Đặc điểm exosomes tiết từ tế bào gốc trung mô dây rốn và tế bào tua biệt hóa từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Hoàng Hương Diễm ĐẶC ĐIỂM EXOSOMES TIẾT TỪ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO TUA BIỆT HÓA TỪ TẾ BÀO BẠCH CẦU MONO MÁU CUỐNG RỐN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Hoàng Hương Diễm ĐẶC ĐIỂM EXOSOMES TIẾT TỪ TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO TUA BIỆT HĨA TỪ TẾ BÀO BẠCH CẦU MONO MÁU CUỐNG RỐN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8460201.22 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Thân Thị Trang Uyên PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Hà Nội – 2020 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin trân trọng cảm ơn GS TS BS Nguyễn Thanh Liêm, Viện trưởng Viện nghiên cứu Tế bào gốc Công nghệ gen Vinmec tạo điều kiện cho tơi có hội thực tập qua giúp tơi có hội tiếp cận với kỹ thuật trang thiết bị đại hàng đầu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, người truyền cảm hứng cho tìm đến Bộ mơn Sinh học Tế bào, người tận tình hướng dẫn, dìu dắt tơi q trình học tập nghiên cứu, đồng thời người lắng nghe, động viên giúp đỡ lúc gặp khó khăn Tơi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS Thân Thị Trang Uyên, cán hướng dẫn trực tiếp q trình thực nghiên cứu, người ln tận tình hướng dẫn giải đáp thắc mắc, khó khăn đồng thời động viên hỗ trợ suốt q trình nghiên cứu để hồn thành tốt luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Việt Anh, ThS Chu Thị Thảo, ThS Nguyễn Đắc Tú, CN Đỗ Thị Hoài Thu, CN Phạm Thị Cường, ThS Lê Thị Huyền cán Viện Nghiên cứu Tế bào gốc Công nghệ Gen Vinmec hỗ trợ nhiệt tình cho tơi suốt q trình hồn thành luận văn cao học Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Bùi Thị Vân Khánh, người hướng dẫn bảo điều bản từ ngày tơi tham gia vào nhóm Ung thư thực nghiệm Cùng với tơi xin cảm ơn tới Thầy, Cô Bộ Môn Sinh học Tế bào, anh chị, em nhóm Ung thư thực nghiệm đồng hành hỗ trợ suốt trình làm việc Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn bè yêu thương, ủng hộ, tạo cho chỗ dựa vững để giúp vượt qua khó khăn, thử thách Xin chân thành cảm ơn! Nghiên cứu thực với hỗ trợ kinh phí Đề tài cấp ĐHQG “Nghiên cứu khả kích thích miễn dịch kháng ung thư exosome tiết từ tế bào tua máu dây rốn người nhằm hướng tới ứng dụng chế tạo vắc xin chống ung thư”, mã số: QG 18.09 Hà Nội, tháng 11 năm 2020 Học viên cao học, Hoàng Hương Diễm MỤC LỤC CHƯƠNG - TỔNG QUAN………………………………………………… 1.1 Thể tiết exosome……………………………………………………………… 1.1.1 Giới thiệu chung exosome thể tiết ngoại bào……………………… 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu chế hình thành…………………………………… 1.1.3 Chức exosome…………………………………………………… 1.2 Exosome từ tế bào tua máu cuống rốn người…………………………… 11 1.2.1 Giới thiệu chung tế bào tua……………………………………………… 11 1.2.2 Tế bào tua biệt hóa trưởng thành từ tế bào bạch cầu mono (moDC)……… 12 1.2.3 Máu cuống rốn – nguồn cung cấp tế bào mono………………………… 12 1.2.4 Exosome từ tế bào tua…………………………………………………… 13 1.3 Exosome từ tế bào gốc trung mô…………………………………………… 15 1.3.1 Giới thiệu chung tế bào gốc trung mô…………………………………… 15 1.3.2 Dây rốn - Nguồn cung cấp tế bào gốc trung mô…………………………… 16 1.3.3 Exosome từ tế bào gốc trung mô…………………………………………… 17 CHƯƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………… 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………… 20 2.1.1 Mẫu máu cuống rốn……………………………………………………… 20 2.1.2 Tế bào gốc trung mô dây rốn người………………………………………… 20 2.1.3 Tế bào ung thư phổi khơng tế bào nhỏ A549………………………………… 21 2.2 Hóa chất thiết bị…………………………………………………………… 21 2.2.1 Hóa chất…………………………………………………………………… 21 2.2.2 Thiết bị……………………………………………………………………… 24 2.2.3 Dụng cụ vật tư tiêu hao…………………………………………………… 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………… 26 2.3.1 Phương pháp ni cấy biệt hóa trưởng thành tế bào tua từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn người…………………………………………… 26 2.3.2 Nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ dây rốn…………………………………… 30 2.3.3 Phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy……………………………… 30 2.3.4 Phương pháp phân lập exosome từ môi trường