Những vai trò của thrombin. Tham gia đông máu, tính đa hiệu của gene, thuốc chống đông Thrombin được tổng hợp ở gan và bài tiết vào máu ở dạng tiền chất hoạt động zymogen (prothrombin), một glycoprotein multidomain phức tạp sẽ được kích hoạt để tạo ra thrombin tại các vị trí mạch máu bị tổn thương. Hơn năm thập kỷ nghiên cứu về thrombin đã cung cấp rất nhiều thông tin về chức năng, cấu trúc và cung cấp một lượng kiến thức khổng lồ cho sự hiểu biết về vai trò của chúng trong hệ thống sinh vật. Mặc dù có rất nhiều vai trò trong cơ thể nhưng chức năng chính thrombin là tạo ra monome fibrin, nó còn được tích hợp với thành phần khác của dòng máu để hỗ trợ quá trình đông máu. Thrombin cũng kích hoạt các protein khác trong dòng thác đông máu như đông máu yếu tố II, IV, XIII, XI và XIII. Kích hoạt của các yếu tố đông máu khác hoạt động như một vòng lặp thông tin phản hồi liên tục, ảnh hưởng đến rất nhiều các protein tham gia vào quá trình đông máu, cũng như sản xuất thrombin 5. 1.1.2. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của thrombin 1.1.2.1. Thành phần máu Máu chiếm 7% trọng lượng cơ thể, chúng có tỉ trọng trung bình 1060 kgm3 , gần giống với tỷ trọng nước nguyên chất (1000 kgm3 ). Người trưởng thành trung bình có khoảng 45 lít máu, gồm hai thành phần chính là tế bào và huyết tương. Các thành phần hữu hình: Hồng cầu chiếm khoảng 96%. Hồng cầu chứa hemoglobin, có nhiệm vụ chính là vận chuyển và phân phối oxy. Bạch cầu: chiếm khoảng 3% là một phần quan trọng trong hệ miễn dịch của cơ thể. Tiểu cầu: chiếm khoảng 1%, chịu trách nhiệm trong quá trình đông máu. Tiểu cầu tham gia rất sớm và là khởi đầu của quá trình hình thành cục máu đông ở mạch máu nhỏ bị tổn thương. Khi mạch máu bị tổn thương các tiểu cầu. Tham gia sớm nhất vào quá trình đông máu đó là tiểu câu 25. Huyết tương có thành phần chủ yếu là nước (92%), các protein hòa tan (albumin, globulin, fibrinogen...), các yếu tố đông máu, các kháng thể (antibody) hay globulin miễn dịch (immunoglobulin), các hormone và các protein khác cùng với các chất điện giải (chủ yếu là Natri và Clo, ngoài ra còn có can xi, kali, phosphate). Ngoài ra còn chứa các chất thải khác của cơ thể 25. Cũng giống như huyết tương, huyết thanh là thành phần không chứa các dạng tế bào máu (huyết thanh không chứa tế bào bạch cầu hoặc hồng cầu). Huyết thanh bao gồm tất cả protein không được sử dụng trong quá trình đông máu và tất cả các chất điện giải, kháng thể, kháng nguyên, nội tiết tố, và bất kỳ chất ngoại sinh nào (ví dụ, chất gây nghiện hay vi sinh vật). yếu tố thường được quan tâm nhất ở huyết thanh là các khoáng thể được dùng trong điều trị các bệnh liên quan tới vi sinh vật 30. 1.1.2.2. Cơ chế đông máu của thrombin Đầu tiên để hạn chế sự mất máu của cơ thể trước khi kịp hình thành cục máu đông, các mạch máu bị tổn thương sẽ co lại theo cơ chế tự nhiên và quá trình tập kết tiểu cầu được kích hoạt ngay lập tức. Các tiểu cầu là các tế bào không có nhân, chúng nhanh chóng bám vào thành tế bào thông qua các sợi collagen bị lộ ra tại bề mặt vết thương nhờ các thụ thể được kích hoạt. Từ dạng tự do, các tiểu cầu chuyển thành dạng có chân và gắn lại với nhau tạo thành một khối lơn thông qua adenosine diphosphate (ADP) được sinh ra và kích hoạt quá trình tập kết tiểu cầu. Đồng thời tiểu cầu kích hoạt các yếu tố chuyển đổi prothrombin thành thrombin cũng như gọi thêm các tiểu cầu khác tham gia vào quá trính. Tập hợp tiểu cầu tạo thành một khối lớn bao kín vết thương cho tới khi có các sợi fibrin xuất hiện và khâu nối chúng lại để tạo ra khối máu đông vững chắc hơn 21. Sự hình thành cục máu đông là một quy trình phức tạp với sự tham gia của nhiều thành phần trong máu. Với hàng loạt các phản ứng sinh lý khác nhau để có thể giảm lượng máu mất đi thông qua việc tập kết tiểu cầu và hình thành chuỗi phản ứng tạo ra thrombin tại vị trí vết thương, giúp chuyển hóa fibrinogen thành các sợi fibrin gắn kết các thành phần máu như hồng cầu, tiểu cầu và các protein khác trong cơ thể để tạo ra cục máu đông bao bọc vết thương. Trong đó mỗi một thành phần đóng một vai trò nhất định trong quá trình hình thành cục đông máu. Các thành phần và vai trò của chúng được chú thích trong bảng 1.1 1.