Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn mắc hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS), phân lập virus PRRS bằng tế bào MARC 145

luận văn, thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, khóa luận, đề tài

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

ðÀO THỊ NHÀN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA LỢN MẮC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRS), PHÂN LẬP VIRUS PRRS BẰNG TẾ BÀO MARC – 145

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : THÚ Y

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ LAN

HÀ NỘI - 2010

LỜI CAM đOAN

Tôi xin cam ựoan công trình nghiên cứu này là của riêng cá nhân tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này mà tôi sử dụng chưa từng ựược công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Tác giả luận văn

đào Thị Nhàn

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện ựề tài, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi ựã nhận ựược rất nhiều sự giúp ựỡ, hướng dẫn tận tình của các thầy giáo, cô giáo, các tập thể, cá nhân, bạn bè ựồng nghiệp trong và ngoài trường

Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ựến Cô giáo

TS Nguyễn Thị Lan, người ựã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi ựiều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học Tôi xin trân trọng cảm ơn:

- Các thầy cô giáo trong Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, ựã giúp tôi hoàn thành khóa học và nâng cao chất lượng luận văn

- Viện đào tạo sau ựại học, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã tạo ựiều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

- Ban Giám hiệu, các thầy cô giáo trường Trung học Nông lâm nghiệp Phú Thọ, nơi tôi công tác ựã tạo ựiều kiện ựể tôi yên tâm học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ựến những người thân, gia ựình ựã ựộng viên, giúp ựỡ tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 12 năm 2010

Tác giả luận văn

đào Thị Nhàn

2.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới và Việt Nam 3

2.7 Phương pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức 17

4.1 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS 25

4.2 Biến ñổi bệnh lý của lợn mắc PRRS 33

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CPE Cytopathogenic Effect (Bệnh tích tế bào)

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

IPMA Immuno - Peroxidase Monolayer Assay

OIE Organisation of International Epidemiology (Tổ chức Dịch tễ

học Thế giới) PBS Phosphate Buffer Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

RT - PCR Reverse Transcriptase - Polymerace Chain Reaction

VNT Virus Neutralization Test: phản ứng trung hòa virus

DANH MỤC BẢNG

4.4 Triệu chứng lâm sàng của lợn con theo mẹ, lợn sau cai sữa, lợn

4.5 Kết quả nghiên cứu một số bệnh tích ñại thể ở lợn mắc PRRS 33 4.6 Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch phổi của lợn mắc PRRS 39 4.7 Bệnh tích vi thể ở gan, lách, thận của lợn mắc PRRS 40 4.8 Bệnh tích vi thể ở ruột, hạch ruột, tử cung của lợn mắc PRRS 41 4.9 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch một số cơ quan của lợn mắc PRRS 44 4.10 Kết quả phân lập PRRSV trên môi trường tế bào Marc- 145 47

DANH MỤC HÌNH

Hội chứng PRRS ñược ghi nhận ñầu tiên ở Mỹ vào năm 1987, rất nhanh chóng lan sang Canada, các nước vùng châu Âu Năm 1998 bệnh phát ra ở châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản, thời gian ñầu vì chưa xác ñịnh ñược nguyên nhân nên có nhiều tên gọi: Bệnh bí hiểm ở lợn, bệnh tai xanh, hội chứng hô hấp

và xảy thai ở lợn Năm 1991, viện Thú y Lelystad (Hà Lan) ñã phân lập thành công virus Năm 1992, Hội nghị Quốc tế Tổ chức Thú y thế giới thống nhất tên gọi là Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn Cho ñến nay bệnh vẫn còn tồn tại và phát triển mạnh ở nhiều khu vực trên thế giới Vì vậy từ khi xuất hiện tới nay bệnh ñã gây không ít thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn của thế giới Nhận ñịnh của thế giới về PRRS là dịch ñịa phương của nhiều nước trên thế giới kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển, gây tổn thất rất lớn

về kinh tế Chưa có bất kỳ nước nào có thể thanh toán ñược PRRS

Ở Việt Nam, PRRS ñược phát hiện trên ñàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía nam năm 1997 Tháng 3/2007 tại 7 tỉnh thuộc ñồng bằng sông

Hồng sau ựó ở các tỉnh miền Trung, ựồng bằng sông Cửu Long.Theo báo cáo 18/7/2008 của Cục Chăn nuôi tổng số mắc 16.677 con, tiêu huỷ 14.799 con Nguy cơ dịch nổ ra ở bất cứ ựịa phương nào, bất cứ thời ựiểm nào là rất lớn ựặc biệt những tháng đông- Xuân, là mối nguy cơ bùng phát dịch bệnh vẫn tiềm ẩn ựối với việc phát triển chăn nuôi bền vững của Việt Nam

Cho tới nay, ở nước ta ựã có rất nhiều công trình nghiên cứu về PRRS

vì việc chẩn ựoán lâm sàng rất khó phân biệt với các bệnh khác ựặc biệt trong

ựó bệnh liên cầu khuẩn ở lợn có sự lây nhiễm chéo giữa lợn với người, có thể gây tử vong cho người Phân tắch ban ựầu về virus PRRS của Việt Nam tại

