Nghiên cứu thu nhận enzym endo ß 1 4 mannanase tái tổ hợp ứng dụng trong tẩy trắng bột giấy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN VIỆT PHƯƠNG Nghiên cứu thu nhận endo-β-1.4-mannanase tái tổ hợp ứng dụng tẩy trắng bột giấy LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội, 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN VIỆT PHƯƠNG Nghiên cứu thu nhận endo-β-1.4-mannanase tái tổ hợp ứng dụng tẩy trắng bột giấy LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS ĐẶNG THỊ THU Hà Nội, 2010 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Mannanase hay endo 1.4-β-D-mananase enzym thuộc nhóm hemicellulase xúc tác q trình thủy phân liên kết β-1.4-mannosidic mạch mannan giải phóng mannobiose, mannotriose, oligosaccarid lượng nhỏ mannose Trên giới, mannanase sản xuất quy mô cơng nghiệp Chế phẩm mannanase thương mại có ứng dụng nhiều ngành công nghiệp công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, chế biến thức ăn gia súc, dầu khí… Tuy nhiên, việc sử dụng mannanase ngành cơng nghiệp cịn hạn chế hiệu suất sinh tổng hợp enzym vi sinh vật tự nhiên thấp, chi phí sản xuất enzym cịn cao Mặt khác, chủng sinh tổng hợp mannanase tự nhiên thường đồng thời sinh tổng hợp nhiều loại enzym khác làm ảnh hưởng đến hiệu sử dụng enzym Với phát triển khoa học kỹ thuật đặc biệt phát triển kĩ thuật sinh học phân tử tạo tiềm lớn để sản xuất mannanase từ vi sinh vật Công nghệ gen cung cấp khả để hiển thị loại enzym mong muốn vật chủ mà không sinh tổng hợp enzym có liên quan, khơng cần tách tinh chế enzym số ứng dụng đạt hiệu mong muốn [31] Ở Việt Nam, tiềm ứng dụng mannanase lớn, ứng dụng ngành công nghiệp giấy hướng nghiên cứu trọng điểm thời gian qua, đặc biệt kể từ thấy rõ ứng dụng enzym tẩy trắng giấy Công nghiệp giấy ngành kinh tế quan trọng cần ưu tiên phát triển phù hợp với đường lối đổi kinh tế, với tiến trình cơng nghiệp hóa, đại hóa đất nước Bên cạnh đó, với thực trạng trước tình hình mới, vấn đề đáp ứng yêu cầu bảo vệ môi trường cơng nghiệp giấy cấp bách Vì song song với áp dụng biện pháp kịp thời xử lý chất thải, việc cải tiến công nghệ nhằm nâng cao hiệu kinh tế giảm thiểu ô nhiễm môi trường cần quan tâm mức Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Thực tế cơng nghiệp giấy giới cho thấy, có nhiều phương pháp hữu hiệu để giảm loại bỏ hoàn toàn việc sử dụng chất tẩy chứa clo, thay clo di oxit clo, ozon, hydropeoxit, …, [8] sử dụng enzym biện pháp hiệu phù hợp với xu hướng phát triển thời đại… Từ thực tiễn đặt làm để giảm lượng hóa chất tiêu tốn q trình sản xuất Bên cạnh đó, Việt nam chưa có công bố ứng dụng enzym mannanase tẩy trắng giấy Từ ý nghĩa quan trọng tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu thu nhận endo-β-1.4-mannanase tái tổ hợp ứng dụng tẩy trắng bột giấy ”  Nội dung nghiên cứu bao gồm: - Nghiên cứu thu nhận endo-β-1,4-mannanase tái tổ hợp quy mơ 5l - Nghiên cứu điều kiện thích hợp tiền tẩy trắng bột giấy gỗ cứng gỗ mềm (Nhiệt độ, pH, nồng độ enzym, nồng độ bột giấy, thời gian) - Nghiên cứu hiệu tiền tẩy trắng số chế phẩm enzym bột gỗ cứng gỗ mềm (Mannanase tái tổ hợp, xylanase thương mại, mannanase tái tổ hợp kết hợp với xylanase thương mại) - Xác định mức giảm hố chất q trình tẩy trắng sử dụng enzym bột gỗ cứng gỗ mềm Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan endo-β-1.4-mannanase 1.1.1 Chức