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ - ĐHQGHN KHOA VẬT LÝ KỸ THUẬT Nguyễn Viết Tuấn BIỂU HIỆN, TINH SẠCH THROMBIN TÁI TỔ HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA BĂNG GẠC CÓ GẮN THROMBIN KẾT HỢP VỚI NANO BẠC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY Khoa: Vật Lý Kỹ Thuật Công Nghệ Nano HÀ NỘI 2016 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ - ĐHQGHN KHOA VẬT LÝ KỸ THUẬT Nguyễn Viết Tuấn BIỂU HIỆN, TINH SẠCH THROMBIN TÁI TỔ HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA BĂNG GẠC CÓ GẮN THROMBIN KẾT HỢP VỚI NANO BẠC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY Khoa: Vật Lý Kỹ Thuật Công Nghệ Nano Cán hướng dẫn: TS Đỗ Thị Tuyên Cán đồng hướng dẫn: TS Hà Thị Quyến HÀ NỘI 2016 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn cô TS Đỗ Thị Tuyên cô TS Hà Thị Quyến thầy cô khoa tận tình hướng dẫn, bảo trình làm khóa luận tốt nghiệp vừa qua Em xin chân thành cảm ơn anh chị Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam tạo điều kiện tốt giúp em thực thực nghiệm trình làm đề tài khóa luận Em xin chân thành cảm ơn tới Thầy, Cô giảng dạy em năm học tập tập thể lớp K57V động viên giúp đỡ trong suốt thời gian học tập qua Cuối em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè người động viên tạo điều kiện thuận lợi để em yên tâm học tập Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực khóa luận Nguyễn Viết Tuấn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung khóa luận kết công trình nghiên cứu riêng hướng dẫn TS Đỗ Thị Tuyên TS Hà Thị Quyến Tất tài số liệu đưa hoàn toàn trung thực chưa công bố tài liệu hay ấn phẩm khác Các tài liệu tham khảo dẫn rõ ràng nguồn gốc xuất xứ nêu mục lục cuối khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, Ngày Tháng Năm 2016 Sinh viên thực khóa luận Nguyễn Viết Tuấn CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt ĐC Ý nghĩa Đối Chứng Kb LB Kilo base Môi trường Luria Bertani BSA kDa M Bovine serum albumin Kilo Dalton Marker OD SDS-PAGE Optical density Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis v/v w/v Volume/ volume (thể tích / thể tích) Weight/ volume (khối lượng / thể tích) Mục lục MỞ ĐẦU 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thrombin chế đông máu 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Cấu trúc chế hoạt động thrombin 1.1.2.1 Thành phần máu 1.1.2.2 Cơ chế đông máu thrombin 1.1.2.3 Cấu trúc chức thrombin 1.1.3 1.2 Ứng dụng thrombin 12 Nano bạc 12 1.2.1 Các đặc trưng, tính chất vật lý hạt nano bạc 12 1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn 13 1.2.3 Các phương pháp chế tạo 15 1.3 Tổng quan chủng vi sinh vật 15 1.3.1 Escherichia coli 15 1.3.2 Tụ cầu Staphylococcus 16 1.4 1.5 Tình hình nghiên cứu giới 16 Tình hình nghiên cứu nước 18 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1 Nguyên liệu thiết bị 20 2.1.1 Chủng nuôi cấy 20 2.1.2 Hạt nano bạc 20 2.1.3 Hóa chất 20 2.1.4 Dung dịch đệm 20 2.1.5 Môi trường nuôi cấy 21 2.1.6 Thiết bị thí nghiệm 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Các phương pháp vi sinh vật 22 2.2.1.1 Hoạt hóa chủng giống 22 2.2.1.2 Nuôi biểu 22 2.2.2 Các phương pháp hóa sinh 23 2.2.2.1 Điện di protein gel polyacrymide (PAGE) 23 2.2.2.2 Xác định nồng độ protein 24 2.2.2.3 Tinh protein tái tổ hợp 25 2.2.2.4 Phương pháp loại đuôi his-tag khỏi protein tái tổ hợp 25 2.2.2.5 Phương pháp xác định chuyển hóa fibrinogen 26 2.2.2.6 Phát thrombin chất đặc hiệu Chromozym TH 26 2.2.3 Các phương pháp phân tích hạt nano 27 2.2.3.1 Phương pháp quang phổ UV-Vis 27 2.2.3.2 Phương pháp nhiễu xạ ánh sáng 27 2.