nuôi cấy tế bào……………… 33 2.3.5 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái kích thước exosome……… 34 2.3.6 Phương pháp tách chiết protein tồn phần có exosome………………… 35 2.3.7 Phương pháp xác định đặc điểm protein thị exosome……………… 38 2.3.8 Phương pháp loại bỏ kháng thể sơ cấp kháng thể thứ cấp………………… 39 2.3.9 Phương pháp xác định phân bố phổ protein tách chiết từ EX gel…… 39 2.3.10 Phương pháp phân tích thống kê…………………………………………… 40 CHƯƠNG - KẾT QUẢ………………………………………………………… 41 3.1 Kết biệt hóa trưởng thành tế bào tua từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn người………………………………………………………………… 41 3.1.1 Kết quả phân lập tế bào bạch cầu đơn nhân tế bào mono từ máu cuống rốn………………………………………………………………………………… 41 3.1.2 Kết quả thu nhận protein tổng số từ dòng tế bào ung thư phổi A549………… 45 3.1.3 Số lượng tế bào tua thu từ q trình ni cấy biệt hóa trưởng thành từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn…………………………………………… 46 3.1.4 Kết quả đặc điểm hình thái tế bào q trình ni cấy…………………… 46 3.1.5 Kết quả phân tích dấu ấn bề mặt tế bào mono tế bào tua trưởng thành……………………………………………………………………………… 48 3.2 Kết nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mơ dây rốn…………………… 50 3.3 Đặc điểm hình thái kích thước exosome thu từ mơi trường nuôi cấy tế bào……………………………………………………………………… 52 3.4 Kết định lượng protein tổng số exosome thu được……………… 53 3.5 Kết phân tách protein gel SDS-PAGE dựa phương pháp nhuộm bạc (Silver stain)………………………………………………………… 53 3.6 Kết phát protein thị sử dụng phương pháp Western Blot…… 54 CHƯƠNG - THẢO LUẬN……………………………………………………… 58 KẾT LUẬN……………………………………………………………………… 63 KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………… 64 BÀI BÁO CÔNG BỐ……………………………………………………………… 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 66 PHỤ LỤC………………………………………………………………………… 72 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Q trình hình thành EX…………………………………………………… Hình 2: Thành phần protein EX phân loại theo chức năng……………… Hình 3: Mẫu máu cuống rốn thu thập Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec, Hà Nội……………………………………………………………………………… 20 Hình 4: Quy trình ni cấy biệt hóa trưởng thành DC từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn người……………………………………………………………… 26 Hình 5: Máu cuống rốn sau ly tâm theo tỷ trọng………………………………… 28 Hình 6: Quy trình phân lập EX từ mơi trường ni cấy tế bào……………………… 34 Hình 7: Hình ảnh buồng đếm tế bào sau phân lập phương pháp Ficoll…… 38 Hình 8: Quần thể tế bào đơn nhân phân lập từ máu cuống rốn……………………… 40 Hình 9: Tế bào mono bám dính bề mặt chai ni cấy sau ni cấy bám dính…………………………………………………………………………… 42 Hình 10: Hình thái tế bào trình ni cấy biệt hóa trưởng thành tế bào DC………………………………………………………………………………… 43 Hình 11: Kết quả phân tích tế bào theo dòng chảy tế bào bạch cầu mono (ngày 0) tế bào DC trưởng thành (ngày 7)……………………………………………… 44 Hình 12: Sự biểu kháng nguyên bề mặt tế bào bạch cầu mono tế bào mDC vào ngày ngày 7………………………………………………………… 45 Hình 13: Hình thái biểu kháng nguyên bề mặt tế bào UCMSC passage 1…………………………………………………………………………… 46 Hình 14: Hình thái EX phân tích TEM………………………………… 47 Hình 15: Sự phân bố phổ protein gel SDS-PAGE tách chiết từ EX có nguồn gốc từ mDC UCMSC…………………………………………………………… 49 Hình 16: Sự biểu protein thị đặc trưng EX kiểm tra phương pháp miễn dịch màng lai………………………………………………… 50 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Một số thử nghiệm lâm sàng sử dụng liệu pháp EX……………………… 17 Bảng 2: Các hóa chất sử dụng………………………………………………… 28 Bảng 3: Các thiết bị sử dụng………………………………………………… 31 Bảng 4: Dụng cụ vật tư tiêu hao………………………………………………… 32 Bảng 5: Kháng thể sử dụng phương pháp phân tích tế bào theo dịng chảy tế bào MNC tế bào mDC……………………………………………………… 38 Bảng 6: Kháng thể sử dụng phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy tế bào MSC………………………………………………………………………… 39 Bảng 7: Pha loãng nồng độ protein chuẩn………………………………………… 43 Bảng 8: Chuẩn bị protein chuẩn…………………………………………………… 44 Bảng 9: Kết quả phân lập tế bào MNC từ máu toàn phần…………………………… 49 Bảng 10: : Số lượng tế bào MNC bám dính sau thay môi trường……………… 50 Bảng 11: Tỷ lệ tế bào bạch cầu mono qua trình