Mỹ xác ựịnh virus gây ra các ổ dịch tại Việt Nam là chủng ựộc lực cao Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ựang xem xét việc sử dụng vắc xin phòng PRRS nhập về Việt Nam vì dịch bệnh vẫn xảy ra trên nhiều tỉnh thành trong khi hiện nay hiệu quả bảo hộ của các vắc xin kể cả của Trung Quốc vẫn còn là vấn ựề gây tranh cãi giữa các nhà nghiên cứu Vì vậy ựã có rất nhiều nghiên cứu về Hội chứng PRRS ở Việt Nam nhưng tình hình dịch bệnh ở Quảng Ninh,

Thái Bình ựến nay chưa có nhiều tài liệu công bố

Vì vậy, ựể góp phần trong công tác chẩn ựoán bệnh nhanh, chắnh xác

phù hợp với tình hình thực tế chúng tôi tiến hành ựề tài:"Nghiên cứu một số ựặc ựiểm bệnh lý chủ yếu của lợn mắc hội chứng rối loạn sinh sản và hô

hấp (PRRS), phân lập virus PRRS bằng tế bào Marc Ờ 145Ợ.

1.2 Mục ựắch nghiên cứu

- Nhằm xác ựịnh ựược triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS

- Nhằm xác ựịnh ựược một số biến ựổi bệnh lý ựại thể, vi thể chủ yếu của lợn mắc PRRS

- Xác ựịnh ựược sự phân bố của virus PRRS trên các tổ chức của lợn bệnh và tiến hành phân lập virus PRRS bằng môi trường tế bào Marc -145

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới và Việt Nam

2.1.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ñược ghi nhận lần ñầu tiên trong các báo cáo về các thiệt hại của ngành công nghiệp chăn nuôi tại Mỹ Tại các ổ dịch biểu hiện các triệu chứng lâm sàng của PRRS ñã ñược báo cáo

ở Mỹ vào cuối những năm 80 của thế kỷ trước (1987) người ta thấy số lượng lợn chết trong ñiều kiện bình thường tăng lên và lợn chậm lớn Các triệu chứng lâm sàng bao gồm rối loạn sinh sản nghiêm trọng, viêm phổi ở lợn con sau cai sữa, chậm lớn, giảm năng suất và tỷ lệ tử vong tăng (Neumann và cs, 2005) [27] Khi ñó ñã có nhiều giả thuyết ñược ñặt ra, người ta cũng bắt ñầu kiểm tra sự bất thường ở ñường sinh sản của lợn giống nhưng vào thời ñiểm

ñó vẫn chưa thể biết ñược mối liên hệ của nguyên nhân gây ra tình trạng nêu trên., bệnh vẫn còn là một bí ẩn Hàng năm ước tính tiêu phí ngành công nghiệp chăn nuôi lợn ở Mỹ là 560 triệu USD cho bệnh tai xanh theo Neumann

và cs (2005) [27]

Rất nhanh chóng, năm 1988 bệnh tai xanh ñã lan sang nước láng giềng Canada và tiếp tục hoành hành trong khi ñó bí ẩn về căn bệnh vẫn chưa ñược giải mã

Hai năm sau các ổ dịch có các triệu chứng lâm sàng tương tự ñã ñược báo cáo ở CHLB ðức (1990) Năm năm sau (1991) kể từ khi có báo cáo ñầu tiên về bệnh, virus ñã ñược tìm thấy tại Hà Lan Các tác giả người Hà Lan ñã xác ñịnh ñược ñặc tính của virus sau khi thực nghiệm thành công các chỉ tiêu của ñịnh ñề Koch và virus ñược ñặt tên là virus Lelystad, là tên Viện Thú y ñã phát hiện ra virus (Terpstra và cs, 1991) [33] Sau ñó không lâu, virus PRRS

ñược Mỹ ñặt tên là ATCC VR – 2332) (Collin và cs, 1992) [11] ðứng trước những thiệt hại cũng như diễn biến phức tạp của bệnh, năm 1992, tại hội nghị quốc tế về bệnh tổ chức ở St.Paul, Minnesota, tổ chức Thú y thế giới (OIE) ñã chính thức ñặt tên cho bệnh này là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) (Nodelijk, 1996) [20]; (Weiland, 1999) [ 19]

Tính từ năm 2005 trở lại ñây, 25 nước vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục (trừ châu Úc và New Zealand) trên Thế giới ñã báo cáo phát hiện có PRRS lưu hành Con số thực tế sẽ còn khác rất nhiều Trong số các nước nêu trên có cả các nước có ngành chăn nuôi phát triển mạnh như Mỹ, Hà Lan, ðan Mạch, Anh, Pháp, ðức…