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn băng gạc có gắn nano bạc kết hợp với thrombin 28 2.2.4.1 2.2.4.2 Gắn gắn nano bạc thrombin lên hệ băng gạc urgo 28 Đánh giá hiệu suất kháng khuẩn băng gạc gắn hệ nano 28 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Biểu thrombin tái tổ hợp 30 3.2 Tinh thrombin tái tổ hợp 32 3.3 Hoạt tính chuyển hóa fibrinogen thrombin 34 3.4 Xác định hoạt tính với chất đặc hiệu Chromzym TH 36 3.5 Xác định hàm lượng kích thước nano bạc 37 3.6 Hoạt tính Ag-thrombin băng gạc 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 47 DANH MỤC BẢNG Chƣơng Bảng 1 Các yếu tố chức chúng trình đông máu Chƣơng Bảng Các đệm, dung dịch thành phần chúng 21 Bảng 2 Các thiết bị thí nghiệm 22 Bảng Thành phần gel cô gel tách 23 Chƣơng Bảng Độ hấp phụ Absorbance mẫu OD 600nm 39 Phụ lục Bảng Trình tự gene prothrombin với 622 nucleotide 47 Bảng Bảng chức đoạn gene mã hóa 48 DANH MỤC HÌNH Chƣơng Hình 1 Những vai trò thrombin Tham gia đông máu, tính đa hiệu gene, thuốc chống đông máu, tiêu sợi huyết quy trình pleiotropic tạo thành mạch biểu gene [6] Hình Cơ chế hình thành đông máu yếu tố thể Hình Cơ chế hình thành huyết khối có mặt thrombin Hình Nồng độ thrombin giai đoạn đông máu Hình Cấu trúc thành phần gene DNA enzyme thrombin Hình Prothrombin cắt để tạo thrombin dạng hoạt động 10 Hình Cấu trúc không gian axit anmin vị trí cắt thrombin 11 Hình (A) dung dịch nano bạc với mật độ 20, 200, 400, 600 ppm; (B) màu sắc dung dịch bạc với hình dạng tương ứng 12 Hình (A) Màu sắc; (B) phổ hấp thụ hạt nano bạc kích thước hạt khác 13 Hình 10 Khả liên kết ion hạt nano bạc với thành tế bào ligand tự nhiên; Sự khác biệt pH thành phần tế bào 13 Hình 11 Cơ chế tương tác Ag+ nano bạc với thành phần thành tế bào, ti thể DNA bào vi sinh vật 14 Chƣơng Hình Chủng E coli BL21 mang gene thrombin tái tổ hợp nuôi hoạt hóa đĩa LB đặc có bổ sung ampicillin 22 Hình 2 Đường chuẩn xác định hàm lượng protein sử dụng BSA làm chuẩn 24 Hình (A) băng gạc, (B) urgo gắn nano bạc làm khổ đĩa thủy tinh không khí 28 Chƣơng Hình Điện di SDS-PAGE mẫu biểu thrombin từ chủng E coli BL21 biểu 28oC (1, 3, 6: mẫu tế bào thu 0, 3, giờ; 2, 4, 7: mẫu dịch thu 0, 3, giờ; mẫu cặn sau giờ; 8, 9: cặn dịch tế bào sau phá với enzyme lyzozyme giờ) 30 Hình Ảnh điện di SDS-PAGE phân tích hàm lượng protein tái tổ hợp protein tổng số phần mềm dolphin-1D 31 Hình 3 Hàm lượng protein phân đoạn tinh thrombin qua cột sắc ký lực cột resin có chứa Ni2+ nuôi biểu nhiệt độ 28oC 37oC 33 Hình Điện di SDS-PAGE phân đoạn trình tinh thrombin tái tổ hợp qua cột Ni2+ (1: mẫu lên cột; 2: mẫu qua cột; 3, 4, 5: phân đoạn rửa; 6, 7, 8, 9: phân đoạn mẫu) 33 Hình Hoạt tính chuyển hóa fibrinogen với (A) mẫu thrombin tái tổ hợp chưa tinh qua cột Ni2+ ; (B) thrombin tinh (bổ sung , , 10 , 15 lumbrokinase tương ứng với ô 1, 2, 3, 4) 35 Hình (A) hoạt tính thrombin với mẫu fibinogen không chứa nano bạc; (B) có bổ sung 400 l Ag mẫu M1(bổ sung , , 10 , 15 lumbrokinase tương ứng với ô 1, 2, 3, 4) 35 Hình Hoạt tính thrombin mẫu với chất đặc hiệu Chromzym TH 36 Hình Hệ phân bố kích thước hạt dung dịch keo nano bạc, (A) mẫu M1; (B) mẫu M2 37 Hình Ảnh thay đổi màu sắc hạt nano bạc vơi