endo-β-1.4-mannanase Endo 1.4-β-D-mananase (EC.32.1.78) enzym xúc tác thủy phân liên kết β1,4 – mannopyranozit mạch mannan heteropolysaccharide có chứa đường mannose, galactomannan, glucomannan Endo 1.4-β-D-mananase thủy phân glycoside polymannan tạo mano-oligosaccharide chuỗi oligosaccharide chứa D-manose, D-glucose D-galactose Mức độ cắt mạch mannan phụ thuộc vào tỉ lệ glucose mannose mạch Ví dụ: Bột glucomannan salep (glucose:mannose = 2:8) bị cắt nhiều so với glucomannan konjac (glucose:mannose = 66:100) Mức độ thay phân bố nhóm bên làm ảnh hưởng đến hoạt tính mannanase Nhóm bên galactosyl galactomannan nhóm acetyl hạn chế thủy phân mạch Ngồi khả thủy phân mannan, số mannanase chuyển đổi glucosyl Trong suốt q trình, oligosaccharide đóng vai trị chất nhận thay nước Đây nhóm enzym glucosidase, thủy phân liên kết glucoside mà giữ nguyên cấu hình [33] 1.1.2 Cấu tạo đặc tính endo-β-1.4-mannanase Mannanase nguồn gốc khác có thành phần cấu tạo cấu trúc khác Mannanase vi khuẩn ưa nhiệt Thermotoga neapolitana 5068 enzym cấu tử , có khối lượng phân tử 65 kDa Mannanase từ nấm Sclerotium rolfsii glycoprotein có khối lượng phân tử 46.5 kDa [24], mannanse từ Aspergillus Niger có khối lượng 45 kDa [10] Mannanase tách từ lồi nhuyễn thể biển Littovena reesei có khối lượng phân tử 42 kDa [33] Endo-beta-1,4-mannanase Pseudomonas cellulose bao gồm 423 axit amin, với cấu trúc chia thành vùng: vùng A từ prolin 44 đến isoleucin 323, vùng B từ Leucin 32 đến Tryptophan 360 vùng C từ Threonin 392 đến Threinin Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 419 Các chuỗi Arg 39- Lys 43, Arg 324-Gly 331, Arg 361-Thr 391 Leu 420-Lys 423 có chức nối vùng với Toàn phân tử endo-beta-1,4mannanase cấu tạo chuỗi xoắn α chuỗi β Hình 1.1 Cấu trúc không gian endo-beta-1,4-mannanase 26 A Pseudomonas cellulose (Đỏ: chuỗi α; Xanh lục: chuỗi β, Ghi: đoạn nối; Chấm: ZnSO ) Endo-beta-1,4-mannanase từ Tricoderma reesei bao gồm 344 axit amin tạo thành 16 chuỗi α 14 chuỗi β ngắn với cầu disulfit Trung tâm hoạt động enzym nằm hốc phân tử, enzym có năm miền tiếp xúc với chất, miền gắn với đơn vị monomer chuỗi polysaccarit trình xúc tác phản ứng Glu169 Glu276 nằm rãnh dọc theo bề mặt enzym có vai trị quan trọng trình xúc tác 1.1.2.1 Cấu tạo gen tái tổ hợp Endo – β-1.4- mannanase ứng dụng nhiều ngành công nghiệp công nghiệp giấy [14], thực phẩm, chế biến thức ăn gia súc, dược phẩm, dầu khí Việc sử dụng kĩ thuật khoa học đại đặc biệt kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu sản xuất mannanase quy mô công nghiệp ngày quan tâm Cho đến năm 1993 có trình tự nucleotide cơng bố [3], từ thấy rõ công dụng enzym việc tẩy trắng giấy số trình tự nucleotide công bố nhiều Các gen tách dịng, giải trình tự Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học biểu tế bào chủ khác E.coli [5], nấm men Saccharomyces cerevisiae [26], [27] Pichia Pastoris [32], [29] Các tế bào tái tổ hợp có khả sinh tổng hợp mannanase tái tổ hợp, mang đặc tính tương tự với enzym gốc Đã có số nghiên cứu nhân dòng gen endo – β-1.4- mannanase vi sinh vật để tạo biến chủng có khả sinh tổng hợp mannanase cao Gen mã hoá endo- β1.4- mannanase chịu nhiệt chủng Bacillus stearothermophilus nhân dòng biểu tế bào E.coli BL21 Gen endo- β-1.4- mannanase từ nấm Trichoderma reesei nhân dòng biểu nấm men S cerevisiae [27], tách dòng biểu thành công