Hình 2.1 Bản ñồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới

Tại Trung Quốc, dịch bệnh PRRS ñã xuất hiện trong những năm gần ñây và hiện ñang còn tồn tại Theo Tian và cs ( 2007) [34] virus PRRS gây ra ñại dịch lây lan ở hơn 10 tỉnh thành của Trung Quốc làm chết 2.000 000con lợn, trong ñó có hơn 400.000 sảy thai, ñẻ non Tính từ ñầu năm ñến tháng 7/2007, dịch bệnh ñã xảy ra ở trên 25 tỉnh, với trên 180.000 lợn mắc bệnh và 45.000 con

chết Qua một số nghiên cứu với qui mô lớn, người ta ñã xác ñịnh virus gây bệnh PRRS tại Trung Quốc thuộc chủng Bắc Mỹ thể cường ñộc gây ra

Tại Thái Lan, một nghiên cứu quy mô rộng lớn từ năm 2000 – 2003 cho thấy các virus PRRS ñược phân lập từ nhiều ñịa phương gồm cả chủng Châu Âu và chủng Bắc Mỹ, trong ñó virus thuộc chủng Bắc Mỹ chiếm 33,58% Dịch bệnh PRRS lần ñầu tiên xuất hiện ở nước này vào năm 1989 và

tỷ lệ lưu hành huyết thanh của bệnh cũng thay ñổi khác nhau, từ 8,7% vào năm 1991 và trên 76% vào năm 2002 Nguồn gốc PRRS tại Thái Lan là do việc sử dụng tinh lợn nhập nội ñã bị nhiễm virus PRRS hoặc là do các ñàn nhập nội mang trùng

2.1.2 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam

Lần ñầu tiên trong lịch sử xuất hiện PRRS ở Việt Nam vào năm 1997, PRRS ñược phát hiện trên ñàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam Kết quả kiểm tra thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS theo Cục Thú y (2007) [2] Toàn bộ số lợn này ñã ñược xử lý vào thời gian ñó Tuy nhiên, trong những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% theo Bộ NN và PTNT(2007) [1]

Như vậy có thể thấy virus PRRS ñã xuất hiện và lưu hành tại nước ta trong một thời gian dài Tuy nhiên, kể từ khi xác ñịnh ñược lợn có kháng thể kháng virus PRRS ở ñàn lợn giống nhập từ Mỹ, tại Việt nam chưa từng có vụ dịch PRRS nào xảy ra

Dấu ấn quan trọng của dịch PRRS tại Việt Nam ñược bắt ñầu từ ngày 12/3/2007 khi hàng loạt ñàn lợn tại Hải Dương có những biểu hiện ốm khác thường sau ñó lây lan ra các tỉnh ñồng bằng Bắc Bộ, Trung Bộ và Nam Bộ gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi lợn (Tô Long Thành và cs, 2008) [9]

ðầu năm 2008 dịch tái xuất hiện ở nhiều xã thuộc tỉnh Hà Tĩnh và chỉ

1 tháng sau (tháng 4/2008) dịch ñã bùng phát ở 775 xã, phường thuộc 57 huyện thị của 10 tỉnh: Hà Tĩnh, Thanh Hoá, Quảng Nam, Nghệ An, Lâm ðồng, Thừa Thiên Huế, Thái Bình, Thái Nguyên, Ninh Bình và Nam ðịnh với tổng số lợn mắc bệnh khoảng 255.250 con, số chết và phải tiêu huỷ là 254.242 con ðây là ñợt dịch lớn nhất từ trước ñến nay

Cho ñến tháng 7 năm 2008 tổng số lợn mắc bệnh là 16.677 con, số chết

và buộc phải tiêu huỷ là 14.799 con Tình hình cho thấy virus gây bệnh ñã phân tán rộng và có khả năng bùng phát thành dịch lớn trên cả nước nếu không có biện pháp can thiệp kịp thời Ngày 18/2/2009 dịch PRRS trên lợn ñã xuất hiện lại tại tỉnh Quảng Ninh, dịch bùng phát tại huyện Yên Hưng, Quảng Ninh với tổng số 76 con ốm, trong ñó có 23 lợn nái và 53 lợn thịt Ngày 28/2/2009 ñã xuất hiện tại Duy Xuyên, Quảng Nam, cho ñến nay tình hình diễn biến của bệnh vẫn ñang vô cùng phức tạp chưa thể thống kê ñầy ñủ các thiệt hại do bệnh gây ra

Sau một thời gian dài khống chế thành công, ñến tháng 3/ 2010 dịch bệnh PRRS tái xuất hiện ở Hải Dương sau một thời gian lắng xuống rất nhanh chóng phát tán cả 3 miền Bắc, Trung, Nam Theo Cục thú y tính ñến 05/10/2010 cả nước trên 621.000 lợn mắc dịch, chết và tiêu hủy trên 336.000con Tình hình dịch PRRS vẫn ñang diễn biến phức tạp và không có chiều hướng giảm xuống (nguồn phòng dịch tễ Cục thú y)