phân lập vào ngày dựa phân tích kỹ thuật đếm tế bào theo dòng chảy………………………………… 51 Bảng 12: Số lượng DC thu được…………………………………………………… 53 Bảng 13: Kết quả định lượng protein tổng số thu từ EX có nguồn gốc từ mDC 60 Bảng 14: Kết quả định lượng protein tổng số thu từ EX có nguồn gốc từ UCMSC…………………………………………………………………………… 60 nguyên bề mặt đặc trưng EX có nguồn gốc từ DC [30] Kết quả phù hợp với kết quả nghiên cứu khác giới Như vậy, việc sử dụng phương pháp siêu ly tâm truyền thống để phân lập EX, với bước rửa EX với PBS cuối cùng, hoàn toàn thu EX tinh Rửa EX với PBS đảm bảo hóa chất hay chất tạp nhiễm khác protein ngoại bào kết tụ phá hủy hay thay đổi hoạt tính EX Kết quả luận văn khẳng định phân lập thành công EX từ mDC UCMSC nuôi cấy điều kiện GMP Phương pháp phân lập cho phép thu EX đảm bảo đủ độ tinh ứng dụng lâm sàng Triển vọng sử dụng exosome ứng dụng điều trị bệnh lớn Việc phân lập phân tích exosome mơi trường ni cấy thực nhiều năm qua Tuy nhiên, phần lớn nghiên cứu thể tiết exosome giới lĩnh vực nghiên cứu bản, nghiên cứu exosome Việt Nam Chỉ vài năm trở lại đây, exosome nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm lâm sàng chưa có nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng ứng dụng exosome điều trị hay chuẩn đoán bệnh Việt Nam Nghiên cứu số nghiên cứu tiên phong Việt Nam thể tiết exosome Đây nghiên cứu Việt Nam phân lập kiểm tra thể tiết exosome tiết từ tế bào gốc trung mô dây rốn nuôi cấy môi trường thương mại không bổ sung huyết đạt tiêu chuẩn thực hành lâm sàng tốt Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình phân lập EX phù hợp cho nghiên cứu định hướng ứng dụng lâm sàng điều trị bệnh Mặc dù nghiên cứu tồn số hạn chế thiếu định lượng EX EX tạo phân lập thành công điều kiện khơng có huyết Các EX tiếp tục nghiên cứu thêm vai trò trình sinh học tế bào để hiểu rõ chức chúng Tiếp theo, đánh giá hoạt tính EX từ mDC máu cuống rốn việc kích thích miễn dịch kháng ung thư nghiên cứu khả liền vết thương, tái tạo da EX từ tế bào UCMSC 56 KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng thành công quy trình phân lập EX tiết từ tế bào DC biệt hóa từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn tế bào UCMSC nuôi cấy môi trường thương mại không bổ sung huyết đạt tiêu chuẩn thực hành lâm sàng tốt (Good Manufacture Practice – GMP) Hình thái EX có dạng hình cốc, kích thước đường kính từ 40 - 250 nm EX có biểu protein thị đặc trưng CD9 CD63 57 KIẾN NGHỊ Tiếp tục tiến hành nghiên cứu thêm thành phần phân tử bên EX tiết từ mDC UCMSC Kiểm tra hoạt tính EX từ mDC máu cuống rốn việc kích thích miễn dịch kháng ung thư nghiên cứu khả liền vết thương, chế tái tạo tế bào da EX từ tế bào UCMSC 58 BÀI BÁO CÔNG BỐ Hoang, D H., Nguyen, T D., Nguyen, H P., Nguyen, X H., Do, P T X., Dang, V D., & Hoang, N T M (2020) Differential Wound Healing Capacity of Mesenchymal Stem CellDerived Exosomes Originated From Bone Marrow, Adipose Tissue and Umbilical Cord Under Serum-and Xeno-Free Condition Front Mol Biosci, 7: 119 Diem, H H., Van Khanh, B T., Nhung, H T M., Liem, N T., & Uyen, T T T (2019) Initial characterisation of exosomes released by umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and mature dendritic cells, under'Good Manufacturing Practice'conditions Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering, 61(3), 45-51 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abbas O L., O Özatik, Z B Gưnen, S Ưğüt, F Y Ưzatik, H Salkın and A Musmul (2019), "Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue, and dental pulp as sources of cell therapy for zone of stasis burns", Journal of Investigative Surgery, 32, pp 477-490 Allan R S., J Waithman, S Bedoui, C M Jones, J A Villadangos, Y Zhan, A M Lew, K Shortman, W R Heath and F R Carbone (2006), "Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming", Immunity, 25, pp 153-162 Andre F., B Escudier, E Angevin, T Tursz and L Zitvogel (2004), "Exosomes for cancer immunotherapy", Annals of oncology, 15, pp 141-144 Besse B., M Charrier, V Lapierre, E Dansin, O Lantz, D Planchard, T Le Chevalier, A Livartoski, F Barlesi and A J O Laplanche (2016), "Dendritic cell-derived exosomes as maintenance