gen sinh tổng hợp endo-β-mannanase Aspergillus niger Yu QIAO cộng (2008) tiến hành biểu gen sinh tổng hợp endo-β-mannanase từ Bacillus subtilis Pichia pastoris 1.1.2.2 Đặc tính Mannanase có nguồn gốc khác có đặc tính khác Đặc tính số lồi nấm mốc, vi khuẩn động vật giới thiệu sau đây: Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Bảng 1.1 Một số đặc tính endo-β-mannanase tái tổ hợp Nguồn Hệ thống biểu t0 opt pH opt En Thermoanaerobact Man erium A polysaccharolyticu KLPT Tham khảo (kDa) Escherichia coli 50C- 5.8 116 750C Isaac K O Cann cs.,1998 m Man Clostridium Escherichia thermocellum BL21(DE3) coli 600C 6·5 70 Jonathan R Halstead cs.,1999 A 600C Aspergillus Aspergillus sojae fumigatus IMI Pichia pastoris Gökhan 5.2 Duruksu 450C 385708 Aspergillus 4.5 60 Pichia pastoris 00C cs.,2008 2.4 48 sulphureus MM Caldibacillus anA cellulovorans Chen XiaoLing, Escherichia coli 50C 6.0 Anwar Sunna CS,1999 d3 Bacillus sp.N16-5 Pichia pastoris 700C 6.0 Xiuping.,cs 2008 Bacillus subtilis Pichia pastoris 500C 5.5 40 Yu QUIAO cs., 2008 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 1.1.3 Cơ chế tác dụng β-1.4- mannanase 1.1.3.1 Cơ chất đặc hiệu β-1.4- mannanase Endo β-1.4- mannanase có tác dụng thủy phân liên kết β-1.4- mannosidic chuỗi polysaccaride galactomannan, glucomannan, galactoglucomannan mannan Sự thủy phân mannan hợp chất mannan β-1.4- mannanase tạo sản phẩm β-D mannooligosaccharides hỗn hợp oligosaccharides có chứa D-mannose, D-glucose D-galactose Mannan tinh khiết Mannan polysaccharides có chứa gốc đường mannose với tỷ lệ 90% Chúng dự trữ nội nhũ hạt cọ, hạt cần tây, hạt cà rốt, hạt cà phê xanh dần trình hạt nảy mầm Ngồi ra, mannan cịn chứa nhiều hạt chà cùi dừa, chiếm tỷ lệ lớn bã cơm dừa Hình 1.2 Cấu tạo mannan Mannan có ngơ, mì, mạch, cám gạo, cám mì, đặc biệt có nhiều loại khô dầu khô cọ (30-35%), khô dừa (25-30%), bột đậu guar (12-17%), khô dầu vừng, vỏ đậu nành Mannan chiếm thành phần nhỏ khô đỗ tương, khô lạc, khô hướng dương, khô cải (1,6-0,49%) Glucomannan Glucomannan phần sợi tách từ củ Amorphophallus Konjac, loại trồng phổ biến số nước Châu Á Glucomannan có khả hút nước lớn, gram glucomannan hấp thu khoảng 200 ml nước, dùng cho người ăn kiêng, sản xuất gạc khâu y tế Thành phần Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học glucomannan gồm gốc đường glucose mannose với tỷ lệ 5:8, gốc glucose mannose liên kết với liên kết β-1,4 glucoside Hình 1.3 Liên kết Glucose mannose Glucomannan Galactomannan Hình 1.4 Liên kết β 1.4 α 1.6 Galactomannan Galactomannan polysaccharides chứa gốc đường mannose khung nhánh galactose Các đơn vị mannopyranose mạch liên kết liên kết β-1,4 glucoside, mạch nhánh gốc galactose gắn vào mạch nhờ liên kết α-1,6 Galactomannan có nhựa gỗ cứng bạch đàn, nội nhũ hạt họ đậu hạt số thực vật khác Galactomannan sử dụng làm tăng độ nhớt sản phẩm công nghiệp thực phẩm Galactoglucomannan Galactoglucomannan cấu tạo từ mạch gồm đường glucopyranose mannopyranose Các gốc galactose gắn với mạch nhờ Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Christgau, S., Kauppinen, S., Vind, J.,Kofod, L.V., Dalboge, (1994) Expression cloning, purfication and characterization of beta-1,4-mannanase from Aspergillus aculeatus Mol Biochem Biol 33:917-925 10 Clark T A., A G McDonald, D J Senior, and P R Mayers (1990), “Mannanase and xylanase treatment