2.1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

Virus xâm nhập vào Việt Nam cuối năm 1996 qua lợn nhập khẩu, sau

ñó lưu hành chủ yếu ở phía Nam và tuy lúc ñó ñã có nhiều thông báo về ñáp ứng huyết thanh dương tính ñối với virus PRRS trên lợn ở một số tỉnh phía Nam nhưng từ ñó cho ñến tháng 3/2007 không có thông báo nào về dịch, bệnh do virus PRRS trên lợn tại Việt Nam Do ñặc ñiểm của virus gây thể bệnh kinh ñiển nên từ khi xâm nhập vào Việt Nam cho ñến năm 2007, không

cĩ nghiên cứu về virus và về bệnh

Căn bệnh lần đầu tiên được phát hiện tại Bộ mơn Hố sinh - Miễn dịch

- Bệnh lý, Viện Thú y vào ngày 19/3/2007, khi phân lập được xác định là dương tính với RT – PCR đặc hiệu, nhưng chỉ chính thức được Cục Thú y cơng bố vào tháng 4/2007 trong Hội thảo chuyên ngành

Về chẩn đốn Hội chứng PRRS, trước tháng 3/2007, cả 9 phịng thí nghiệm của Cục Thú y (trừ phịng thí nghiệm của Cơ quan thú y vùng VI) khơng chẩn đốn bệnh này do các lý do trên Hiện nay các phịng thí nghiệm chẩn đốn đều sử dụng kỹ thuật RT- PCR để chẩn đốn bệnh PRRS

Trung tâm chẩn đốn Thú y Trung ương và Cơ quan thú y vùng VI tiến hành phân lập PRRSV đều đặn từ bệnh phẩm trên tế bào Marc – 145

Hiện tại chúng ta chưa cĩ một biện pháp hữu hiệu phịng chống được bệnh này, mặc dù theo đánh giá khơng chính thức Hội chứng PRRS đã trở nên khá phổ biến ở các trại chăn nuơi lợn tại Việt Nam

2.2 Virus PRRSV

2.2.1 Hình thái cấu trúc của virus PRRSV

Virus PRRSV là một virus ARN chuỗi đơn dương, virus được xếp vào giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales

Quan sát virus PRRSV dưới kính hiển vi điện tử thấy virus cĩ dạng hình cầu, cĩ vỏ bọc, trên bề mặt cĩ nhiều gai nhơ ra, kích thước 45 – 80 mm

và chứa nhân nucleocapxit kích thước 25 – 35 mm

Hình 2.2 Hình thái Virus PRRS

Sự nhân lên của virus không bị ảnh hưởng khi dùng hợp chất ức chế tổng hợp ADN là 5 – bromo – 2 – deoxyuridin, 5 – iodo-2- deoxyuridin và mitomicin C chứng tỏ acid nucleic ñó là ARN Sợi ARN này có khối lượng khoảng 15.1 kb

Hình 2.3 Hình ảnh cấu trúc hệ gen của virus PRRS

Virus PRRS có các loại Protein cấu trúc bao gồm:

• Nucleocapsid protein (N, ORF7) (ORF: open reading frame)

khoảng 14 – 15 kDa, ñây là protein vỏ bọc nhân

• Membrane protein (M, ORF6) khoảng 18 – 19 kDa là protein

2.2.2 Phân loại virus PRRS

Về tính ña dạng di truyền, virus PRRS có hai chủng chính: chủng virus

có nguồn gốc ở Châu Âu (virus Lelystad – LV) và chủng virus có nguồn gốc

ở Bắc Mỹ (VR- 2332) Ngoài sự khác biệt giữa các lần phân lập người ta ñã chứng minh ñược có sự biến dị di truyền mạnh trong cả hai typ phân lập Theo Murtaugh và cs (1995) [25], Nelsen và cs (1999) [26], Meng và cs (1995) [23] các chủng virus này gây bệnh trên ñộng vật cảm thụ với bệnh cảnh giống nhau nhưng chúng lại ñại diện cho 2 genotyp khác biệt

Những nghiên cứu gần ñây cho thấy có sự khác biệt về tính di truyền trong các virus ñược phân lập từ các vùng ñịa lý khác nhau Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay ñổi về chuỗi nucelotid khá cao ñến 20% Chủng Bắc Mỹ có 3 subtyp: VR- 2332, Taiwan và 807/94 phân lập

ở Canada Chủng Châu Âu có 2 subtyp: I 10 phân lập tại Hà Lan và Olot tại Tây Ban Nha Chính sự khác biệt và sự ña dạng về tính kháng nguyên, khả năng biến ñổi cấu trúc kháng nguyên của virus ñã làm tăng khó khăn cho việc sản xuất vacxin chống lại chúng

Người ta ñã phát hiện thấy chủng virus châu Âu tại một số vùng của Bắc Mỹ Ở châu Á, PRRS ñã trở lên khá phổ biến với sự có mặt của cả 2

chủng châu Âu và Bắc Mỹ, sự phân bố virus theo các vùng ñịa lý chỉ là tương ñối Các virus PRRS phân lập ñược ở châu Âu có cùng loại kháng nguyên nhưng khác biệt với các chủng của Bắc Mỹ

