solani ở điều kiện in vitro của dịch chiết lá xoan và hạt xoan trong dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau, bao gồm dịch chiết đã loại dung môi và dịch chiết chưa loại dung môi, dự[r]
(1)KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM FUSARIUM SOLANI GÂY BỆNH TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA DỊCH CHIẾT LÁ VÀ
HẠT XOAN (MELIA AZEDARACH)
Nguyễn Thị Thủy Tiên*, Lê Thanh Long Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế *Liên hệ email: nguyenthithuytien84@huaf.edu.vn
TÓM TẮT
Nghiên cứu thực nhằm đánh giá khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm mốc Fusarium solani gây bệnh thối hồng cà chua dịch chiết hạt xoan (Melia azedarach L.) Chất kháng nấm từ hạt xoan chiết xuất dung môi ethanol, bao gồm dịch chiết không tách dung môi (LEO), dịch chiết tách dung môi (LE) dịch chiết nhân hạt xoan (NE) Dựa khả ức chế phát triển đường kính tản nấm (ĐKTN) sinh khối nấm loại dịch chiết nồng độ khảo sát khác (0 mg/ml, mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40 mg/ml 80 mg/ml), kết nhìn chung cho thấy dịch chiết NE có khả kháng nấm cao nhất, dịch chiết LEO cuối dịch chiết LE Nồng độ ức chế hiệu 50% phát triển ĐKTN (Effective Concentration, EC50)của dịch chiết LEO, LE NE đạt 15,55 mg/ml, 18,95 mg/ml
14,15 mg/ml Đối với sinh khối nấm, giá trị EC50 dịch chiết LEO, LE NE đạt 8,45
mg/ml, 11,25 mg/ml 7,41 mg/ml Nghiên cứu mở triển vọng cho việc ứng dụng hoạt chất kháng nấm có nguồn gốc tự nhiên sản xuất nông nghiệp
Từ khoá: Fusarium solani, kháng nấm, xoan, Melia azedarach
Nhận bài: 07/03/2019 Hoàn thành phản biện: 27/03/2019 Chấp nhận bài: 31/03/2019
1 MỞ ĐẦU
Trong loài nấm mốc thuộc chi Fusarium gây thối cà chua sau thu hoạch, F solani ghi nhận lồi điển hình, chiếm 34% Các sợi nấm F solani dễ dàng thâm nhập sâu vào trái thông qua vết thương, hệ sợi nấm mở rộng vào trung tâm quả, giảm nhanh độ cứng, mô bị mục nát, sũng ướt bị bao phủ hệ sợi nấm màu trắng (Abu Bakar cs., 2013) Trong sản xuất nông nghiệp, điều kiện mơi trường nóng ẩm kết hợp với điều kiện bảo quản lạc hậu tạo điều kiện lý tưởng cho bùng phát nấm mốc sinh độc tố nấm (Cotty cs., 1994) Để phòng trừ bệnh thối cà chua F solani gây ra, cần có phương thức phịng trừ bệnh cho vừa đạt hiệu kháng nấm cao, vừa đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm thân thiện với môi trường
(2)khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm bệnh F solani gây hại cà chua sau thu hoạch dịch chiết nhân hạt xoan dựa đường kính tản nấm sinh khối chúng ni cấy mơi trường có bổ sung nồng độ dịch chiết khác
2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
Nấm Fusarium solani:được cung cấp phịng thí nghiệm vi sinh, khoa Cơ khí − Cơng nghệ, trường Đại học Nơng Lâm, Đại học Huế Nấm phân lập từ mẫu cà chua bị bệnh thối hồng Nấm F solani được nuôi cấy môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) PDB Một lít mơi trường có chứa 20 g dextrose, 20 g agar nước luộc 250 g khoai tây trắng, bổ sung nước cất vừa đủ Môi trường PDB (Potato Dextrose Broth) có thành phần tương tự mơi trường PDA khơng có chứa agar
Lá hạt xoan: Lá hạt xoan tươi thu hái từ xoan (Melia azedarach)
thành Phố Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế 2.2 Nội dung nghiên cứu
Đánh giá khả kháng nấm F solani điều kiện in vitro dịch chiết xoan hạt xoan dung môi ethanol nồng độ khác nhau, bao gồm dịch chiết loại dung môi dịch chiết chưa loại dung môi, dựa theo dõi phát triển đường kính hình thái tản nấm theo thời gian sinh khối nấm F solani
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thu nhận dịch chiết hạt xoan
Các hoạt chất kháng nấm hạt xoan chiết xuất dung môi ethanol Đối với lá, dịch chiết loại bỏ khơng loại bỏ dung môi trước sử dụng để khảo sát khả kháng nấm Đối với dịch chiết hạt, dung mơi loại bỏ hồn tồn Dịch chiết xoan không loại dung môi: Lá xoan sau hái rửa sạch, sau rửa lại cồn nước cất tiệt trùng, để Cho 50 g xoan rửa sạch, nghiền nhỏ cối vô trùng vào 100 ml dung môi ethanol methanol bình tam giác 250 ml Ngâm, lắc kỹ hỗn hợp 12 máy lắc Thu dịch chiết cách ly tâm (4000 rpm/phút, nhiệt độ phòng) Dịch chiết xoan không loại dung môi ethanol (LEO) có nồng độ 50% (w/v) bảo quản 4oC đến sử dụng (không ngày) (Mondall cs., 2009).