of softwood chemical pulps:effects on pulp properties and bleâchbility”, Biotechnology in pulp and paper manufacture Butterworth-Heineman, Toronto, Canada P 153-167 11 Gibbs, M.D., Elinder, A.U., Reeves, R.A., Bergquist, P.L 1996 Sequencing, cloning and expression of a β-1,4-mannanase gene, manA, from the extremely thermophilic anaerobic bacterium, Caldicellulosiruptor Rt8B.4 FEMS Microbiol Rev 141:37-43 12 Gubitz, G.M., Sachslehler, A., Haltrick, D (2000), Microbial mannanase: substrate, production and application, American Chemical Society, p 236262 13 Gubitz, G.M cộng (1996) Two mannanases from Sclerotium rolfsii in total chlorine free bleaching of softwood kraft pulp Journal of biotechnology Volume 50, Issues 2-3, pp 181-188 14 Hogg, D., Pell, G., Dupree, P., Goubet, F., Martin-Orue, S.M., Armand, S H.J (2003) The mocular architecture of Cellvibro japonicus mannanases in glycoside hydrolase families and 26 points to differences in thier role in mannan degradtion Biochem J 371:1027-1043 15 Johana B., Matti S., Viikari L., Penttila M., Saloheimo A., Ranua M (1998), “Mannanase enzymes, genes coding for them and a method for isolating the genes, as well as a process for bleaching of lignocelluloic pulp” US Patent 5854047 16 Kansoh A.L., Nagieb Z.A (2004), “Xylanase and mannanase enzymes from Streptomyces galbus NR and their use in biobleaching of softwood kraft pulp”, Antonie Van Leeuwenhoek, 85 (2), pp 103-14 64 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 17 Kantelinen A., Hortling B, Sundquist J, Linko M, Viikari L (1994), “Proposed mechanism of the enzymatic bleaching of kraft pulp with xylanases” Holzforschung, (47), 318–324 18 Montiel M D cộng (2002) Evalution of an endo-β-1.4-mannanase produced by Streptomyces ipomoea CECT 3341 for the biobleaching of pine kraft pulps Applied microbiology and biotechnology, Vol 58, pp.67-72 19 Petr Baldrian (2005), Fungal laccases – occurrenceand properties Laboratory of Biochemistry of Wood- Rotting Fungi, Institute of Microbiology ASCR, Prague, Czech Repulic 20 Philip S., Daniel C (1999), Organization and differential regulation of a cluster of lignin peroxidase genes of Phanerochaete chrysosporium Journal of Bacteriology 11, Vol 181, pp 3427-3432 21 Pichia Fermentation Process Guidelines, Invitrogen TM life technologies, Verson B-053002 22 Pia Ademark cộng (1998) Softwood hemicellolose-degrading enzymes from Aspergillus niger: Purfication and properties of a betamannanase Jourcal of Biotechnology 63, pp 199-210 23 Politz, O., Krah M., Thomsen, K.K., Borriss, R 2000 A highly thermostable endo-β-1,4-mannanase from the marine bacterium Rhodothermus marinus Appl Microbiol Biotechnol 53:715-21 24 Sachslehler, A., Foild, N., Gubitz, G., Haltrick, D (2000), Hydrolysis of isolated coffe mannan and coffee extract by mannanase of Sclerrotium rolfsii Biotechnol J 80:127-`134 25 Samriti Dhawan, JagdeepKaur, Microbial Mannanase: An Ovieriew of Prodution and Application, Critical Review in Biotechnology, 27:197-216, 2007 26 Setari ME, Ademark P, van Zyl WH, Hahn-Hagerdal B, Stalbrand H (2001), “Expression of the endo-beta-1,4-mannanase encoding gene (man1) 65 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học in Saccharomyces cerevisiae and characterization of recombinant enzyme”, Protein Expr Purif., 21, pp 105-114 27 Stalbrand