2.3.2 Phương thức truyền lây

Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn ốm, hoặc mang trùng và phát tán ra môi trường Tinh dịch của lợn ñực giống cũng ñược xác ñịnh là nguồn phát tán mầm bệnh, virus ở tinh dịch cũng có thể lây nhiễm

sang bào thai Ở lợn mẹ mang trùng, virus có thể lây nhiễm qua bào thai từ giai ñoạn giữa thay kỳ trở ñi và virus cũng ñược bài thải qua nước bọt và sữa Lợn trưởng thành có thể bài thải virus trong 14 ngày trong khi ñó lợn con và lợn choai bài thải virus tới 1 – 2 tháng

Virus có khả năng phân tán thông qua các hình thức: vận chuyển lợn mang trùng, phân tán theo gió (có thể ñi xa tới 3 km), qua bụi, bọt nước, dụng

cụ chăn nuôi và dụng cụ bảo hộ lao ñộng nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và có thể do một số chim hoang dã

Sự truyền lây qua không khí là quan trọng trong việc phát tán virus PRRS

Sự lây lan bệnh từ ñàn lợn này sang ñàn lợn khác thường theo tinh dịch khi phối giống Ngoài ra còn các ñường như kim tiêm, nước uống, không khí, , côn trùng, vật liệu nhiễm khuẩn, kí chủ không phải là lợn Ở Pháp 56% ñàn mắc bệnh do tiếp xúc với lợn bệnh, 20% do tinh dịch, 21% do vật dụng và 3%

từ những nguồn chưa xác ñịnh ñược

Zimmerman và cs, (1997) [37] ñã gây bệnh qua ñường miệng cho vịt trời, ngan, gà lôi với khoảng 104 TCID50/ ml virus PRRS Qua thí nghiệm có khả năng phân lập virus ở phân gà 5 ngày sau khi gây bệnh, gà lôi 5 ngày và

12 ngày, vịt trời khoảng 5 ngày Trong các thí nghiệm này triệu chứng lâm sàng không thấy ở bất kỳ loài chim nào và chúng không có sự thay ñổi phản ứng huyết thanh ñối với virus PRRS Nhưng có những nghiên cứu chứng minh rằng chim di trú (như vịt trời) có thể bị nhiễm, bởi vậy chúng có khả năng truyền virus ñi xa

Ở các cơ sở có lưu hành bệnh, môi trường bị ô nhiễm, bệnh lây lan quanh năm nhưng tập trung vào thời kỳ có nhiều lợn nái phối giống và bệnh phát sinh thành dịch, với tỷ lệ cao, lợn nái có hội chứng rối loạn sinh sản trong khi lợn con bị viêm ñường hô hấp phổ biến

Sự vận chuyển lợn bệnh, sự lây lan cục bộ qua khơng khí được coi như

là phương tiện truyền lây phổ biến nhất

2.3.3 Cơ chế sinh bệnh

Virus cĩ đặc điểm rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào phế nang ðây là tế bào duy nhất cĩ receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp phụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này

và phá huỷ nĩ Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau đĩ phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) ðại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng Do vậy lợn bệnh thường dễ dàng

bị nhiễm khuẩn kế phát

Cĩ nhiều báo cáo về nhiễm trùng kế phát ở đàn lợn trong ổ dịch PRRS, đặc biệt ở chuồng nuơi lợn sơ sinh Tác nhân chủ yếu liên quan đến nhiễm trùng kế phát là: Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Pasteurella multocida và Actinobacillus pneuropneumoniae, SIV, EMCV, virus giả dại (Aujeszky), Porcine cytomegalovirus, Porcine respiratory coronavirus và Porcine paramyxovirus

Các nhà nghiên cứu đã phân lập virus từ phổi, gan, lách và huyết thanh hoặc dịch cơ thể lợn con sinh ra cả sống và chết nhưng khơng phân lập được

từ thai chết khơ, họ cũng phát hiện kháng thể chống virus PRRS đặc hiệu trong dịch xoang ngực hoặc sữa đầu Dấu hiệu này chỉ ra rằng truyền bệnh qua nhau thai là phổ biến trong giai đoạn cuối kỳ chửa, nhưng cơ chế của giảm sinh sản cịn chưa được hiểu biết

Lợn nái cĩ virus trong huyết thanh sớm lúc 1 ngày sau khi tiêm truyền,

cĩ thể đốn là sau đĩ virus nhân lên ở đại thực bào phế nang Virus huyết kéo dài (lên tới 14 ngày) là điển hình ở lợn nái; vì vậy chúng cĩ đủ thời gian để tuần hồn máu, đưa virus tới nhau thai Virus vượt qua nhau thai và nhiễm vào thai như thế nào? Terpstra và cs (1991) [33] gợi ý rằng đại thực bào cĩ

thể ñi qua nhau thai, nhưng câu hỏi cần thiết ñưa ra liệu virus có liên quan ñến ñại thực bào cao trong máu hay không còn chưa biết rõ Chistianson và cs, (1992) [15] ñã tiêm virus vào trong tử cung có thai 45 - 49 ngày tuổi ñã chứng minh rằng ở giai ñoạn giữa thời kỳ mang thai giúp virus nhân lên nhưng chúng ít khi vượt qua nhau thai ở giai ñoạn này