Dịch chiết có loại dung mơi: Các bước thực tương tự quy trình chiết xoan khơng loại dung mơi Tuy nhiên, q trình ngâm lắc lặp lại lần, lần 12 Dịch chiết tổng số đem loại dung môi thiết bị cô quay chân không 50oC đến khối lượng không đổi, thu dịch chiết xoan loại ethanol (LE), bảo quản 4oC đến sử dụng (không ngày) (Vũ Đăng Khánh, 2003)
(3)lại lần Dịch chiết tổng số đem loại dung môi ethanol thiết bị cô quay chân không nhiệt độ 50oC khối lượng không đổi, thu dịch chiết nhân hạt xoan (NE), bảo quản 4oC đến sử dụng (không ngày) (Vũ Đăng Khánh, 2003)
2.3.2 Đánh giá ảnh hưởng loại dịch chiết đến sinh trưởng phát triển nấm mốc F solani
Pha loãng dịch chiết ban đầu (50% w/v) thành dịch chiết có nồng độ thấp nước cất tiệt trùng đến nồng độ khảo sát khác nhau: mg/ml (đối chứng), mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40 mg/ml, 80 mg/ml sử dụng để khảo sát khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm F solani dựa trình theo dõi phát triển ĐKTN sinh khối nấm Thí nghiệm lặp lại lần cho loại dịch chiết khác
- Sự phát triển ĐKTN nấm mốc F solani
Cho 20 ml mơi trường PDA có bổ sung loại dịch chiết LEO, LE NE nồng độ nêu vào đĩa Petri đường kính cm, nồng độ thực đĩa Dùng dụng cụ đục lỗ kiểu nút chai lấy tản nấm có đường kính mm từ mép rìa khuẩn lạc nấm F solani sau ngày nuôi cấy 28oC đặt vào tâm đĩa Ủ đĩa 28oC, đánh giá ảnh hưởng dịch chiết đến phát triển nấm F solani dựa hình thái ĐKTN (mm) Hiệu lực ức chế, tính theo tỷ lệ ức chế tốc độ phát triển ĐKTN sau ngày nuôi cấy HLUC (%) = [(ĐKTN cơng thức đối chứng – ĐKTN cơng thức thí nghiệm)/ ĐKTN công thức đối chứng] x 100 (Al-Hetar cs., 2010)
- Sự phát triển sinh khối nấm mốc F solani
Cho 20 µl huyền phù bào tử nấm F solani vào bình tam giác có chứa 30 ml mơi trường PDB (Potato Dextrose Broth) có bổ sung dịch chiết LEO, LE NE nồng độ khảo sát Nuôi 28oC, lắc 180 vòng/phút ngày, thu sinh khối nấm cách lọc qua giấy lọc, sấy 55oC đến khối lượng không đổi HLUC (%) = [(Sinh khối nấm công thức đối chứng – Sinh khối nấm cơng thức thí nghiệm)/ Sinh khối nấm công thức đối chứng] x 100 (Al-Hetar cs., 2010)
2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu
Kết thí nghiệm phân tích phương sai nhân tố ANOVA (Anova single factor) so sánh giá trị trung bình kiểm định DUNCAN (Duncan’s Multiple Range Test) phần mềm thống kê SAS, phiên 9.13 Nồng độ ức chế hiệu 50% (Effective Concentration, EC50) nồng độ ức chế tối thiểu 90% (Minimum Inhibitory Concentration) phát triển nấm tác động dịch chiết LEO, LE NE tính theo phương trình hồi quy thu từ giá trị ĐKTN sinh khối khô đo lường q trình theo dõi thí nghiệm phần mềm Excel