H, Saloheimo A, Vehmaanpera J, Hensrissat B, Penttila M (1995), Cloning and expression in Sacharomyces cerevisiae of a Trichoderma reesei beta-mannanase gene containing a cellulose binding domain Appl Environ Microbiol, 61(3):1090-7 28 Sunna, A., Gibbs MD., Chin, C.W.J., Nelson, PJ., Bergquist, P.L (2000) A gene encoding a novel multidomain β-1,4-mannanase from Caldibacillus celllovorans and action of recombinant enzyme on kraft pulp Appl Environ Microbiol 66:664-670 29 Tan XH, Wu YY, Ma LX, Jiang SJ (2005), Cloning and expression in Pichia pastoris of an alkanine mannanase gene Wei Sheng Wu Xue Bao, 45(4):543-6 30 Torres, A.L., Roncero, MB., Colom, J.F.,Pastor, F.I.J., Blanco, A., Vidal, T (1999), “Effect of a novel enzyme on fibre morphology during ECF bleaching of oxygen delignified Eucalyptus kraft pulps” Bioresource Technology 74 (2000) 135-140 31 Uogu A., Shimada M and Guchi T H (1980), ”Studies on lignin biodegraradation”, Holzforchung, 34, pp 86-89 32 Xu B, Sellos, Janson JC (2002), Cloning and expression in Pichia pastoris of blue mussel (Mytilus edulis) beta-mannanase gene Eur J Biochem; 269(6):1753-60 33 Yutaka, Tamaru, Toshiyoshi Araki, Hiroki Amagoi, Hisanori Mori and Tatsuo Morishita (1995), Purification and characterization of an extracellular β-1,4-D-mannanase from a marine bacterium Vibrio sp Strain MA-138 Applied and Environmental Microbiology, Dec, p.5554-4458 34 http://www.vietpaper.com 66 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học PHỤ LỤC Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ enzym Gỗ cứng Nồng độ enzym (U/g bột giấy) Đường khử Gỗ mềm Kappa Đường khử Kappa (mg/g bột) (mg/g) 0.17 15.01 0.11 16.23 40 1.24 13.79 1.06 15.13 50 1.29 12.83 1.19 14.67 60 1.92 12.60 1.43 14.40 100 2.02 12.55 1.52 14.32 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nồng độ bột giấy Nồng độ bột giấy %(w/v) Gỗ cứng Đường khử Gỗ mềm Kappa (mg/g) Đường khử Kappa (mg/g) 1.5 1.63 13.41 1.07 15.26 2.5 1.92 12.60 1.43 14.40 3.5 1.58 13.53 1.05 15.01 1.55 14.11 0.98 15.41 67 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Bảng 4.3 Ảnh hưởng pH Gỗ cứng pH sử dụng Đường khử Gỗ mềm Kappa (mg/g) Đường khử Kappa (mg/g) 3.5 0.27 13.85 0.25 15.36 4.5 1.92 12.60 1.43 14.40 5.5 1.37 13.56 1.26 14.61 6.5 0.34 13.96 0.12 16.23 Bảng 4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ Gỗ cứng Nhiệt độ (0C) Đường khử Gỗ mềm Kappa (mg/g) Đường khử Kappa (mg/g) 30 0.21 14.09 0.17 15.89 40 1.44 13.01 1.43 14 21 50 1.92 12.60 1.27 14.40 60 0.28 14.27 0.19 16.21 68 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Bảng 4.5 Ảnh hưởng thời gian Thời gian (giờ) Hệ số kappa Gỗ cứng Gỗ mềm 15.38 16.93 Kiểm chứng 15.01 16.23 13.24 15.35 3.5 12.60 14.21 12.21 13.95 10 12.05 13.50 Bảng 4.6 Hiệu tẩy trắng chế phẩm enzym Gỗ cứng Gỗ mềm Enzym sử dụng Kappa Kappa Kiểm chứng 14.69 16.23 Mannanase tái tổ hợp 12.6 14.21 Xylanase thương mại 10.53 12.92 Xylanase thương mại + mannanase tái tổ hợp 11.85 12.78 69 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Bảng 4.7 Kết lên men sinh tổng hợp mannanase quy mô 5l/mẻ Sinh khối (x2x108) Hoạt độ (U/ml) Thời gian pH 5.4 1.5 12 5.23 2.11 50 24 4.64 2.8 216 48 4.65 5.17 408 64 5.45 9.35 518 72 6.46 10.03 468 96 6.61 9.65 437 120 6.49 7.82 250 Trước chuẩn độ Sau chuẩn độ Hình 4.1 Thiết bị xác định trị số kappa bột giấy 70 