phân lập các hợp chất hướng tác dụng chống oxy hóa của cây móng bò leo (bauhinia bracteata benth fabaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ Nguyễn Thị Thu Hạnh PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA CỦA CÂY MĨNG BỊ LEO (Bauhinia bracteata Benth Fabaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ Nguyễn Thị Thu Hạnh PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA CỦA CÂY MĨNG BỊ LEO (Bauhinia bracteata Benth Fabaceae) Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Người cam đoan Nguyễn Thị Thu Hạnh Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2018 – 2020 Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 8720210 PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY MÓNG BÒ LEO (Bauhinia bracteata Benth Fabaceae) Nguyễn Thị Thu Hạnh Thầy hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn Từ khóa: Bauhina bracteata, ethyl gallat, acid gallic, hyperin, myricitrin Mở đầu: Móng bị leo (Bauhinia bracteata Benth Fabaceae) lồi mọc nhiều Đắk Lắk, thuộc chi Bauhinia, chi có nhiều lồi phổ biến Việt Nam…với thành phần hóa học chủ yếu flavonoid, tanin, acid hữu cơ,…có nhiều tác dụng sinh sinh học quan trọng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, trị đái tháo đường, tiêu chảy,….Cho đến nay, chưa có tác giả cơng bố kết nghiên cứu Móng bị leo nước giới Vì vậy, đề tài thực nhằm góp phần xác định thành phần hóa học chứng minh giá trị y học tác dụng chống oxy hóa thuốc Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Lá Móng bị leo (Bauhinia bracteata Benth Fabaceae) thu hái vào tháng 3/2019 phường Thành Nhất, thành phố Buôn Ma thuột, tỉnh Đắk Lắk Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát thực vật phân tích ADN, thử tinh khiết xác định chất chiết dược liệu, phân tích sơ thành phần hóa thực vật dược liệu; Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa cao Móng bị leo phương pháp DPPH; Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hợp chất hướng tác dụng chống oxy hóa; Xác định khả chống oxy hóa IC50 hợp chất phân lập; Xây dựng quy trình định lượng hợp chất phân lập Móng bị leo phương pháp HPLC Kết quả: Đã khảo sát đặc điểm hình thái thực vật, vi phẫu ADN thực vật Móng bị leo Kết thử tinh khiết cho thấy độ tro toàn phần 8,18%, tro không tan acid 0,40% độ ẩm 9,08% Hàm lượng chất chiết dược liệu cồn 80% 15,15% Thành phần hóa học Móng bị leo có nhiều flavonoid, tanin, acid hữu cơ, saponin,…Bằng phương pháp chiết ngấm kiệt cô quay, kết hợp với kỹ thuật chiết phân bố lỏng – lỏng, từ kg Móng bị leo thu 18 g cao n-hexan, 40 g cao cloroform 120 g cao ethyl acetat, cao ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Từ 60 g cao ethyl acetat phân lập hợp chất, bao gồm ethyl gallat (46 mg, độ tinh khiết sắc ký 98%), acid gallic (540 mg, độ tinh khiết 97%), hyperin (148 mg, độ tinh khiết 98%) myricitrin (38 mg, độ tinh khiết 96%) Các hợp chất phân lập có IC50 thấp so với acid ascorbic, acid gallic thấp (2,93 µg/ml) nên có hoạt tính chống oxy hóa mạnh mạnh gấp 2,95 lần so với acid ascorbic, ethyl gallat myricitrin gấp 2,73 lần, hyperin gấp 2,36 lần Đã xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời acid gallic hyperin phương pháp HPLC-PDA, sử dụng hệ pha động methanol – acid phosphoric 0,1%; pH 3,5 (40:60) cột C18 InertSustain (250 x 4,6 mm; µm) Quy trình chứng minh có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, giới hạn phát giới hạn định lượng thấp, độ xác độ cao, đáp ứng đầy đủ yêu cầu quy trình định lượng Kết luận: Kết nghiên cứu đề tài góp phần vào việc bổ sung sở liệu Móng bị leo, giúp định hướng cho nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Móng bị leo Master’s Thesis – Academic course: 2018 – 2020 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 ISOLATION OF NATURAL COMPOUNDS FOR ANTIOXIDANT ACTIVITIES FROM