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
(4)dõi ĐKTN hình thái tản nấm liên tục ngày ghi nhận Bảng 1, Bảng 2, bảng hình 1, hình 2, hình tương ứng với dịch chiết LEO, LE NE
Bảng 1 Ảnh hưởng dịch chiết LEO nồng độ khác đến phát triển ĐKTN F solani
Nồng độ dịch chiết LEO (mg/ml)
Đường kính tản nấm (mm) HLUC sau 168 giờ, % Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày
0 (ĐC) 12,07a 23,99a 37,07a 51,18a 61,52a 77,55a 89,62a 0,00a
5 6,11b 16,80b 34,26b 42,72b 54,54b 66,54b 74,02b 17,41b
10 0,00c 12,51c 28,82c 38,70c 46,25c 61,43c 67,05c 25,18c
20 0,00c 9,43d 18,44d 23,03d 29,51d 38,14d 43,59d 51,36d
40 0,00c 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 100e
80 0,00c 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 100e
Các giá trị trung bình ĐKTN theo cột có chữ in thường không sai khác mức ý nghĩa α = 0,05
Dịch chiết LEO có ảnh hưởng mạnh đến ĐKTN F solani ĐKTN trung bình nồng độ sau xử lý số liệu sai khác có ý nghĩa thống kê thời điểm quan sát, ngoại trừ ngày Tốc độ phát triển ĐKTN chậm đĩa có chất kháng nấm LEO, nồng độ cao, tốc độ phát triển chậm Nấm bị ức chế hồn tồn suốt q trình theo dõi nồng độ 40 mg/ml 80 mg/ml
Với dịch chiết loại dung môi ethanol, LE, xu hướng ức chế phát triển nấm F solani tương tự với tác dụng dịch chiết LEO Tức là, nồng độ dịch chiết tỷ lệ thuận với khả kìm hãm phát triển nấm Tuy nhiên, nhìn chung, khả ức chế sinh trưởng lên nấm F solani dịch chiết LE yếu so với dịch chiết LEO nồng độ Nấm chỉ bị đình chỉ sinh trưởng nồng độ khảo sát cao nhất, 80 mg/ml
Bảng 2.Ảnh hưởngcủa dịch chiết LE nồng độ khác đến phát triển ĐKTN F solani
Nồng độ dịch chiết LE (mg/ml)
Đường kính tản nấm (mm)
HLUC sau 168 giờ, % Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày
0 (ĐC) 12,07a 23,99a 37,07a 51,18a 61,52a 77,55a 89,62a 0,00a
5 11,70b 23,35b 36,15b 50,60b 60,65b 73,69b 78,73b 12,15b
10 10,86c 22,56c 31,47c 45,61c 54,07c 64,02c 74,71c 16,63c
20 8,33d 15,79d 22,56d 28,95d 38,18d 46,77d 50,06d 44,14d
40 0,00e 0,00e 6,40e 7,91e 8,97e 10,45e 11,64e 87,01e
80 0,00e 0,00e 0,00f 0,00f 0,00f 0,00f 0,00f 100,00f
Các giá trị trung bình ĐKTN theo cột có chữ in thường không sai khác mức ý nghĩa α = 0,05 mg/ml mg/ml 10 mg/ml 20 mg/ml 40 mg/ml 80 mg/ml
Hình Hình thái nấm F solani sau ngày ni cấy 28oC với có mặt dịch chiết LEO
(5)Đối với dịch chiết từ nhân hạt xoan, NE, khả ức chế phát triển ĐKTN F solani nhìn chung cao hai loại dịch chiết Tốc độ phát triển ĐKTN chậm, ĐKTN nhỏ nồng độ dịch chiết NE cao Nấm phát triển đĩa có nồng độ dịch chiết NE lớn 40 mg/ml sau ngày tất nồng độ sau ngày nồng độ 20 mg/ml