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Máy xeo giấy L&W (Thụy Điển) Máy đo độ trắng L & W (Thuỵ Điển ) Hình 4.2 Thiết bị xác định độ trắng giấy Hình 4.3 Nguyên liệu tẩy trắng 71 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học b a c Hình 4.4 Phương pháp chụp bột giấy SEM (a Phủ platin lên mẫu; b Cho mẫu vào máy; c Kết hiển thị hình) 72 Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học Hình 4.5 Thiết bị lên men Viện CNTP 73 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan endo-β-1.4-mannanase 1.1.1 Chức endo-β-1.4-mannanase 1.1.2 Cấu tạo đặc tính endo-β-1.4-mannanase 1.1.3 Cơ chế tác dụng β-1.4- mannanase 1.1.4 Ứng dụng endo-β-1.4-mannanase .11 1.2 Môi trường, yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp endo-β-1.4mannanase 15 1.2.1 Môi trường sinh tổng hợp mannanase 16 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp mannanase 17 1.3 Nguyên liệu sản xuất giấy 18 1.3.1.Thành phần hóa học gỗ mềm 20 1.3.2.Thành phần hóa học gỗ cứng 21 1.4 Các phương pháp sản xuất bột giấy 21 1.4.1 Phương pháp học 22 1.4.2 Phương pháp hóa học 23 1.4.3 Phương pháp hóa học kết hợp enzym 24 1.5 Hệ enzym công nghiệp giấy .25 1.5.1 Hệ enzym phân hủy cellulose công đoạn nghiền học nghiền hóa học 26 1.5.2 Hệ enzym tẩy trắng giấy 27 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Vật liệu, hoá chất thiết bị 36 2.1.1 Vật liệu, chủng vi sinh vật nghiên cứu .36 2.1.2 Hóa chất 36 2.1.3 Thiết bị sử dụng 37 2.1.4 Môi trường dung dịch sử dụng 37 74 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 2.2 Phương pháp nghiên cứu .37 2.2.1 Phương pháp vi sinh 38 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 38 2.2.3.Phương pháp hóa học 41 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp mannanase từ Pichia pastoris quy mô 5l/mẻ.…………………………………… …………………………………… 45 3.2 Khảo sát khả tẩy trắng giấy sử dụng mannanase tái tổ hợp 45 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ enzym tới hiệu tiền tẩy trắng .47 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ bột giấy tới hiệu tiền tẩy trắng 48 3.2.3 Ảnh hưởng pH tới hiệu tiền tẩy trắng 50 3.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu tiền tẩy trắng 51 3.2.5 Ảnh hưởng thời gian tới hiệu tiền tẩy trắng 52 3.3 Cấu trúc xơ sợi bột gỗ cứng gỗ mềm trước sau sử dụng enzym 54 3.4 So sánh hiệu tiền tẩy trắng số chế phẩm enzym bột gỗ cứng gỗ mềm 55 3.5 So sánh hiệu tẩy trắng enzym bột gỗ cứng gỗ mềm 56 3.6 Xác định mức giảm hố chất q trình tẩy trắng sử dụng enzym bột gỗ cứng gỗ mềm 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC .62 75 Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học MỤC LỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc khơng gian endo-beta-1,4-mannanase 26 A Pseudomonas cellulose Hình 1.2 Cấu tạo mannan Hình 1.3 Liên kết Glucose manose Glucomannan Hình 1.4 Liên kết β 1.4 α 1.6 Galactomannan Hình 1.5 Galactoglucomannan Hình 1.6 Cơ chế tác dụng endo-beta-1,4-mannanase Hình 1.7 Cơ chế cắt endo β-1.4 mannanase chuỗi galactomannan 10 Hình 1.8 Cấu trúc thành phần gỗ 20 Hình 1.9 Sơ đồ cơng nghệ tổng qt sản xuất bột giấy giấy từ gỗ .24 Hình 1.10 Cấu trúc xylanase 28 Hình 1.11 Cơ chế tác dụng xylanase .29 Hình 1.12 Laccase thực oxi-hóa hợp chất hydroxyl tới gốc phenol 31 Hình 1.13 Cơ chế oxy hóa tiểu phần phenol lignin laccase 32 Hình 1.14 Cấu tạo lignin