BAUHINIA BRACTEATA BENTH FABACEAE Nguyen Thi Thu Hanh Supervisor: Assoc Prof Dr Nguyen Duc Tuan Keywords: Bauhina bracteata, ethyl gallate, gallic acid, hyperin, myricitrin Introduction: Bauhinia bracteata Benth Fabaceae is a species that grows a lot in Dak Lak province, and belongs to the Bauhinia genus This genus contains many common species in Viet Nam that have the main chemical components such as flavonoid, tannin, organic acid,… with important bioactivities such as antioxidants, antibacterials, antiinflammatories, anti-hyperglycemias, and anti-diarrheas, … So far, there have been no published studies on phytochemicals and bioactivities of Bauhina bracteata Therefore, this study was conducted with the aim of contributing to determine chemical composition, and demonstrate antioxidant activity of Bauhina bracteata Materials and Methods Object of study: Leaves of Bauhinia bracteata Benth Fabaceae were collected in March 2019 at Thanh Nhat ward, Buon Ma Thuot City, Dak Lak province Methods of study: Firstly, the botanical and ADN analysis, purity tests, extractable substances determination, and phytochemical preliminary analysis of Bauhinia bracteata leaves were conducted Secondly, the antioxidant activity of Bauhinia bracteata leaves extracts was screened by DPPH method Then the natural compounds for antioxidant activity were extracted, isolated, elucidated chemical structures, and determied IC50 Finally, a HPLC method for quantitative determination of the isolated compounds was developed Results: The morphological characteristics and microsurgery of leaves, and ADN analysis of Bauhinia bracteata were determined The total and insoluble ash, and humidity were 8.18%, 0.40%, and 9.08%, respectively The content of extractable substances in 80% alcohol was 15.15% The main chemical components in Bauhinia bracteata leaves were flavonoid, tannin, organic acid, saponin,… By using exhausted extraction and evaporation methods and combining with liquid – liquid partition extraction, the n-hexane (18 g), chloroform (40 g), and ethyl acetate (120 g) extracts were obtained from kg of Bauhinia bracteata leaves Among of them, ethyl acetate extract showed the highest antioxidant activity Ethyl gallate (46 mg, chromatographic purity over 98%), gallic acid (540 mg, purity over 97%), hyperin (148 mg, purity over 98%), and myricitrin (38 mg, purity over 96%) were isolated from 60 g of ethyl acetate extract All isolated compounds had lower IC50 than ascorbic acid Gallic acid showed the lowest (2.93 µg/ml), thus the strongest antioxidant activity and 2.95 times stronger than ascorbic acid Ethyl gallate and myricitrin, and hyperin showed 2.73, 2.36 times stronger than ascorbic acid, respectively The HPLCPDA method for simultaneous determination of gallic acid and hyperin was developed and validated, using mixture of methanol and 0.1% phosphoric acid pH 3.5 (40:60) as mobile phase in isocratic mode, and InertSustain C18 column (250 x 4.6 mm; µm) Validation results showed that the method was suitable for the HPLC system, selective, wide linearity range, low detection and quantitation limits, high accurate and precise, and conformed the requirements for a quantitative determination process Conclution: The results of this study contribute to phytochemical and bioactivity database of Bauhinia bracteata Benth Fabaceae, and refer to further studies on chemical composition as well as biological activities of this plant MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC HÌNH .iii DANH MỤC CÁC BẢNG v MỞ ĐẦU Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan họ Fabaceae 1.2 Tổng quan chi Bauhinia 1.3 Tổng quan Bauhinia bracteata 13 1.4 Gốc tự chất chống oxy hóa 15 1.5 Một số phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 16 