nồng độ khác 38 Hình 10 Phổ hấp thụ nano bạc nồng độ 20%, 50%, 100% 38 Hình 11 Khả kháng khuẩn nano bạc vi khuẩn (A) E coli; (B) Staphylocuccus aureus 39 Hình 12 Hoạt tính kháng khuẩn mẫu băng gạc có gắn thrombin kết hợp với nano bạc A vi khuẩn Staphylococcus aureus ; B chủng E coli 40 Hình 13 Khuẩn lạc đĩa LB đặc chải với chủng S aureus với mẫu băng gạc kháng khuẩn (1: ĐC; vi khuẩn nuôi LB lỏng chứa Ag 10%; 3: gạc gắn thrombin nano bạc; 4: gạc gắn nano bạc; 5: urgo gắn thrombin nano bạc; 6: urgo gắn nano bạc) 41 Hình 14 khuẩn lạc đĩa LB đặc chải với chủng E coli với mẫu băng gạc kháng khuẩn (1: ĐC; vi khuẩn nuôi LB lỏng chứa Ag 10%; 3: gạc gắn thrombin nano bạc; 4: gạc gắn nano bạc; 5: urgo gắn thrombin nano bạc; 6: urgo gắn nano bạc) 42 Hình 15 Hiệu suất kháng khuẩn mẫu băng gạc kháng khuẩn (A) vi khuẩn E.coli; (B) Staphylococcus 43 Kết biểu thrombin tái tổ hợp chủng E coli BL21 với khối lượng 37kDa, 35 kDa prtein gắn đuôi his-6 phân tử protein có có cấu trúc nhiều axit amnin histidin nên bám lên cột Ni+ Tuy nhiên, việc xuất protein có khối lượng 35 kDa với số lượng lớn biểu lơn tế bào protein hình thành từ plasmid có gắn đuôi his Trước sâu vào tiếp tục nghiên cứu tạm thời chấp nhận giả thuyết phần prethrombin-2 bị chuyển sang -thrombin trình biểu tinh Như kết prethombin đạt 37 kDa với kích thước tính toán theo lý thuyết thrombin tái tổ hợp Như vậy, cho thấy thrombin thu sau qua cột Ni+ tương đối Kết phù hợp với nghiên cứu giới như: Soejima cộng (2001) nghiên cứu biểu prethrombin-2 tái tổ chủng E coli JM109 Trong nghiên cứu nhóm biểu prethrombin-2 với khối lương 36 kDa Yonemura công (2004) biểu prethrombin-2 tế bào u tủy chuột Trong nghiên cứu nhóm biểu prethrombin-2 với khối lượng 37 kDa thrombin 35 kDa Lovgren cộng (2015) nghiên cứu đặc tính thrombin nguồn gốc từ prothrombin tái tổ hợp Trong nghiên cứu nhóm thu dược thrombin với khối lượng 37 kDa 3.3 Hoạt tính chuyển hóa fibrinogen thrombin Trên đĩa fibrinogen môi trường muối sinh lý NaCl 0,9%, sau bổ sung thrombin để tạo đông Quan sát thời gian đông đĩa fibrinogen ta nhận thấy thời gian đông mẫu thrombin tái tổ hợp yếu so với thrombin tự nhiên Với thrombin tự nhiên khoảng 3-5 phút để đĩa fibrinogen đông hoàn toàn Trong với thrombin tái tổ hợp sau 3-5 phút có xuất hiệu đĩa fibrin chuyển sang màu trắng đục fibrin Tuy nhiên, phải thêm vài để chúng đông hoàn toàn Nguyên nhân thrombin tái tổ hợp đuôi His chưa cắt thrombin nằm dạng tiền hoạt động chủ yếu Để chứng minh việc đĩa fibrinogen bị đông hình thành sợi fibrin từ fibrinogen xúc tác thrombin, mà tác nhân bên khác tiến hành thử đĩa fibrinogen đông hai mẫu thrombin sau bổ sung enzyme thủy phân fibrin lumbrokinase (Hình 3.5) 34 Hình Hoạt tính chuyển hóa fibrinogen với (A) mẫu thrombin tái tổ hợp chưa tinh qua cột Ni2+ ; (B) thrombin tinh (bổ sung , , 10 , 15 lumbrokinase tương ứng với ô 1, 2, 3, 4) Kết cho thấy fibrin bị thủy phân tạo thành hố tròn với kích thước phụ thuộc vào hàm lượng lumbrokinase đưa vào Qua chứng minh có mặt thrombin đĩa với có mặt fibrin sinh Các mẫu thrombin tinh chưa tinh khác biệt rõ rệt Để đánh giá ảnh hưởng nano bạc đến tính chất thrombin, tiến hành thử nghiệm mẫu thrombin thiên nhiên tinh từ phổi bò có hoạt tính cao quan sát thời gian đông mẫu Sau thử nghiêm với lumbrokinase thu kết (Hình 3.6) Hình (A) hoạt tính thrombin với mẫu fibinogen không chứa nano bạc; (B) có bổ sung 400 l Ag mẫu M1(bổ sung , , 10 , 15 lumbrokinase tương ứng với ô 1, 2, 3, 4) 35 Kết khác biệt với hai mẫu fibrinogen chứa 0,4% nano bạc Cho thấy việc sử dụng nano bạc vào hệ băng gạc cầm máu nhanh hiệu Nano bạc tác động tác động không đáng kể tới hoạt tính sinh học thrombin Xác