Người ta ñã phân lập virus từ ñại thực bào phế nang, phổi, tim, thận, não, lách, hạch lâm ba, tuyến ức, amidan, tuỷ xương, bạch cầu mạch máu ngoại vi và huyết thanh Virus huyết có thể phát hiện ngay 1 ngày sau khi tiêm truyền, tuy nhiên 28 ngày phổ biến hơn Còn chưa biết rõ rằng liệu các

cơ quan trên có phải là nơi nhân lên của virus hay không hay chỉ ñơn thuần do kết quả dòng máu ñưa vào các mô

Hình 2.4 ðại thực bào bình thường Hình 2.5 ðại thực bào bệnh lý

2.4 Triệu chứng của lợn mắc PRRS

Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của hội chứng PRRS, các nhà khoa học ñã cho rằng: triệu chứng lâm sàng của lợn rất khác nhau và phụ thuộc vào các chủng virus, trạng thái miễn dịch của ñàn cũng như ñiều kiện quản lý chăm sóc

2.4.1 Lợn nái

Trong tháng ñầu tiên khi bị nhiễm bệnh lợn biếng ăn, sốt 400C – 410C, một số con tai chuyển màu xanh trong thời gian ngắn, tím ñuôi, tím âm hộ, sảy thai ở giai ñoạn ñầu Lợn nái trong giai ñoạn nuôi con thường biếng ăn, lười uống nước, viêm vú, mất sữa, ñộng dục lẫn lộn 5 – 10 ngày sau khi sinh) nái chậm lên giống Nếu bệnh kéo dài sẽ kế phát nhiều bệnh ghép và dẫn ñến

tử vong ðỉnh cao của bệnh là hiện tượng sảy thai, ñẻ non, thai chết lưu, thai

gỗ hàng loạt Lợn con ñẻ ra yếu ớt, tỷ lệ tử vong cao có thể lên tới 70%

2.4.2 Lợn ñực giống

Khi bị nhiễm bệnh, lợn thường bỏ ăn, sốt cao, ñờ dẫn hoặc hôn mê, một

số con có hiện tượng tai chuyển màu xanh ðặc biệt xuất hiện hiện tượng viêm dịch hoàn, giảm hưng phấn hoặc mất tính ñực, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh kém Lợn ñực giống rất lâu mới hồi phục ñược khả năng sinh sản

2.4.3 Lợn con theo mẹ

Thể trạng gầy yếu, lợn nhanh chóng rơi vào tình trạng tụt ñường huyết

do không bú ñược, mắt có dử màu nâu, sưng mí mắt và các màng quanh mắt, trên da xuất hiện những ñám phồng rộp, tiêu chảy, chân choãi ra, ñi run rẩy, lợn con rất dễ mắc các bệnh kế phát và tỉ lệ tử vong cao

2.4.4 Lợn con cai sữa và lợn choai

Lợn chán ăn, lông xơ xác, có biểu hiện ho nhẹ… Trong những trường hợp ghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi cấp tính, hình thành nhiều ổ áp

xe, thể trạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, hắt hơi, thở nhanh, chảy nước mắt, tỉ

lệ chết khoảng 15%

2.5 Bệnh tích của lợn mắc PRRS

2.5.1 Lợn nái mang thai

Trường hợp ñẻ non thì thấy có nhiều thai ñã chết, trên cơ thể chúng có nhiều ñám thối rữa (thai chết lưu) Trường hợp ñẻ muộn thì số thai chết lưu ít

hơn so với đẻ non song số lợn con sinh ra rất yếu, nhiều con chết trong lúc đẻ

do thời gian đẻ kéo dài

Mổ khám thấy bệnh tích tập trung ở phổi, phổi bị phù nề, viêm hoại tử

và tích nước, cắt miếng phổi bỏ vào bát nước thấy phổi chìm

2.5.2 Lợn nái nuơi con, lợn choai và lợn vỗ béo

Bệnh tích tập trung ở phổi Các ổ viêm thường gặp ở thuỳ đỉnh, song cũng thấy ở các thuỳ khác nhưng hầu như khơng xuất hiện đối xứng Các ổ viêm, áp xe thường cĩ màu xám đỏ, rắn chắc Mơ phổi lồi ra và cĩ màu đỏ xám loang lổ như tuyến ức hay như đá grannito Cắt miếng phổi nhỏ bỏ vào nước thấy miếng phổi chìm, chứng tỏ phổi đã bị phù nề tích nước nặng

Tim, gan, lách của lợn mắc PRRS cĩ bệnh tích khơng đặc trưng tuỳ thuộc vào sự kế phát các bệnh khác

Những lợn bị táo bĩn thì ruột chứa nhiều phân cục rắn chắc, niêm mạc ruột bị viêm nhưng ở những lợn tiêu chảy thì thành ruột mỏng trên bề mặt cĩ phủ một lớp nhầy màu nâu

2.5.3 Lợn con theo mẹ

Thể xác gầy, ướt Các biến đổi ở phổi giống như các loại lợn khác Ruột chứa nhiều nước, thành ruột mỏng và đơi khi thấy cĩ một số cục sữa vĩn khơng tiêu