immunotherapy after first line chemotherapy in NSCLC", 5, pp e1071008 Bi B., R Schmitt, M Israilova, H Nishio and L G Cantley (2007), "Stromal cells protect against acute tubular injury via an endocrine effect", Journal of the American Society of Nephrology, 18, pp 2486-2496 Chang F., J Lee, P Navolanic, L Steelman, J Shelton, W Blalock, R Franklin and J McCubrey (2003), "Involvement of PI3K/Akt pathway in cell cycle progression, apoptosis, and neoplastic transformation: a target for cancer chemotherapy", Leukemia, 17, pp 590-603 Chaput N., N E Schartz, F André, J Taïeb, S Novault, P Bonnaventure, N Aubert, J Bernard, F Lemonnier and M Merad (2004), "Exosomes as potent cell-free peptide-based vaccine II Exosomes in CpG adjuvants efficiently prime naive Tc1 lymphocytes leading to tumor rejection", The Journal of Immunology, 172, pp 2137-2146 Cheng L., K Zhang, S Wu, M Cui and T Xu (2017), "Focus on mesenchymal stem cell-derived exosomes: opportunities and challenges in cell-free therapy", Stem cells international, 2017, pp 1-10 Cormican S and M D Griffin (2020), "Human Monocyte Subset Distinctions and Function: Insights From Gene Expression Analysis", Frontiers in Immunology, 11, pp 10 da Silva Simoneti G., S T O Saad and S C O Gilli (2014), "An efficient protocol for the generation of monocyte derived dendritic cells using serum-free media for clinical applications in post remission AML patients", Annals of Clinical Laboratory Science 44, pp 180-188 60 11 Dai W., S L Hale, B J Martin, J.-Q Kuang, J S Dow, L E Wold and R A Kloner (2005), "Allogeneic mesenchymal stem cell transplantation in postinfarcted rat myocardium", Circulation, 112, pp 214-223 12 Dominici M., K Le Blanc, I Mueller, I Slaper-Cortenbach, F Marini, D Krause, R Deans, A Keating, D Prockop and E Horwitz (2006), "Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells The International Society for Cellular Therapy position statement", Cytotherapy, 8, pp 315-317 13 Drommelschmidt K., M Serdar, I Bendix, J Herz, F Bertling, S Prager, M Keller, A.-K Ludwig, V Duhan and S Radtke (2017), "Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles ameliorate inflammation-induced preterm brain injury", Brain, behavior, immunity, 60, pp 220-232 14 Escudier B., T Dorval, N Chaput, F André, M.-P Caby, S Novault, C Flament, C Leboulaire, C Borg and S Amigorena (2005), "Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC) derived-exosomes: results of thefirst phase I clinical trial", Journal of translational medicine, 3, pp 1-13 15 Ferrand J., D Noël, P Lehours, M Prochazkova-Carlotti, L Chambonnier, A Menard, F Mégraud and C Varon (2011), "Human bone marrow-derived stem cells acquire epithelial characteristics through fusion with gastrointestinal epithelial cells", PLoS One, 6, pp e19569 16 Fonsato V., F Collino, M B Herrera, C Cavallari, M C Deregibus, B Cisterna, S Bruno, R Romagnoli, M Salizzoni and C Tetta (2012), "Human liver stem cell‐ derived microvesicles inhibit hepatoma growth in SCID mice by delivering antitumor microRNAs", Stem cells, 30, pp 1985-1998 17 Goldie B J., M D Dun, M Lin, N D Smith, N M Verrills, C V Dayas and M J Cairns (2014), "Activity-associated miRNA are packaged in Map1b-enriched exosomes released from depolarized neurons", Nucleic acids research, 42, pp 9195-9208 18 Gurunathan S., M.-H Kang, M Jeyaraj, M Qasim and J.-H Kim (2019), "Review of the isolation, characterization, biological function, and multifarious therapeutic approaches of exosomes", Cells, 8, pp 307-344 19 Harding C., J Heuser and P Stahl (1984), "Endocytosis and intracellular processing of transferrin and colloidal gold-transferrin in rat reticulocytes: demonstration of a pathway for receptor shedding", European journal of cell biology, 35, pp 256263 20 Hessvik N P., A J C Llorente and M L Sciences (2018), "Current knowledge on exosome biogenesis and release", 75, pp 193-208 21 Hristov M., W Erl, S Linder and P C Weber (2004), "Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro", Blood, 104, pp 2761-2766 61 22 Iso Y., J L Spees, C Serrano, B Bakondi, R Pochampally, Y.