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Nghiên cứu thực vật học 23 2.2.2 Thử tinh khiết 24 2.2.3 Xác định chất chiết Móng bị leo 24 2.2.4 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 25 2.2.5 Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa cao Móng bị phương pháp DPPH 25 2.2.6 Chiết cao toàn phần tách cao phân đoạn 28 2.2.7 Phân lập tinh chế hợp chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa 28 2.2.8 Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập 29 2.2.9 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 30 2.2.10 Xác định khả chống oxy hóa IC50 hợp chất phân lập 30 2.2.11 Xây dựng quy trình định lượng hợp chất phân lập Móng bị leo phương pháp HPLC 30 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Thực vật học 35 3.2 Thử tinh khiết 39 3.3 Chất chiết Móng bị leo 39 3.4 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 39 3.5 Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa cao chiết từ Móng bị leo phương pháp DPPH 41 3.6 Chiết cao có hoạt tính chống oxy hóa từ Móng bị leo 42 3.7 Phân lập tinh chế hợp chất từ cao ethyl acetat 44 3.8 Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập 49 3.9 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 55 3.10 Xác định khả chống oxy hóa IC50 hợp chất phân lập 63 3.11 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời acid gallic hyperin Móng bị leo phương pháp HPLC 65 Chương BÀN LUẬN 78 4.1 Về thực vật học 78 4.2 Về hóa học 78 4.3 Về tác dụng sinh học 79 4.4 Về xây dựng quy trình định lượng 80 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 Kết luận 82 Kiến nghị 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Từ nguyên Tiếng Việt chữ viết tắt ABTS+ 2,2-azino-bi-3-ethylbenzothiazoline-6sulphonic B-PE B-phycoerythyrin CF Cloroform DCM Dicloromethan DPPH 2,2-diphenyl picryl hydrazyl EA Ethyl acetat EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid ETE Electron Transfer Enthalpy Năng lượng chuyển electron FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power Khả chống oxy hóa khử ion sắt HAT Hydrogen Atom Transfer HEX n-hexan HPLC High Performance Liquid Chuyển nguyên tử hydro Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography HTCO Hoạt tính chống oxy hóa IC Inhibitory Concentration MDA Malondialdehyd MS Mass spectrometry Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân ORAC Oxygen radical absorbance capacity Khả hấp thụ oxy tự PDA Photodiode Array Dãy diod quang Nồng độ ức chế ii PĐ Phân đoạn R-PE R-phycoerythyrin SET Single Electron Transfer SKLM Sắc ký lớp mỏng SPLET Sequential Proton Loss Electron Transfer Chuyển electron đơn độc Chuyển electron proton TBA Thiobarbituric acid TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity Khả chống oxy hóa tương đương trolox TLTK Tài liệu tham khảo TPTZ 2,4,6-tripyridyl-s-triazin TT Thuốc thử TT VS Thuốc thử vanillin – acid sulfuric UV Ultraviolet Tử ngoại PL-49 PL-50 Phụ lục 13 Các sắc ký đồ khảo sát độ xác Độ lặp lại Nồng độ 80% PL-51 Nồng độ 100% PL-52 PL-53 Nồng độ 120% PL-54 Độ xác trung gian Nồng độ 80% PL-55 PL-56 Nồng độ 100% PL-57 Nồng độ 120% PL-58 PL-59 Phụ lục 14 Các sắc ký đồ khảo sát độ Nồng độ 80% PL-60 Nồng độ 100% PL-61 PL-62 Nồng độ 120% PL-63 ... xuất, phân lập xác định cấu trúc hợp chất hướng tác dụng chống oxy hóa; Xác định khả chống oxy hóa IC50 hợp chất phân lập; Xây dựng quy trình định lượng hợp chất phân lập Móng bị leo phương pháp... tài ? ?Phân lập hợp chất hướng tác dụng chống oxy hóa Móng bị leo (Bauhinia bracteata Benth – Fabaceae)? ?? tiến hành nhằm xác định thành phần hóa học chứng minh giá trị y học tác dụng chống oxy hóa. .. hoạt tính chống oxy hóa cao Móng bị leo phương pháp DPPH - Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hai hợp chất hướng tác dụng chống oxy hóa Xác định khả chống oxy hóa IC50 hợp chất phân lập - Xây