2.6 Các phương pháp chẩn đốn PRRS

2.6.1 Chẩn đốn lâm sàng

Dựa vào triệu chứng lâm sàng theo Anette (1997) [13]: viêm phổi ở lợn con và lợn vỗ béo, triệu chứng đường sinh sản Tuy nhiên bệnh cĩ thể khơng điển hình theo lứa tuổi vì vậy trong chẩn đốn lâm sàng cần phân biệt bệnh PRRS vĩi các bệnh: viêm não Nhật Bản, bệnh giả dại, cúm lợn, viêm màng phối, suyễn, bệnh do Toxoplasma (Lê Văn Năm, 2007) [6]

2.6.2 Chẩn đốn bằng phương pháp giải phẫu bệnh

ðối với lợn con, lợn vỗ béo, lợn chuẩn bị xuất chuồng: Khi mổ khám thấy phổi rắn, chắc và cĩ vùng xám và hồng

Trên tiêu bản vi thể cho thấy viêm phổi kẽ tăng sinh đa điểm hoặc lan tràn làm vách phế nang dầy lên, giảm số lượng tế bào lympho trong các tổ chức lympho…

2.6.3 Chẩn đốn bằng phương pháp huyết thanh học

ðể phát hiện sự cĩ mặt của virus PRRS người ta cĩ thể sử dụng phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA); phương pháp miễn dịch enzym trên thảm tế bào một lớp và phản ứng trung hịa virus trên mơi trường

tế bào một lớp (VNT); phương pháp miễn dịch bệnh lý khi sử dụng kháng thể chuẩn để phát hiện virus cĩ trong mẫu bệnh phẩm lợn bệnh PRRS (Bưtner và

cs, 2000) [12] ; (Anette, 1997) [13]

Phương pháp ELISA cĩ thể chẩn đốn một số lượng mẫu huyết thanh lớn và kết quả nhanh Khi dùng phương pháp này cĩ thể phát hiện dược cả chủng virus cĩ nguồn gốc Bắc Mỹ và chủng cĩ nguồn gốc từ Châu Âu

Phản ứng trung hịa virus trên mơi trường tế bào một lớp (Virus neutralization test) là chỉ thị tốt nhất để đánh giá tình trạng bệnh trong quá khứ vì kháng thể trung hịa cĩ thể tồn tại ít nhất một năm (Anette, 1997) [13] Tuy nhiên phản ứng trung hịa virus kém nhạy hơn các phản ứng huyết thanh khác vì kháng thể trung hịa xuất hiện chậm hơn

Cĩ một thực tế là khi đánh giá kết quả của một phản ứng huyết thanh phải cân nhắc đến trạng thái miễn dịch của đàn sau khi được tiêm phịng vac-xin vì hiện tại chưa cĩ phản ứng huyết thanh học nào phân biệt được kháng thể do lợn mắc bệnh tự nhiên hay do tiêm phịng vac-xin (Anette, 1997) [13]

2.6.4 Kỹ thuật RT- PCR

Dùng phản ứng RT- PCR phân tích mẫu máu (được lấy trong giai đoạn

ñầu của pha cấp tính) ñể xác ñịnh sự có mặt của virus, ñây là phản ứng tương ñối nhạy và chính xác

Có thể phân lập virus PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch amidan,…tuy nhiên virus PRRS có ñặc ñiểm khó phân lập và khó quan sát bệnh tích tế bào Virus thích hợp nhất trên tế bào ñại thực bào ở phổi lợn, tuy nhiên mỗi lần phân lập ñều phải sản xuất lại tế bào, giữa các lô tế bào ñược sản xuất ra có sự biến ñổi khác nhau và ñộ mẫn cảm với virus PRRS cũng khác nhau Trong phòng thí nghiệm PRRS thích ứng trên các loại tế bào như: CL2621, PAM, Marc-145…trong ñó tế bào thận khỉ châu Phi Marc-145 thường ñược sử dụng nhiều nhất (Anette, 1997) [13]

2.7 Phương pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức

Là phương pháp khoa học tiên tiến ñược sử dụng rộng rãi trong Y học

ñể nghiên cứu các virus như: nuôi cấy, phân lập, giám ñịnh, chuẩn ñộ, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và ñặc biệt dùng các môi trường tế bào tổ chức ñể nuôi cấy các vac-xin virus

Với nhiều loại virus sự nhân lên của chúng tiến triển song song với sự thoái hoá của các tế bào nuôi, một số virus gây bệnh cho tế bào rất ñặc trưng Những biến ñổi có tính chất ñặc trưng ñó gọi là sự huỷ hoại của tế bào chủ (Cyto Pathogenic Effect - CPE) hoặc các ổ tế bào bị hoại tử Có những tế bào

bị nhiễm virus chưa ñến mức bị chết nhưng chức năng của tế bào này ñã bị thay ñổi

Căn cứ vào CPE khi quan sát trên kính hiển vi quang học có thể ñánh giá ñược hiệu quả nuôi cấy virus