-H Song, B E Sobel, P Delafontaine and D J Prockop (2007), "Multipotent human stromal cells improve cardiac function after myocardial infarction in mice without long-term engraftment", Biochemical biophysical research communications, 354, pp 700706 23 Jafarinia M., F Alsahebfosoul, H Salehi, N Eskandari and M Ganjalikhani-Hakemi (2020), "Mesenchymal Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles: A Novel CellFree Therapy", Immunological Investigations, 8, pp 1-23 24 Kalluri R and V LeBleu (2020), "The biology, function, and biomedical applications of exosomes", Science, 367, pp 1-11 25 Katsuda T., R Tsuchiya, N Kosaka, Y Yoshioka, K Takagaki, K Oki, F Takeshita, Y Sakai, M Kuroda and T Ochiya (2013), "Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells secrete functional neprilysin-bound exosomes", Scientific reports, 3, pp 1197 26 Kim Y.-J., S mi Yoo, H H Park, H J Lim, Y.-L Kim, S Lee, K.-W Seo and K.S Kang (2017), "Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells stimulates rejuvenation of human skin", Biochemical biophysical research communications, 493, pp 1102-1108 27 Lai R C., S S Tan, B J Teh, S K Sze, F Arslan, D P De Kleijn, A Choo and S K Lim (2012), "Proteolytic potential of the MSC exosome proteome: implications for an exosome-mediated delivery of therapeutic proteasome", International journal of proteomics, 2012, pp 1-14 28 Mastelic-Gavillet B., K Balint, C Boudousquié, P O Gannon and L E Kandalaft (2019), "Personalized dendritic cell vaccines—recent breakthroughs and encouraging clinical results", Frontiers in immunology, 10, pp 766-766 29 Mathieu M., L Martin-Jaular, G Lavieu and C N c b Thery (2019), "Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-tocell communication", Nature cell biology, 21, pp 9-17 30 Mathivanan S., H Ji and R J Simpson (2010), "Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication", Journal of proteomics, 73, pp 19071920 31 Mendt M., K Rezvani and E Shpall (2019), "Mesenchymal stem cell-derived exosomes for clinical use", Bone marrow transplantatio, 54, pp 789-792 32 Mignot G., S Roux, C Thery, E Ségura and L Zitvogel (2006), "Prospects for exosomes in immunotherapy of cancer", Journal of cellular molecular medicine, 10, pp 376-388 33 Miwa S., H Nishida, Y Tanzawa, M Takata, A Takeuchi, N Yamamoto, T Shirai, K Hayashi, H Kimura and K Igarashi (2012), "TNF-α and tumor lysate promote 62 the maturation of dendritic cells for immunotherapy for advanced malignant bone and soft tissue tumors", PloS one, 7, pp e52926 34 Morse M A., J Garst, T Osada, S Khan, A Hobeika, T M Clay, N Valente, R Shreeniwas, M A Sutton and A Delcayre (2005), "A phase I study of dexosome immunotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer", Journal of translational medicine, 3, pp 35 Nakamoto Y., E Mizukoshi, H Tsuji, Y Sakai, M Kitahara, K Arai, T Yamashita, K Yokoyama, N Mukaida and K Matsushima (2007), "Combined therapy of transcatheter hepatic arterial embolization with intratumoral dendritic cell infusion for hepatocellular carcinoma: clinical safety", Clinical Experimental Immunology, 147, pp 296-305 36 Nassar W., M El-Ansary, D Sabry, M A Mostafa, T Fayad, E Kotb, M Temraz, A.-N Saad, W Essa and H Adel (2016), "Umbilical cord mesenchymal stem cells derived extracellular vesicles can safely ameliorate the progression of chronic kidney diseases", Biomaterials research, 20, pp 21 37 Ogata-Kawata H., M Izumiya, D Kurioka, Y Honma, Y Yamada, K Furuta, T Gunji, H Ohta, H Okamoto and H Sonoda (2014), "Circulating exosomal microRNAs as biomarkers of colon cancer", PloS one, 9, pp e92921 38 Ohshima K., K Inoue, A Fujiwara, K Hatakeyama, K Kanto, Y Watanabe, K Muramatsu, Y Fukuda, S.-i Ogura and K Yamaguchi (2010), "Let-7 microRNA family is selectively secreted into the extracellular environment via exosomes in a metastatic gastric cancer cell line", PloS one, 5, pp e13247 39 Ono M., N Kosaka, N Tominaga, Y Yoshioka, F Takeshita, R.