Bảng 3 Ảnh hưởngcủa dịch chiết NE nồng độ khác đến phát triển ĐKTN F solani
Nồng độ dịch chiết NE
(mg/ml)
Đường kính tản nấm (mm) HLUC
sau 168 giờ, % Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày
0 (ĐC) 12,07a 24,00a 37,07a 51,18a 61,52a 77,55a 89,62a 0,00a
5 7,46b 16,14b 29,20b 43,52b 54,75b 64,26b 77,06b 14,01b
10 5,70c 12,21c 23,77c 34,27c 43,59c 50,02c 60,17c 32,86c
20 0,00d 6,15d 12,90d 17,97d 23,86d 28,18d 33,23d 62,92d
40 0,00d 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 100,00e
80 0,00d 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 100,00e
Các giá trị trung bình ĐKTN theo cột có chữ in thường không sai khác mức ý nghĩa α = 0,05
Nấm F solani khơng có đường kính giảm dần theo chiều tăng nồng độ dịch chiết hạt xoan mà hình thái có biến đổi rõ rệt tác dụng chất kháng nấm Khi khơng có dịch chiết, tản nấm phát triển nhanh, sợi nấm thơ, có màu trắng đục Khuẩn lạc nấm trở nên đậm màu đĩa có diện dịch chiết, đĩa nấm đối chứng có màu trắng sáng Ngồi ra, sợi nấm khơng cịn xốp thơ mà trở nên mảnh mịn có mặt dịch chiết Ví dụ, có mặt dịch chiết LEO nồng độ mg/ml 10 mg/ml làm cho sợi nấm phát triển yếu có màu trắng kem Với nồng độ dịch chiết lớn hơn, 20 mg/ml, khuẩn lạc có màu ngả vàng, sợi nấm mịn dần từ ngồi vào trong, viền ngồi có màu vàng nhạt xung quanh
mg/ml mg/ml 10 mg/ml 20 mg/ml 40 mg/ml 80 mg/ml
Hình Hình thái nấm F solani sau ngày ni cấy 28oC với có mặt dịch chiết NE môi
trường PDA nồng độ khác
mg/ml mg/ml 10 mg/ml 20 mg/ml 40 mg/ml 80 mg/ml
Hình 2. Hình thái nấm F solani sau ngày nuôi cấy 28oC với có mặt dịch chiết LE
(6)Hình 4. HLUC phát triển ĐKTN F solani mơi trường PDA có bổ sung dịch chiết nồng độ khác sau ngày nuôi cấy 28oC
Giá trị trung bình HLUC theo cột nồng độ có chữ in thường không sai khác ở mức ý nghĩa α = 0,05
Hiệu lực ức chế phát triển ĐKTN loại dịch chiết hạt xoan sau ngày nuôi cấy 28oC so sánh, thể hình Có thể thấy rằng, dịch chiết LEO dịch chiết NE có khả đình chỉ hồn tồn sinh trưởng nấm mơi trường PDB nồng độ 40 mg/ml trở lên Dịch chiết NE, nồng độ mg/ml, có HLUC thấp dịch chiết LEO nồng độ cao hơn, 10 mg/ml 20 mg/ml, HLUC lại cao dịch chiết LEO Dịch chiết LE có HLUC thấp ba loại dịch chiết đem khảo sát đạt HLUC tối đa (100%) khả phát triển nấm mốc F solani nồng độ 80 mg/ml EC50 phát triển ĐKTN dịch chiết LEO, LE NE đạt 15,55 mg/ml, 18,95 mg/ml 14,15 mg/ml Các giá trị tính theo phương trình hồi quy: LEO: y = 34,625ln(x) – 44,936, R² = 0,915; LE: y = 35,502ln(x) – 54,368, R² = 0,942; NE: y = 34,498ln(x) – 41,388, R² = 0,946 Trong đó, MIC90 đạt 49,31 mg/ml, 58,50 mg/ml 45,21 mg/ml tương ứng với dịch chiết LEO, LE NE (cùng phương trình hồi quy trên)