định hoạt tính với chất đặc hiệu Chromzym TH 3.4 Sau thử hoạt tính thrombin đĩa fibrinogen Để đĩa fibrinogen bị đông tương tác với thrombin yếu tố khác gây ta tiến hành thử nghiệm với chất đặc hiệu Chromzym TH Xác định hoạt tính thrombin mẫu với đơn vị U/ml Do đặc thù máy UV-Vis đo mẫu nên tiến hành ủ chất đặc hiệu khoảng thời gian đủ dài để hàm lượng 4-nitranilede mẫu đạt gần với ngưỡng bão hòa dung dịch Qua thu kết sau đo OD bước sóng 405nm tính toán hoạt tính thrombin với chất đặc hiệu (Hình 3.7) Hoạt tính thrombin (U/ml) 0.5 0.4 thời điểm 15' 0.3 Thời điểm 40' 0.2 0.1 LC 28 QC 28 E3 28 E4 28 LC 37 QC 37 E3 37 E4 37 TN Các mẫu Hình Hoạt tính thrombin mẫu với chất đặc hiệu Chromzym TH Kết cho thấy phổ hấp thụ tập trung mẫu LC QC thrombin tự nhiên phân đoạn mẫu E3, E4 hai mẫu 28oC 37oC thấp Trong kết hình 3.2 cho thấy hàm lượng protein phân đoạn rủa giải E3 E4 cao, nơi protein có gắn đuôi His-6 giữ lại cột resin Với hàm lượng protein lớn có hoạt tính thấp Qua chứng minh thành phần protein tinh qua cột nickel có thành phần thrombin 36 protein có khối lượng 35 kDa -thrombin giả thiết đặt chúng có hoạt tính cao so với prethrombin-2 Kết cho thấy thrombin có gắn đuôi His-6 có hoạt tính thấp nên việc cắt bỏ đuôi His-6 sau trình tinh cần thiết Bản thân thrombin protease có khả cắt đuôi His-6 dẫn đến lượng thrombin không đuôi his-6 bị rửa trôi phân đoạn Điều dẫn đến thrombin bị chia làm nguồn có đuôi his-tag Vậy nên cần tìm phương pháp tinh khác phù hợp để tinh thrombin tái tổ hợp 3.5 Xác định hàm lƣợng kích thƣớc nano bạc Nhờ sử dụng máy đo tán xạ ánh sáng LB-550 để đo kích thước hạt nano bạc qua ta nhận kết phân bố nồng độ hạt (Hình 3.8) Hình Hệ phân bố kích thước hạt dung dịch keo nano bạc, (A) mẫu M1; (B) mẫu M2 Qua hình phân bố kích thước hạt ta nhận thấy mẫu M1 Các hạt nano bạc có kích thước phân bố tập trung khoảng 200-300 nm Đây kích thước lớn so với hạt nano bạc thông thường, hạt nano để thời gian dài bị tụ lại thành khối có kích thước lớn Mặc dù bọc polymer nhiên để 37 thời gian bảo quản có tác động ánh sáng làm polymer biến đổi cấu trúc tách khỏi hạt nano Còn mẫu mẫu thương mại phân bố kích thước hạt tập trung hai vùng khoảng 15-25 nm chiếm khoảng 20% 100-200 nm chiếm khoảng 30% Qua cho thấy hạt có kích thước không đồng đều, kết tụ lại dung dịch hạt nano bạc sau thời gian dài không bảo quản tốt Sau tiến hành đo UV-Vis với mẫu nano bạc M1 với nồng độ 20%, 50% 100% cuvette (hình 3.8) Hình Ảnh thay đổi màu sắc hạt nano bạc vơi nồng độ khác Sau đo phổ hấp thụ hạt nano bạc bước sóng khác máy quang phổ UV-Vis, qua thu phổ hấp thụ hạt nồng độ tương ứng với khác (Hình 3.10) Hình 10 Phổ hấp thụ nano bạc nồng độ 20%, 50%, 100% 38 Kết cho thấy phổ hấp thụ hạt có đỉnh hấp thụ nằm khoảng 400 nm đỉnh phổ hấp thụ đặc trưng hạt nano bạc Phổ hấp thụ bước sóng 400 nm cho thấy cường độ hấp thụ có tỉ lệ thuận với nồng độ hạt qua theo lý thuyết tính toán đượng nồng độ hạt dung dịch keo Tuy nhiên việc mẫu có kích thước hạt tương đương làm đối nên xác định nồng độ hạt phần dung dịch mẫu ban đầu 3.6 Hoạt tính Ag-thrombin băng gạc Để xác định hoạt tính kháng khuẩn hệ băng gạc có gắn thrombin kết hợp với nano bạc tiến hành thử nghiệm mẫu LB lỏng có chứa bạc 10% (Hình 3.11) Hình 11 Khả kháng khuẩn nano bạc vi khuẩn (A) E coli; (B) Staphylocuccus aureus Qua hình cho thấy mẫu M1 có màu suốt cho thấy dấu hiệu việc vi khuẩn phát triển hai chủng Với mẫu M2 lại thấy có màu đục có váng thành bình có chưa E coli điều cho thấy dấu hiệu ức chế phát triển vi khuẩn E coli mẫu M2 Trên thành bình váng dầu, thành phần mẫu M2 bị tách khỏi dung dịch Để xác định xác có mặt vi khuẩn hay không ta tiến hành đo OD 600nm