-u Takahashi, M Yoshida, H Tsuda, K Tamura and T Ochiya (2014), "Exosomes from bone marrow mesenchymal stem cells contain a microRNA that promotes dormancy in metastatic breast cancer cells", Sci Signal, 7, pp ra63-ra63 40 Osugi Y., S Vuckovic and D N J B Hart (2002), "Myeloid blood CD11c+ dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes", 100, pp 2858-2866 41 Palucka K and J Banchereau (2012), "Cancer immunotherapy via dendritic cells", Nature Reviews Cancer, 12, pp 265-277 42 Phinney D G and M F Pittenger (2017), "Concise review: MSC‐derived exosomes for cell‐free therapy", Stem cells, 35, pp 851-858 43 Pitt J M., F André, S Amigorena, J.-C Soria, A Eggermont, G Kroemer and L J T J o c i Zitvogel (2016), "Dendritic cell–derived exosomes for cancer therapy", The Journal of clinical investigation, 126, pp 1224-1232 44 Qazi K R., U Gehrmann, E Domange Jordö, M C Karlsson and S Gabrielsson (2009), "Antigen-loaded exosomes alone induce Th1-type memory through a B 63 cell–dependent mechanism", Blood, The Journal of the American Society of Hematology, 113, pp 2673-2683 45 Qiu G., G Zheng, M Ge, J Wang, R Huang, Q Shu and J Xu (2019), "Functional proteins of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles", Stem cell research therapy, 10, pp 359-370 46 Sheridan C (2016), "Exosome cancer diagnostic reaches market", Journal, 34 47 Skog J., T Würdinger, S Van Rijn, D H Meijer, L Gainche, W T Curry, B S Carter, A M Krichevsky and X O Breakefield (2008), "Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers", Nature cell biology, 10, pp 1470-1476 48 Spees J L., S D Olson, J Ylostalo, P J Lynch, J Smith, A Perry, A Peister, M Y Wang and D J Prockop (2003), "Differentiation, cell fusion, and nuclear fusion during ex vivo repair of epithelium by human adult stem cells from bone marrow stroma", Proceedings of the National Academy of Sciences, 100, pp 2397-2402 49 Tan C Y., R C Lai, W Wong, Y Y Dan, S.-K Lim and H K Ho (2014), "Mesenchymal stem cell-derived exosomes promote hepatic regeneration in druginduced liver injury models", Stem cell research therapy, 5, pp 76-90 50 Tang Y.-T., Y.-Y Huang, L Zheng, S.-H Qin, X.-P Xu, T.-X An, Y Xu, Y.-S Wu, X.-M Hu and B.-H J I j o m m Ping (2017), "Comparison of isolation methods of exosomes and exosomal RNA from cell culture medium and serum", 40, pp 834-844 51 Than U T T., D Guanzon, D Leavesley and T Parker (2017), "Association of extracellular membrane vesicles with cutaneous wound healing", International journal of molecular sciences, 18, pp 956 52 Théry C., L Duban, E Segura, P Véron, O Lantz and S Amigorena (2002), "Indirect activation of naïve CD4+ T cells by dendritic cell–derived exosomes", Nature immunology, 3, pp 1156-1162 53 Théry C., L Zitvogel and S Amigorena (2002), "Exosomes: composition, biogenesis and function", Nature reviews immunology, 2, pp 569-579 54 Tian H and W Li (2017), "Dendritic cell-derived exosomes for cancer immunotherapy: hope and challenges", Annals of translational medicine, 5, pp 1-3 55 Timmers L., S K Lim, F Arslan, J S Armstrong, I E Hoefer, P A Doevendans, J J Piek, R M El Oakley, A Choo and C N Lee (2008), "Reduction of myocardial infarct size by human mesenchymal stem cell conditioned medium", Stem cell research, 1, pp 129-137 64 56 Tracy S A., A Ahmed, J C Tigges, M Ericsson, A K Pal, D Zurakowski and D O Fauza (2019), "A comparison of clinically relevant sources of mesenchymal stem cell-derived exosomes: Bone marrow and amniotic fluid", Journal of pediatric surgery, 54, pp 86-90 57 Trajkovic K., C Hsu, S Chiantia, L Rajendran, D Wenzel, F Wieland, P Schwille, B Brügger and M Simons (2008), "Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes", Science, 319, pp 1244-1247 58 Trams E G., C J Lauter, J N Salem and U Heine (1981), "Exfoliation of membrane ecto-enzymes in the form of micro-vesicles", Biochimica et Biophysica Acta -Biomembranes, 645, pp 63-70 59 Vassilopoulos G., P.-R Wang and D W Russell (2003), "Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion", Nature, 422, pp 901-904 60 Veerman R E., G G Akpinar, M Eldh and S Gabrielsson (2019), "Immune cellderived extracellular vesicles–functions and therapeutic applications", Trends in molecular medicine, 25, pp 382-394 61 Viaud S., S Ploix, V Lapierre, C Théry, P.