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng, phạm vi ñịa ñiểm nghiên cứu

Nghiên cứu ñược tiến hành với ñối tượng là lợn nghi mắc PRRS ở

mọi lứa tuổi thuộc khu vực Quảng Ninh và Thái Bình, ở các nhóm khác nhau bao gồm:

- Lợn con theo mẹ

- Lợn con sau cai sữa

- Lợn choai

- Lợn nái mang thai

- Lợn nái nuôi con

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác ñịnh triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS

- Nghiên cứu biến ñổi bệnh lý ñại thể, vi thể của một số cơ quan của lợn mắc PRRS

- Xác ñịnh sự phân bố virus bằng kỹ thuât hoá mô miễn dịch

- Phân lập PRRSV trên môi trường tế bào Marc – 145

thuốc nhuộm eosin, mơi trường nuơi cấy DMEM, FSB, kháng sinh, DMSO, trypsin, EDTA, PBS, kháng thê kháng PRRS, kháng kháng thể tương ứng chẩn đốn PRRS, muối NaHCO3…

3.3.3 Dụng cụ

- Tủ lạnh, tủ ấm 370C, tủ sấy, buồng cấy vơ trùng

- Máy đúc tự động, máy cắt Microton, máy ly tâm lạnh, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp ảnh gel

- Các dụng cụ khác gồm: lam kính, kính hiển vi, bình nuơi cấy tế bào, ống eppendoft, pipet, găng tay…

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp quan sát

ðể xác định được triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS, chúng tơi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của lợn từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý đầu tiên ðồng thời dựa vào các đặc điểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thơng tin liên quan Tiến hành phân tích, thống kê để đưa ra những kết quả chính xác Xác định chính xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu cĩ ý

nghĩa vơ cùng quan trọng cho các bước thí nghiệm tiếp theo

3.4.2 Phương pháp mổ khám

ðể xác định được các biển đổi đại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PRRS cần tiến hành mổ khám những lợn cĩ biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Lợn bệnh được cố định cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sát và chụp ảnh Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch phổi, tim, gan, lá lách… ngâm trong formol 10% làm tiêu bản vi thể

3.4.3 Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý

Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ñổi ñại thể cần tiến hành làm tiêu bản ñể xác ñịnh bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ñúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE) theo phương pháp của Bộ môn Bệnh lý Thú y, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:

Cố ñịnh bệnh phẩm:

Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%

Vùi bệnh phẩm:

Tiến hành lần lượt các bước sau:

- Rửa focmol: Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h

- ðưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ñúc mẫu tự ñộng

Hệ thống máy chuyển ñúc mẫu tự ñộng bao gồm 12 bình

Cồn 1000 : 2 lần (mỗi lần 1 phút) Cồn 950 : 1 lần

Cồn 700 : 1 lần Cồn 500 : 1 lần + Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút

+ Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân tế bào)

Nhỏ Haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước

Sau ñó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:

Cồn 500 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 950 : 1 lần Cồn 1000 : 2 lần Rửa tiêu bản

+ Nhuộm Eosin (nhuộm nguyên sinh chất của tế bào)

Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5 – 10 phút, rửa nước

Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút

+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản ñi qua xylen

Chuẩn bị môi trường ñầy ñủ (DMEM, 10% FBS làm ấm trong tủ ấm

370C trong 30 phút trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy)

Bước 1: Giải ñông tế bào ở nhiệt ñộ phòng

Bước 2: Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào

Bước 3: Chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5 ml môi trường ñầy ñủ Bước 4: ðưa vào nuôi cấy và theo dõi sự phát triển của tế bào Giữ tế

bào ở 370C, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào

3.4.4.2 Cấy chuyển tế bào

Bước 1: Loại bỏ môi trường ñang nuôi, rửa tế bào bằng PBS (không

chứa Ca2+ hoặc Mg2+)

Bước 2: Trypsin hoá tách tế bào, sử dụng Trypsin – EDTA Thêm 7 ml

môi trường , trộn ñều chuyển sang ống ly tâm

Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn

màu trắng

Bước 4: Cân bằng môi trường và ñếm số tế bào, hoà tan tế bào trong 6

ml môi trường ñầy ñủ ðếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần

(10µl tế bào trong 990µl môi trường) Dùng buồng ñếm ñếm

số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào trong 1 ml

Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào ñến 2x105 tế bào/ml trong

môi trường ñầy ñủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15 m/bình T75)

Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 370C,

5%CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào

3.4.4.3 Thu tế bào

Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào chỉ khác ở bước 5 và bước 6

Bước 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5x106 tế bào/ml trong môi

trường ñầy ñủ có bổ sung 10% DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1 ml/ống

Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong tủ lạnh ở - 200C trong

2–3 giờ, chuyển sang – 800C qua ñêm, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng

3.4.5 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC)

Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) có quy trình tẩm ñúc bằng parafin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể

Các bước nhuộm

Bước 1: Làm sạch tiêu bản

Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương pháp làm tiêu bản vi thể Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất

Bước 2: Hoạt hóa enzym

Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp ướt ở 1210C/5 phút