thu kết bảng 3.1 Bảng Độ hấp phụ Absorbance mẫu OD 600nm Chủng vi khuẩn E coli S aureus Mẫu ĐC 1,632 0,417 Mẫu 0,113 0,091 Mẫu 1,609 0,066 39 Sau đo OD 600 để xác định mật độ sinh khối vi khuẩn bình thu kết cho thấy mẫu M1 diệt khuẩn tốt mẫu M2 ức chế Staophylococcus tốt, lại không thấy có dấu hiệu diệt khuẩn với chủng E coli Điều cho thấy thân thành phần mẫu M2 có khả tạo môi trường cho E coli sinh trưởng dung dịch có chứa nano bạc Ngoài mẫu M2 nuôi với E coli ta nhận thấy có xuất chấm váng dầu màu cam thành ống, thành phần giống tinh dầu có M2 tách khỏi dung dịch vi khuẩn E coli Do mẫu M1 có hoạt tính kháng khuẩn tốt nên tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn băng gặc có gắn mẫu nano bạc M1 chúng E coli Staphylococcus aureus thu kết (Hình 3.12) Hình 12 Hoạt tính kháng khuẩn mẫu băng gạc có gắn thrombin kết hợp với nano bạc A vi khuẩn Staphylococcus aureus; B chủng E coli Kết cho thấy với mẫu LB có bổ sung 10% nano bạc có màu vàng LB, không thấy dấu hiệu việc vi sinh vật phát triển Các mẫu gạc có màu đục chút nên nhiên mẫu đối chứng nhiều Với mẫu urgo có gắn nano bạc thrombin thấy hiệu tốt so với mẫu băng gạc thông thường với màu sắc gần suốt Kết phù hợp với tính chất nano bạc cho thấy hiệu ức chế vi sinh vật hệ băng gạc có gắn hạt nano Để xác 40 định hiệu suất kháng khuẩn mẫu băng gạc cách tạo khuẩn lạc đĩa LB đặc từ mẫu dung dịch chứa hệ kháng khuẩn (Hình 3.13) Hình 13 Khuẩn lạc đĩa LB đặc chải với chủng S aureus với mẫu băng gạc kháng khuẩn (1: ĐC; vi khuẩn nuôi LB lỏng chứa Ag 10%; 3: gạc gắn thrombin nano bạc; 4: gạc gắn nano bạc; 5: urgo gắn thrombin nano bạc; 6: urgo gắn nano bạc) Kết cho thấy mẫu Ag 10% mẫu urgo có gắn thrombin kết hợp với nano bạc có hiệu suất kháng khuẩn tốt, hiệu phát triển vi khuẩn Các mẫu băng gạc gắn nano bạc có hiệu suất kháng khuẩn có phần mẫu urgo, chúng ức chế phát triển vi khuẩn tốt với việc có khuẩn lạc đĩa Trong mẫu băng gạc có gắn thrombin kết hợp với nano bạc có hiệu suất kháng khuẩn hơn, thấy có phát triển mạnh hệ vi sinh vật Tuy nhiên, phát triển vi khuẩn Staphylococcus aureus mẫu băng gạc kháng khuẩn nhiều so với mẫu đối chứng Điều cho thấy băng gạc gắn thrombin kết hợp với nano bạc có hiệu ức chế phát triển vi sinh vật tốt thấp mẫu băng gạc gắn nano bạc đơn Hiệu suất ức chế thấp lượng nano bạc gắn lên băng gạc thông thường bởỉ có cạnh tranh vị trí không gian thrombin 41 Kết bước đầu cho thấy hiệu suất kháng khuẩn chủng S aureus, chủng vi khuẩn gram dương điển hình tốt Tiếp tục thực thực chủng E coli, chủng vi khuẩn gram âm phổ biến đánh giá qua khuẩn lạc đĩa LB đặc (Hình 3.14) Hình 14 khuẩn lạc đĩa LB đặc chải với chủng E coli với mẫu băng gạc kháng khuẩn (1: ĐC; vi khuẩn nuôi LB lỏng chứa Ag 10%; 3: gạc gắn thrombin nano bạc; 4: gạc gắn nano bạc; 5: urgo gắn thrombin nano bạc; 6: urgo gắn nano bạc) Kết cho thấy với mẫu chứa chủng vi khuản E coli có tương đồng với ức chế mẫu chưa vi khuẩn S aureus Trên mẫu urgo có vi khuẩn Các mẫu có gắn thrombin gạc urgo thường có hoạt tính kháng khuẩn so với mẫu gắn bạc đơn thuần, nhiên chúng có khả ức chế vi sinh vật tốt Tuy nhiên, với chủng E coli thấy có phát triển vi khuẩn mạnh so với chủng Staphylococcus với lượng khuẩn lạc biểu đĩa lớn mặt số lượng Thông qua việc đếm khuẩn lạc, bước đầu xác định hiệu suất ức chế hai chủng vi sinh khuẩn kiểm định Staphylococcus aureus E coli (Hình 3.15) 42 Hình 15 Hiệu suất kháng khuẩn mẫu băng gạc kháng khuẩn (A) vi khuẩn E.coli; (B) Staphylococcus Kết cho thấy việc gắn nano bạc kết hợp với thrombin lên băng gạc hiệu phù hợp với lý thuyết kháng khuẩn hạt nano Với hiệu suất ức chế vi khuẩn đạt 80% với mẫu băng gạc gắn thrombin kết hợp với