-H Commere, D Tramalloni, K Gorrichon, P Virault-Rocroy, T Tursz and O Lantz (2011), "Updated technology to produce highly immunogenic dendritic cell-derived exosomes of clinical grade: a critical role of interferon-γ", Journal of immunotherapy, 34, pp 65-75 62 Viaud S., M Terme, C Flament, J Taieb, F Andre, S Novault, B Escudier, C Robert, S Caillat-Zucman and T Tursz (2009), "Dendritic cell-derived exosomes promote natural killer cell activation and proliferation: a role for NKG2D ligands and IL-15Rα", PloS one, 4, pp 4942-4954 63 Wang X L., Y Y Zhao, L Sun, Y Shi, Z Q Li, X D Zhao, C G Xu, H G Ji, M Wang and W R Xu (2018), "Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells improve myocardial repair via upregulation of Smad7", International journal of molecular medicine, 41, pp 3063-3072 64 Yang X., J Chen, N Wang, Z Liu and Y Li (2018), "Clinical use of dendritic cellderived exosomes for hepatocellular carcinoma immunotherapy: How far we are?", Journal of hepatology, 69, pp 984-986 65 Zhang J., S Li, L Li, M Li, C Guo, J Yao and S Mi (2015), "Exosome and exosomal microRNA: trafficking, sorting, and function", Genomics, proteomics bioinformatics, 13, pp 17-24 66 Zitvogel L., A Regnault, A Lozier, J Wolfers, C Flament, D Tenza, P RicciardiCastagnoli, G Raposo and S Amigorena (1998), "Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell derived exosomes", Nature medicine, 4, pp 594-600 65 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Định lượng protein tổng số theo phương pháp Bradford Nồng độ protein tổng số ly giải từ tế bào ung thư phổi A549 đo phương pháp Bradford Phương pháp dựa thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính axit chưa liên kết với protein thuốc nhuộm có màu đỏ, có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm liên kết với protein tạo phức chất màu xanh dương hấp thu cực đại bước sóng 595 nm Để xác định hàm lượng protein mẫu, cần xây dựng đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn biết nồng độ Sau cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm, phức chất màu xanh xuất sau - phút bền tới Tiến hành đo dung dịch sử dụng máy đo quang phổ ta mật độ quang ODx (optical density – OD), độ hấp thụ tỷ lệ với lượng protein mẫu Lượng protein mẫu dung dịch đo xác định cách dựa vào đường chuẩn từ giá trị ODx trục tung, từ suy giá trị nồng độ protein tương ứng trục hồnh Đồ thị đường chuẩn có dạng sau: y = ax + b Trong đó: y: giá trị ODx đo máy đo quang phổ x: hàm lượng protein tương ứng với giá trị ODx a, b: số Protein chuẩn albumin từ huyết bị (BSA) Dải protein chuẩn pha lỗng dung dịch PBS 1X từ dung dịch BSA gốc ban đầu có nồng độ 10.000 μg/ml giảm dần tới 25 μg/ml sau: Bảng 13: Pha loãng nồng độ protein chuẩn 66 Thể tích PBS Ống thêm vào (µl) Nồng độ Thể tích BSA BSA sau (µl) pha lỗng Thể tích BSA sau pha lỗng (µg/ml) (µl) A 240 60 (stock) 2000 300 B 255 45 (stock) 1500 300 C 270 30 (stock) 1000 300 D 150 150 (B) 750 300 E 150 150 (C) 500 300 F 150 150 (E) 250 300 G 150 150 (F) 125 300 H 240 60 (G) 25 300 G (Blank) 300 0 300 Pha loãng 10 lần dịch protein A549 tổng số thu sử dụng PBS 1X Hút 30 µl dung dịch ống chuẩn bị bảng 30 µl protein tổng số pha lỗng vào ống eppendorf, điều kiện lặp lại lần Bổ sung vào ống 1,5 mL Bradford (đã để nhiệt độ phịng trước làm thí nghiệm 30 phút) trộn Ủ hỗn hợp 10 phút nhiệt độ phòng Đo quang phổ bước sóng 595 nm Xây dựng đường chuẩn xác định nồng độ protein tổng số Phụ lục 2:Định lượng protein tổng số sử dụng axit bicinchoninic Nồng độ protein tổng số thể tiết exosome tách chiết mục 2.3.6 xác định cách sử dụng kit Pierce™ BCA Protein Assay phương pháp đo mật độ quang Bộ kit dựa phản ứng tạo màu axit bicinchoninic (BCA) để định lượng protein tổng số Cụ thể, mơi trường kiềm với có mặt liên kết peptide, Cu2+ chuyển thành Cu1+ (phản ứng biure): Protein (liên kết -CO-NH-) + Cu2+ + OH- => Phức chất màu xanh tím (Phức Cu1+) Một phân tử Cu1+ tạo phức với hai phân tử BCA tạo phức chất có màu xanh tím Bước sóng hấp thụ cực đại phức chất 562 nm Ở bước sóng này, 67 nồng độ phức chất tăng cách tuyến tính với nồng độ protein nằm dải hoạt động (20 – 2000 μg/ml) Dựa vào giá trị OD dải protein chuẩn (pha theo hướng dẫn kit để thiết lập phương trình đường chuẩn, từ xác định nồng độ protein dung dịch Các bước