peroxydase 33 Hình 1.15 Chu trình hoạt động enzym lignin peroxidase 33 Hình 1.16 Chu trình hoạt hóa enzym manganese peroxidase 35 Hình 3.1 Động thái sinh tổng hợp mannanase từ Pichia pastoris…………… 43 Hình 3.2 Quy trình cơng nghệ lên men sinh tổng hợp mannanase từ Pichia pastoris ………………………………………………………………………….45 Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ enzym tới hàm lượng đường khử hệ số kappa gỗ cứng 47 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ enzym tới hàm lượng đường khử hệ số kappa gỗ mềm 47 Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ bột giây tới hàm lượng đường khử hệ số kappa gỗ cứng 49 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ enzym tới hàm lượng đường khử hệ số kappa gỗ mềm 49 76 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Hình 3.7 Ảnh hưởng pH tới hàm lượng đường khử hệ số kappa gỗ cứng 50 Hình 3.8 Ảnh hưởng pH tới hàm lượng đường khử hệ số kappa gỗ mềm 50 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hàm lượng đường khử hệ số kappa gỗ cứng 51 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hàm lượng đường khử hệ số kappa gỗ mềm 52 Hình 3.11 Ảnh hưởng thời gian tới hệ số kappa 53 Hình 3.12 Cấu trúc xơ sợi gỗ mềm quan sát kính hiển vi điện tử quét 54 Hình 3.13 Cấu trúc xơ sợi gỗ cứng quan sát kính hiển vi điện tử quét 54 Hình 3.14 Hiệu tiền tẩy trắng số chế phẩm enzym 56 Hình 3.15 Hiệu tẩy trắng số phương án sử dụng chế phẩm enzym bột gỗ cứng gỗ mềm…………………………………………………… 57 Hình 3.16 Sơ đồ quy trình tẩy trắng bột giấy có sử dụng enzym .58 Hình 3.17 Giảm hố chất tẩy trình tẩy trắng sử dụng enzym ………60 Hình 4.1 Thiết bị xác định trị số kappa bột giấy 70 Hình 4.2 Thiết bị xác định độ trắng giấy 71 Hình 4.3 Nguyên liệu tẩy trắng……………………………………………… 71 Hình 4.5 Phương pháp chụp bột giấy SEM……………………………… 72 Hình 4.6 Thiết bị lên men Viện CNSH 73 77 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc tính endo-β-mannanase tái tổ hợp Bảng 1.2 Chiều dài, đường kính sơ sợi tỉ lệ chiều dài đường kính sơ sợi số nguyên liệu thông dụng 19 Bảng 1.3 Một số phương pháp sản xuất bột 22 Bảng 1.4 Các enzym dùng q trình tẩy trắng bột giấy hóa học .26 Bảng 3.1 Hiệu tẩy trắng enzym bột gỗ cứng gỗ mềm .57 Bảng 3.2 Độ trắng mẫu gỗ cứng giảm thiểu hoá chất 59 Bảng 3.3 Độ trắng mẫu gỗ mềm giảm thiểu hoá chất 59 Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ enzym………………………… ……………67 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nồng độ bột giấy 67 Bảng 4.3 Ảnh hưởng pH 68 Bảng 4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ 68 Bảng 4.5 Ảnh hưởng thời gian .69 Bảng 4.6 Hiệu tẩy trắng chế phẩm enzymError! Bookmark not defined Bảng 4.7 Kết lên men sinh tổng hợp mannanase quy mô 5l……………….70 78 ... bố ứng dụng enzym mannanase tẩy trắng giấy Từ ý nghĩa quan trọng tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu thu nhận endo- β -1. 4- mannanase tái tổ hợp ứng dụng tẩy trắng bột giấy ”  Nội dung nghiên. .. trình tẩy trắng sử dụng enzym bột gỗ cứng gỗ mềm Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1 Tổng quan endo- β -1. 4- mannanase 1. 1 .1 Chức endo- β -1. 4- mannanase Endo 1. 4- β-D-mananase... (mm) Tỉ lệ (L/D) 4. 0 2.0 40 22 10 0 90 0.5 1. 1 1. 5 1. 7 2.8 10 13 20 15 60 11 0 12 0 80 18 0 0.25 20 55 13 0 2.8 30 20 10 20 20 40 24 21 20 20 25 10 00 2600 3500 250 13 0 15 00 10 00 19 Luận văn thạc sỹ