nano bạc gần hoàn toàn với mẫu urgo gắn thrombin kết hợp với nano bạc với hiệu suất 99% Kết phần khả kháng khuẩn thành phần có urgo làm cho hiệu suất cao so với mẫu băng gạc gắn nano bạc Khả gắn nano bạc lên băng gạc cao So sánh với nghiên cứu Durán cộng (2007) gắn thành công hạt nano bạc lên băng gạc cầm máu với hiệu suất ức chế lên tới 99,9% vi khuẩn Staphylococcus[11] Điều cho thấy kết có thấp phù hợp với công trình nghiên cứu giới, qua tiếp tục tiến hành cải tiến quy trình để tăng hiệu suất kháng khuẩn băng gạc có gắn thrombin kết hợp với nano bạc 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Biểu thrombin tái tổ hợp chủng vi khuẩn E coli BL21 với mức độ biểu protein đạt 32% tổng hàm lượng protein tổng số tế bào Sau sử lý phần mềm Dolphin 1D Tinh thrombin tái tổ hợp qua cột Ni2+ với hàm lượng protein đạt 2,5 mg/ml Thrombin tinh có khối lượng phân tử 37 kDa thể điện di SDS-PAGE Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn băng gạc có gắn thrombin kết hợp với nano bạc hai chủng vi khuẩn kiểm định E.coli Staphylococcus aureus Kết bước đầu thu sau: - Đối với gạc gắn nano bạc: biểu kháng khuẩn đạt 96% 97% tương ứng hai chủng E coli S aureus Với gạc gắn nano bạc thrombin: hiệu suất kháng khuẩn đạt 80% E.coli 82% S aureus Với urgo gắn nano bạc: hiệu suất kháng khuẩn đạt 99,9% E.coli 100% S aureus Với urgo gắn nano bạc thrombin: hiệu suất kháng khuẩn đạt 99,3% E.coli 99,6 S aureus Kiến nghị Tối ưu phương pháp tinh để tăng suất thu hồi sản phẩm protein tái tổ hợp Sử dụng hệ hydrogel tương thích sinh học để hấp thụ nano bạc thrombin thay cho hệ băng gạc thông thường để tăng hiệu suất hấp thụ so với hệ băng gạc thông thường 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Thương, Nhân dòng, biều hiên tinh streptokinase tái tổ hợp Luận văn thạc sĩ, ĐH Khoa học tự nhiên-ĐHQGHN, (2011) N D Phuong, N Tuteja, L H Ham and colleagues, Expression and purification of recombinant protein NLI-IF from Escherichia coli, TAP CHI SINH HOC, 34(3), 347–353, (2012) Nguyễn Thị Hiền Trang, Nghiên cứu biểu staphylokinase tái tổ hợp Eschericia coli Luận văn thạc sĩ, ĐH Khoa học tự nhiên-ĐHQGHN, (2010) Nguyễn Thị Hồng Nhung cộng sự, Khảo sát hàm lượng Thrombin phổi số loại động vật ứng dụng làm vật liệu sản xuất băng gạc cầm máu tức thì, Tạp chí Y Học Việt Nam, 421(22), 1859-1868, (2014) Tài liệu tiếng Anh E.W Davie, J.D Kulman An, overview of the structure and function of thrombin, Semin Thromb Hemost, 32(1), 3–15, (2006) A Trapaidze, Integration of thrombin-binding aptamers in point-of-care devices for continuous monitoring of thrombin in plasma, UT3, (2015) N J Ospina, S J Villamizar, R González and colleagues, Utility of fibrin glue in therapeutic endoscopy Rev Colomb Gastroenterol, 24(3), 307–313, (2009) L Berliner, Thrombin: Structure and Function, Springer Science & Business Media, (2012) T Huang, X H Nancy Xu, Synthesis and Characterization of Tunable Rainbow Colored Colloidal Silver Nanoparticles Using Single-Nanoparticle Plasmonic Microscopy and Spectroscopy, J Mater Chem, 20(44), 9867–9876, (2010) 10 G Nam, S Rangasamy, B Purushothaman and colleagues, The Application of Bactericidal Silver Nanoparticles in Wound Treatment Nanomater Nanotechnol, 1, (2015) 11 S I Kargov, N I Korolev, O B Stanislavskiĭ and colleagues, [Interaction of immobilized DNA with silver ions], Mol Biol (Mosk), 20(6), 1499–1505, (1986) 12 N Durán, P D Marcato, G I H De Souza and colleagues, Antibacterial Effect of Silver Nanoparticles Produced by Fungal Process on Textile Fabrics and Their Effluent Treatment J Biomed Nanotechnol, 3(2), 203–208 (2007) 13 T J Foster, The Staphylococcus aureus “superbug”, J