tiến hành sau: Chuẩn bị protein chuẩn: Protein chuẩn kit albumin từ huyết bò (BSA) Dải protein chuẩn pha loãng dung dịch PBS 1X từ dung dịch BSA gốc ban đầu có nồng độ 2000 μg/ ml giảm dần tới 25 μg/ ml sau: Bảng 14: Chuẩn bị protein chuẩn Thể tích BSA (μl) 300 μl dung dịch gốc Nồng độ BSA (μg/ ml) 2000 A Thể tích PBS (μl) B 125 375 μl dung dịch gốc 1500 C 325 325 μl dung dịch gốc 1000 D 175 175 μl dung dịch ống B 750 E 325 325 μl dung dịch ống C 500 F 325 325 μl dung dịch ống E 250 G 325 325 μl dung dịch ống F 125 H 400 100 μl dung dịch ống G 25 I 400 0 Ống Pha hỗn hợp BCA Working Reagent (WR) gồm BCA Reagent A (chứa BCA tạo môi trường kiềm) BCA Reagent B (chứa Cu2+) theo tỷ lệ 50:1 thể tích 25 μl protein chuẩn mẫu protein EX cần đo bổ sung vào giếng đĩa 96 giếng (mỗi giếng lặp lại lần) Tiếp theo đó, bổ sung vào giếng 200 μl BCA Working Reagent Ủ hỗn hợp 37 oC 30 phút Sau 30 phút, để đĩa nhiệt độ phòng 10 phút để hạ nhiệt Đo OD bước sóng 562 nm máy Glomax phân tích kết quả máy Phụ lục 3: Phương pháp phân tích protein thị exosome 68 10 - 20 μg protein EX có nguồn gốc từ loại tế bào khác trộn với dung dịch đệm NuPAGE™ LDS sample buffer 4X, ủ nhiệt độ 95 oC vòng phút Protein phân tách gel -12% SDS – PAGE đệm NuPAGE™ MOPS SDS Running Buffer với hiệu điện 200 V/ 60 phút Protein sau phân tách gel chuyển sang màng lai PVDF với điện áp 200 mA/ giờ, màng PVDF hoạt hóa dung dịch methanol 10 – 30 giây Quá trình chuyển màng sử dụng đệm Towbin buffer 1X bổ sung 20% methanol Tiếp theo, màng khóa lại sử dụng đệm TBS 1X bổ sung 0,01% Tween 20 (TBST) 5% chất khóa màng (Blocking reagent) vòng nhiệt độ phòng Màng ủ qua đêm oC với kháng thể sơ cấp pha loãng dung dịch TBST bổ sung 0,5% chất khóa màng anti-CD9 (1:100), anti- CD63 (1:200), anti-CD86 (1:100), anti-α-tubulin (1:100) anti-GAPDH (1:100) Màng sau ủ với kháng thể sơ cấp rửa lại lần, lần phút sử dụng đệm TBST, sau ủ màng với kháng thể thứ cấp Amersham ECLTM Anti – mouse IgG Peroxidase conjugated (HRP) pha loãng dung dịch TBST bổ sung 0,5% chất khóa màng với tỉ lệ 1:1000 Cuối cùng, màng rửa lại với đệm TBST lần, lần phút liên kết kháng thể phát với chất phát quang hóa học AmershamTM ECLTM start Western Blotting detection reagent Ảnh kết quả phân tích protein màng chụp lại sử dụng hệ thống máy chụp ảnh gel điện di quang hóa huỳnh quang ImageQuant LAS500 Phụ lục 4: Phương pháp xác định phân bố phổ protein tách chiết từ EX gel Cụ thể là, protein toàn phần tách chiết từ EX có nguồn gốc từ loại tế bào khác điện di phân tách gel 4-12% SDS-PAGE đệm NuPAGE™ MOPS SDS Running Buffer (Invitrogen, Mỹ) với hiệu điện 200 V/ 60 phút Sau protein phân tách gel, gel rửa lại với nước khử ion lần, lần phút Cố định gel dung dịch chứa 30% ethanol : 10% axit acetic vòng 15 phút, lặp lại lần Loại bỏ dung dịch rửa gel lần, lần năm phút với dung dịch ethanol 10% rửa tiếp lần, lần phút với nước khử ion Chuẩn bị Sensitizer Working Solution (50µL Sensitizer pha với 25 ml nước khử ion) Ủ gel Sensitizer 69 Working Solution phút, sau rửa gel lần, lần phút với nước khử ion Chuẩn bị Stain Working Solution (0,5 ml Enhancer pha với 25 ml Stain) Nhuộm gel 30 phút Stain Working Solution Chuẩn bị Developer Working Solution (0,5 ml Enhancer pha với 25 ml Developer) Rửa gel lần, lần 20 giây với nước khử ion, sau ủ gel dung dịch Developer Working Solution vòng – phút thấy dải băng điện di protein xuất gel Kết thúc phản ứng cách ủ gel với dung dịch axit acetic 5% 10 phút trước tiến hành chụp ảnh gel sử dụng hệ thống máy chụp ảnh gel điện di quang hóa huỳnh quang ImageQuant LAS500 70 ... hóa trưởng thành tế bào tua từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn người 3.1.1 Kết phân lập tế bào bạch cầu đơn nhân tế bào mono từ máu cuống rốn 3.1.1.1 Phân lập tế bào bạch cầu đơn nhân từ máu. .. định đặc điểm đặc trưng chúng cịn gặp khó khăn Dựa sở đó, tiến hành đề tài nghiên cứu: ? ?Đặc điểm exosomes tiết từ tế bào gốc trung mô dây rốn tế bào tua biệt hóa từ tế bào bạch cầu mono máu cuống. .. cách biệt hóa từ tế bào gốc tạo máu CD34+ tế bào bạch cầu mono sử dụng phổ biến Tế bào bạch cầu mono loại tế bào bạch cầu có khả biệt hóa để trở thành đại thực bào DC Thông thường, tế bào mono