- Xác ñị nh triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp quan sát
để xác ựịnh ựược triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của lợn từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý ựầu tiên. đồng thời dựa vào các ựặc ựiểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thông tin liên quan. Tiến hành phân tắch, thống kê ựể ựưa ra những kết quả chắnh xác. Xác ựịnh chắnh xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho các bước thắ nghiệm tiếp theo.
3.4.2. Phương pháp mổ khám
để xác ựịnh ựược các biển ựổi ựại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PRRS cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh. Lợn bệnh ựược cốựịnh cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ. Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sát và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch phổi, tim, gan, lá láchẦ. ngâm trong formol 10% làm tiêu bản vi thể.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 20
3.4.3. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ựổi ựại thể cần tiến hành làm tiêu bản ựể xác ựịnh bệnh tắch vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin Ờ Eosin (HE) theo phương pháp của Bộ môn Bệnh lý Thú y, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội. Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Cốựịnh bệnh phẩm:
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%.
Vùi bệnh phẩm:
Tiến hành lần lượt các bước sau:
- Rửa focmol: Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h. - đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tựựộng. Hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tựựộng bao gồm 12 bình.
Bình Hoá chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600C 1:00 2 Cồn 600C 1:00 3 Cồn 700C 1:30 4 Cồn 800C 1:30 5 Cồn 960C 1:30 6 Cồn 1000C 1:30 7 Cồn 1000C 1:30 8 Cồn 1000C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 21 đúc block
đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin
Cắt dán mảnh và cốựịnh tiêu bản
Cắt mảnh: bằng máy cắt microtom
Tãi mảnh: Tãi lát cắt bằng phẳng trên phiến kắnh trong nước ấm 480C. Sau ựó ựể tủấm 370C ựến khi bệnh phẩm khô là có thểựem nhuộm ựược.
Nhuộm tiêu bản
Các bước tiến hành:
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I : 6h
Xylen II : 6h Xylen III : 12h
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000 : 2 lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 500 : 1 lần
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút + Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân tế bào)
Nhỏ Haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước. Sau ựó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:
Cồn 500 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 950 : 1 lần Cồn 1000 : 2 lần Rửa tiêu bản
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 22 + Nhuộm Eosin (nhuộm nguyên sinh chất của tế bào)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5 Ờ 10 phút, rửa nước. Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản ựi qua xylen.
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Kiểm tra tiêu bản trên kắnh hiển vi quang học.
3.4.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào
3.4.4.1. Khôi phục tế bào
Chuẩn bị môi trường ựầy ựủ (DMEM, 10% FBS làm ấm trong tủấm 370C trong 30 phút trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy).
Bước 1: Giải ựông tế bào ở nhiệt ựộ phòng
Bước 2: Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bước 3: Chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5 ml môi trường ựầy ựủ.
Bước 4: đưa vào nuôi cấy và theo dõi sự phát triển của tế bào. Giữ tế
bào ở 370C, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
3.4.4.2. Cấy chuyển tế bào
Bước 1: Loại bỏ môi trường ựang nuôi, rửa tế bào bằng PBS (không chứa Ca2+ hoặc Mg2+).
Bước 2: Trypsin hoá tách tế bào, sử dụng Trypsin Ờ EDTA. Thêm 7 ml môi trường , trộn ựều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng.
Bước 4: Cân bằng môi trường và ựếm số tế bào, hoà tan tế bào trong 6 ml môi trường ựầy ựủ. đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 23 (10ộl tế bào trong 990ộl môi trường). Dùng buồng ựếm ựếm số tế bào trên kắnh hiển vi, tắnh số tế bào trong 1 ml.
Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào ựến 2x105 tế bào/ml trong môi trường ựầy ựủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15 m/bình T75).
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 370C, 5%CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
3.4.4.3. Thu tế bào
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào chỉ khác ở
bước 5 và bước 6.
Bước 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5x106 tế bào/ml trong môi trường ựầy ựủ có bổ sung 10% DMSO, chia huyễn dịch tế
bào vào các ống bảo quản 1 ml/ống.
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong tủ lạnh ở - 200C trong 2Ờ3 giờ, chuyển sang Ờ 800C qua ựêm, chuyển tế bào vào giữ
trong nitơ lỏng.
3.4.5. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry -
IHC)
Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) có quy trình tẩm ựúc bằng parafin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể.
Các bước nhuộm
Bước 1: Làm sạch tiêu bản
Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất.
Bước 2: Hoạt hóa enzym
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 24 Bước 3: Khử peroxydase nội sinh
Dùng H2O2 trong dung môi Methanol (1H2O2 30% : 9 Methanol. Ngâm tiêu bản trong 10 phút. Bước 4: Gắn kháng thể (KT) Nhỏ 80ộl KT PRRS/ tiêu bản để tủấm 370C hoặc 40C/ qua ựêm Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần) Bước 5: Gắn kháng kháng thể Nhỏ 2 giọt kháng kháng thể/ tiêu bản để tủấm 370C/1h Rửa PBS 3 lần (5 phút/lần) Bước 6: Cho cơ chất
Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 5 - 8 phút
Kiểm tra dưới kắnh hiển vi thường: nếu nhìn thấy màu thì rửa tiêu bản qua nước; nếu không thì ngâm tiếp tiêu bản trong DAB ựến khi nhìn thấy màu.
Bước 7: Nhuộm nhân tế bào bằng Haematoxylin (30s), làm sạch, gắn Baume canada lên lamen nhanh trên tiêu bản và quan sát bằng kắnh hiển vi quang học.
3.4.6. Phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào Marc - 145
Mẫu bệnh phẩm (2g) ựược nghiền nát bằng chày và cối vô trùng. Sau
ựó ựược ựồng nhất trong dung dịch DMEM (có bổ sung 10% kháng sinh, bảo quản ở -800C cho ựến khi sử dụng).
Mẫu ựã ựồng nhất ựược làm tan băng và ly tâm 10.000 vòng/phút/10 phút/40C. Dịch ly tâm ựược gây nhiễm vào khay 96 giếng ựã ựược phủ một lớp tế bào Marc -145. đặt trong tủ ấm và hàng ngày kiểm tra bệnh tắch tế bào (CPE). Những giếng tế bào có bệnh tắch ựược thu và bảo quản ở -200C ựể sử
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 25