Clin Invest, 114(12), 1693–1696 (2004) 14 K Soejima, N Mimura, H Yonemura and colleagues, An efficient refolding method for the prearation of recombinant human prethrombin-2 and characterization of the recombinant-derived α-thrombin J.biochem, 130.269-277, (2001) 15 H Yonemura, Preparation of Recombinant -Thrombin: High-Level Expression of Recombinant Human Prethrombin-2 and Its Activation by Recombinant Ecarin J Biochem (Tokyo), 135(5), 577–582, (2004) 16 Harrysson et al Method for production of recombinant human thrombin Pub No.: US 2009/0047273 A1, (2009) 17 A Meta, M Hirashima, T Imamura and colleagues, High-yield preparation of recombinant human α-thrombin for therapeutic use J Biosci Bioeng, 120(4), 432–437, (2015) 45 18 J R Wiencek, J Hirbawi, V C Yee and colleagues, The Dual Regulatory Role of Amino Acids Leu480 and Gln481 of Prothrombin J Biol Chem, 291(4), 1565–1581, (2016) 19 M H Hefti, C J Van Vugt-Van der Toorn, R Dixon and colleagues, A novel purification method for histidine-tagged proteins containing a thrombin cleavage site Anal Biochem, 295(2), 180–185, (2001) 20 A Lövgren, J Deinum, S Rosén and colleagues, Characterization of thrombin derived from human recombinant prothrombin Blood Coagul Fibrinolysis, 26(5), 545-555, (2015) 21 R E Rumbaut, P Thiagarajan, Platelet-Vessel Wall Interactions in Hemostasis and Thrombosis, Morgan & Claypool Life Sciences, (2010) 22 G Franci, A Falanga and colleagues, Silver Nanoparticles as Potential Antibacterial Agents, Molecules, 20, 8856-8874, (2015) 23 S Gurunathan, J H Park and colleagues, Comparative assessment of the apoptotic potential of silver nanoparticles synthesized by Bacillus tequilensis and Calocybe indica in MDA-MB-231 human breast cancer cells: targeting p53 for anticancer therapy Int J Nanomedicine, 10, 4203–4223, ( 2015) 24 S Mukherjee, D Chowdhury, R Kotcherlakota and colleagues, Potential Theranostics Application of Bio-Synthesized Silver Nanoparticles (4-in-1 System) Theranostics, 4(3), 316–335, (2014) Tài liệu Website 25 Máu Wikipedia tiếng Việt, , (2015) 26 Thrombin , (2016) 27 New nanostuctures | Scaiano Group , (2016) 28 Dynamic Light Scattering for particle sizing and measurement of particle size distribution , (2016) 29 Escherichia coli Wikipedia, the free encyclopedia, , (2016) 30 Huyết máu Wikipedia < https://vi.wikipedia.org/wiki/Huy%E1%BA%BFt_thanh_m%C3%A1u>, (2016) 46 PHỤ LỤC Bảng Trình tự gene prothrombin với 622 nucleotide 10 20 30 40 50 60 MAHVRGLQLP GCLALAALCS LVHSQHVFLA PQQARSLLQR VRRANTFLEE VRKGNLEREC 70 80 90 100 110 120 VEETCSYEEA FEALESSTAT DVFWAKYTAC ETARTPRDKL AACLEGNCAE GLGTNYRGHV 130 140 150 160 170 180 NITRSGIECQ LWRSRYPHKP EINSTTHPGA DLQENFCRNP DSSTTGPWCY TTDPTVRRQE 190 200 210 220 230 240 CSIPVCGQDQ VTVAMTPRSE GSSVNLSPPL EQCVPDRGQQ YQGRLAVTTH GLPCLAWASA 250 260 270 280 290 300 QAKALSKHQD FNSAVQLVEN FCRNPDGDEE GVWCYVAGKP GDFGYCDLNY CEEAVEEETG 310 320 330 340 350 360 DGLDEDSDRA IEGRTATSEY QTFFNPRTFG SGEADCGLRP LFEKKSLEDK TERELLESYI 370 380 390 400 410 420 DGRIVEGSDA EIGMSPWQVM LFRKSPQELL CGASLISDRW VLTAAHCLLY PPWDKNFTEN 430 440 450 460 470 480 DLLVRIGKHS RTRYERNIEK ISMLEKIYIH PRYNWRENLD RDIALMKLKK PVAFSDYIHP 490 500 510 520 530 540 VCLPDRETAA SLLQAGYKGR VTGWGNLKET WTANVGKGQP SVLQVVNLPI VERPVCKDST 550 560 570 580 590 600 RIRITDNMFC AGYKPDEGKR GDACEGDSGG PFVMKSPFNN RWYQMGIVSW GEGCDRDGKY 610 620 GFYTHVFRLK KWIQKVIDQF GE 47 Bảng Bảng chức đoạn gene mã hóa Vị trí Độ dài Miêu tả – 24 24 Peptide tín hiệu 25 – 43 19 Propeptide 44 – 622 579 Prothrombin 44 – 198 155 Mảnh peptide hoạt hóa 199 – 327 129 Mảnh peptide hoạt hóa 328 – 363 36 Chuỗi nhẹ thrombin 364 – 622 259 Chuỗi nặng thrombin 48