3.2 Khả ức chế phát triển sinh khối nấm F solani dịch chiết hạt xoan Các dịch chiết khác có hiệu lực ức chế phát triển sinh khối nấm F solani không giống nhau, thể qua hình Nhìn chung, loại dịch chiết, nồng độ cao, khả kìm hãm sinh trưởng F solani mạnh, sợi nấm phân tán mơi trường ít, hiệu lực ức chế cao Nồng độ 40 mg/ml 80 mg/ml tất loại dịch chiết đình chỉ hồn tồn phát triển nấm bệnh Ở nồng độ nhỏ hơn, thấy dịch chiết nhân hạt xoan NE có hiệu lực ức chế vượt trội so với hai loại dịch chiết lá, LEO LE Trong đó, dịch chiết LE có hoạt tính kháng nấm yếu ba loại Với mg/ml dịch chiết, dịch chiết LE chỉ ức chế 23,34% phát triển nấm, hai dịch chiết
a
b
b
b
b a
a
a
a
a
a
a
a
c
c
c
b a
0 20 40 60 80 100
0 (ĐC) 10 20 40 80
Hiệu
lực
ức
ch
ế,
%
Nồng độ dịch chiết, mg/ml
(7)độ 20 mg/ml hai dịch chiết LEO NE việc kháng nấm, đạt 77,59% 78,07% Giá trị EC50 MIC90 dịch chiết LEO, LE NE đạt 8,45 mg/ml, 11,25 mg/ml 7,41 mg/ml 39,70 mg/ml, 41,50 mg/ml 39,20 mg/ml Các giá trị tính dựa phương trình hồi quy: LEO: y = 25,898ln(x) – 5,2449, R² = 0,932; LE: y = 30,637ln(x) – 24,076, R² = 0,937; NE: y = 23,995ln(x) + 2,0637, R² = 0,927
Hình HLUC phát triển sinh khối nấm F solani môi trường PDB có bổ sung dịch chiết
ở nồng độ khác sau ngày nuôi cấy 28oC
Giá trị trung bình HLUC theo cột nồng độ có chữ in thường không sai khác ở mức ý nghĩa α = 0,05
Trong nghiên cứu này, nhìn chung dịch chiết NE có khả kháng nấm F solani cao so với dịch chiết LEO LE, ngoại trừ nồng độ có HLUC 0% 100% tất loại dịch chiết Tuy nhiên, khả kháng nấm dịch chiết LEO NE gần tương đương nồng độ 40 mg/ml môi trường PDA 20 mg/ml môi trường PDB Cơ chế kháng nấm dịch chiết hạt xoan nhờ vào hợp chất kháng nấm trích ly dung mơi ethanol vanillin, 4-hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde, and pinoresinol Khả kháng nấm kháng phận xoan hàm lượng chất kháng nấm phận không giống nhau, nhân hạt chứa nhiều chất kháng nấm so với (Carpinella cs., 2003)
Việc sử dụng xoan hay neem việc kháng nấm bệnh nông nghiệp báo cáo số nghiên cứu Hoạt chất kháng nấm từ lá, vỏ rễ xoan chiết xuất để khảo sát khả kháng nấm Colletrichum gloeosporoides gây bệnh thối mầm trái mãng cầu xiêm Với chất chiết xuất từ xoan, vào ngày thứ ba sau xử lý với nồng độ 100 mg/ml, 200 mg/ml 300 mg/ml, nấm bắt đầu sinh trưởng phát triển bị ức chế hoàn toàn nồng độ 400 mg/ml 500 mg/ml Đối với chất chiết xuất từ vỏ rễ xoan, nấm sinh trưởng phát triển vào ngày thứ tư sau xử lý nồng độ 100 mg/ml, 200
a
b
b
b
a a
a
a
a
a
a a
a
c
c
b
a a
0 20 40 60 80 100
0 (ĐC) 10 20 40 80
Hiệu
lực
ức
ch
ế,
%
Nồng độ dịch chiết, mg/ml