Tìm hiểu về các hợp chất thiên nhiên

MỞ ĐẦU Ngày người quan tâm đến hợp chất thiên nhiên việc bảo vệ sức khỏe người chống lại bệnh tật Chè loại thực vật nghiên cứu cho thấy chè có hoạt tính sinh học tốt việc bảo vệ sức khỏe phịng chống bệnh Tại chè lại có tác dụng thành phần hợp chất thiên nhiên chè đem lại ích lợi Các nhà khoa học chứng minh chè chứa hợp chất polyphenol có giá trị chống lại phản ứng oxy hóa gốc tự nguyên nhân gây nhiều bệnh ung thư cho người Chuyên đề bước đầu tìm hiểu hợp chất phenolic hợp chất polyphenol có chứa chè có tác dụng sinh học quan trọng việc bảo vệ sức khỏe người Mục lục I.HỢP CHẤT PHENOLIC .4 I.1 Định nghĩa [1] I.2 Phân loại [1] Phenolic đơn giản ( số lượng nguyên tử C :6) Nhóm hợp chất polyphenol phức tạp: Hợp chất phenol polymer : 15 I.3 Hợp chất flavonoid [2],[5] .22 Một số đặc điểm hợp chất flavonoid [2],[5] 22 Phân loại hợp chất flavonoid [3],[ 4], [9] 23 Sinh tổng hợp flavonoid [20]: 26 Tính chất hợp chất flavonoids 29 II Các hợp chất polyphenol chè 35 II.1 Hợp chất catechin 36 Các hợp chất catechin có chè .36 Thành phần, hàm lượng chất catechin chè [10] 37 Tính chất hợp chất catechin có chè .41 Sự tổng hợp catechin chè .42 II.2 Hợp chất anthoxanthin [13] 45 Giới thiệu chung 45 Các anthoxanthin có chè 46 Một số tính chất hợp chất anthoxanthin [13],[ 17] 49 II.3 Hợp chất anthocyanin [13],[3] 50 Giới thiệu chung [13],[3] 50 Tính chất anthocyanin [13] 51 II.4 Hợp chất leucoanthocyanin 52 II.5 Các axit phenol cacboxylic .53 III Phân tích thành phần hợp chất flavonoids chè.[21],[22],[23] 54 III.1 Định lượng polyphenol tổng số 54 1.phương pháp định lượng polyphenol (flavonoid) cách cân 54 Phương pháp định lượng polyphenol tổng số phương pháp Folin – Denis 55 III.2 Định tính flavonoid phản ứng hóa học đặc trưng .55 1.phản ứng shinoda : 56 Phản ứng với dung dịch kiềm 56 Phản ứng diazo 56 Phản ứng với FeCl3 .56 Phản ứng định tính catechin 56 Phản ứng với axit sunfuric 57 III.3 Phân tích sắc kí lớp mỏng quang phổ tử ngoại(UV-VIS) .57 1.Sắc kí lớp mỏng 57 Quang phổ tử ngoại (UV-VIS) 57 III.3 Phân tích sắc kí lỏng trung áp (MPLC) 57 III.4 Phân tích sắc kí lỏng cao áp (HPLC) 58 III.5 Phân lập chất tinh khiết phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) điều chế 58 III.6 Nghiên cứu cấu trúc chất tinh khiết thu .59 IV Phân tích hoạt tính sinh học chế phẩm flavonoid.[24],[25],[26],[27] 59 IV.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa chế phẩm flavonoid thông qua ảnh hưởng lên hoạt độ peroxydaza máu người theo phương pháp E.C.Xavron 59 IV.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa hợp chăt polyphenol chè xanh 59 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua ảnh hưởng lên q trình peroxy hố lipit màng tế bào gan chuột.[24],[25] 59 sử dụng phương pháp điện hóa nghiên cứu chống oxy hóa polyphenol .60 IV.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bảo gan chuột bị nhiễm độc CCl hợp chất flavonoid [24] 61 IV.4 Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật.[26],[27] 61 1.Định tính kháng khuẩn theo phương pháp khoang giấy 61 Định lượng kháng khuẩn theo phương pháp hệ nồng độ .62 IV.5 Nghiên cứu tác dụng chống viêm động vật thực nghiệm 62 IV.6 Nghiên cứu tác dụng kìm hãm phát triển ung thư in vivtro 62 IV.7 Nghiên cứu hoạt tính chống ung thư chống di ung thư động vật thực nghiệm 62 IV.8 Xác định độc tính cấp chế phẩm động vật thực nghiệm 63 Tài liệu tham khảo 65 I.HỢP CHẤT PHENOLIC I.1 Định nghĩa [1] Phenonlic hợp chất có nhiều nhóm hydroxyl gắn trực tiếp vào vịng thơm Phenol hợp chất có cấu trúc tảng nhóm Các vịng thơm benzen Hình 1.1 Phenol Các phenol tương tự rượu cấu trúc aliphatic(chất béo) nơi mà nhóm hydroxyl gắn chuỗi cacbon Nhóm phenolic hydroxyl chịu ảnh hưởng diện vịng thơm Chính vịng thơm đó, hydro hydroxyl phenolic không ổn định làm cho phenol trở thành axit yếu Polyphenol hợp chất có nhiều nhóm phenolic hydroxyl liên kết với hay nhiều vòng benzen Hợp chất Polyphenol đặc trưng cho thực vật nhóm thường thấy este glycosides hợp chất tự Quan trọng thực trích ly phenol từ mơ thực vật Trong trà xanh có nhiều hợp chất polyphenol có nhiều hoạt tính sinh học tốt chống nhiều bệnh trích ly polyphenol từ trà xanh cần thiết để ứng dụng vào ngành công nghệ thực phẩm, y dược,… I.2 Phân loại [1] Các phenolics bao gồm nhóm lớn đa dạng hợp chất hóa học hợp chất phân loại theo số cách Harborne Simmonds (1964) phân loại hợp chất thành nhóm dựa số lượng cacbon phân tử Bảng1 : Phân loại hợp chất phenolic Cấu trúc C6 Phân loại Phenolic đơn giản C – C1 Axit phenolic hợp chất chúng C6 – C2 Acetophenones axit phenylacetic C6 – C3 Axit cinnamic, aldehydes cinnamyl, rượu cinnamyl C6 – c3 Coumarins, isocoumarins, chromones C15 Chalcones, aurones, dihydrochalcones C15 flavans C15 flavones C15 flavanones C15 flavanonols C15 anthocyanidins C15 anthocyanins C30 biflavonyls C6-C1-C6, C6-C2C6 C6, C10, C4 C18 Lignans, neolignans Benzophenones, xanthones, stilbenes quinones betacyanins Dimers oligomers lignin polymers tannins Oligomers polymers Phlobaphenes polymers Phenolic đơn giản ( số lượng nguyên tử C :6) Phenolics đơn giản chất thay phenol, vị trí ortho, meta para danh pháp dùng để quy đinh 1,2- 1,3 1,4 vào mơ hình vịng benzen Với nhóm chức mơ hình thay 1,3,5, nhóm chức giống hệt mơ hình meta- tri Cịn vị trí 1,2,6 quy định tiền tố ‘vic’ (a) (b) (c) (d) (e) Hình 1.3 Danh pháp cho mơ hình hợp chất phenolic đơn giản Trong đó: (a) tương ứng dạng cơng thức mà vị trí vào vị trí ortho; (b) tương ứng dạng cơng thức mà vị trí vào vị trí meta; (c) tương ứng dạng cơng thức mà vị trí vào vịt rí para; (d) tương ứng dạng cơng thức mà vị trí vào 1,3,5 nhóm chức giống có mơ hình meta- tri ; (e) tương ứng dạng cơng thức vị trí vào 1,2,6 nhóm giống có mơ hình vic-tri; R, R1 R2 nhóm chung Tương ứng với vị trí có tên hợp chất sau: - resorcinol (1,3 – dihydroxybenzen)là meta-dihydroxylated phenolic đơn giản - phloroglucinol (1,3,5- trihydroxybenzen), meta-trihydydroxylated phenolic đơn giản chúng có cơng thức cấu tạo sau: (a) (b) Hình 1.4 Nhóm hợp chất polyphenol đơn giản (a) resocinol ; (b) phloroglucinol Nhóm hợp chất polyphenol phức tạp: Trong thành phần cấu tạo , ngồi vịng benzen cịn có dị vịng mạch nhánh phân thành nhóm sau : + Nhóm (axit phenolic aldeyds): axit hydroxy-benzoic đặc trưng diện nhóm carbonyl thay vào phenol p- axit hydroxybenzoic , axit Gallic , axit protocathechuic, axit salicylic , axit vanilic aldehyde hydroxybenzoic vanilin Hình 1.5: Nhóm axit phenolic aldayds polyphenol phức tạp Trong đó: (a) p - axit hydroxybenzoic; (b) axit Gallic; (c) axit protocathechuic ; (d) axit salicylic; (e) axit vanilic ; (e) vanilin; + Nhóm (acetphenones axit phenylacetic): phenones hợp chất C6- C2 tìm thấy tự nhiên bao gồm 2- hydroxyacetophenone 2- hydroxyphenyl acetic axit (a) (b) Hình 1.6 Nhóm acetphenones axit phenylacetic Trong đó: (a) 2- hydroxyacetphenone; (b) 2- hydroxyphenyl acetic axit + Nhóm (axit cinnamic) có axit cinnamic phổ biến với khung xương C6-C3 Các hợp chất axit cinnamic bao gồm như: axit p-coumaric, axit caffeic, axit ferulic, axit 5- hydroxyferulic axit sinapic Hình 1.7 Nhóm axit cinnamic polyphenol phức tạp Trong đó: (a) axit cinnamic ; (b) axit p-coumaric; (c) axit caffeic ; (d) axit ferulic; (e) axit 5- hydroxyferulic; (f) axit sinapic ; Các hợp chất axit cinnamic thường tìm thấy thực vật este axit quinic, axit shikimic, axit tartaric ví dụ axit chlorogenic este axit caffeic axit quinic Este cinnamic tìm thấy este đường este loạt axit hữu khác Ví dụ sinapoyk có choline sinapoyl có rễ (a) Hình 1.8: Hợp chất este axit cinnamic Trong đó: (a) axit chlorogenic; (b) sinapoyk; (c) choline sinapoyl; + Nhóm coumarins: nhóm có khung xương C6-C3, họ có dị vòng chứa oxy phần đơn vị C3 Coumarins có nhiều, có vai trị bệnh kháng sâu bệnh Các coumarin họ cà rốt Hình 1.9 Nhóm hợp chất coumarins + Nhóm Flavonoids hợp chất C15 tất có cấu trúc C6-C3-C6 Flavonoids chia làm nhóm nhỏ sau - Chalcones: có chalcones dihydrochalcones có C3 mắt xích nối hai vịng C3 chuỗi xích chalcones chứa liên kết đôi, C3 chuỗi dihydrochalcones bão hòa 10 mạc, làm se niêm mạc miệng, góp phần tạo vị chè số chất anthoxanthin có hoạt tính sinh tố P Trong q trình lên men sản xuất chè đen, hợp chất anthoxanthin bị oxi hóa sau hợp chất catechin gây tác dụng oxi hóa bậc 2, tức có mặt dạng octoquinon hợp chất catechin Khi anthoxanthin tham gia vào trình ngưng tụ tạo sản phẩm màu đỏ Tuy nhiên hàm lượng chúng nhiều so với hàm lượng catechin chè (chỉ chiếm từ 0,4 – 1,5%) nên khơng giữ vai trị chủ đạo hình thành chất màu đặc trưng chè đen II.3 Hợp chất anthocyanin [13],[3] Giới thiệu chung [13],[3] Hợp chất anthocyanin thuộc nhóm flavonoid dẫn xuất croman Trong thực vật, hợp chất anthocyanin tồn trạng thái kết hợp với gốc đường (glycozit) Tất anthocyanin có chứa vịng pyran oxy hóa trị tự Ở trạng thái tự do, anthocyanin gồm chất chủ yếu pelargonidin, cyanidin delphinidin:  Pelargonidin:  Cyanidin:  Delphinidin: Các glycozit anthocyanin tạo thành gốc đường glucoza, galactoza ramnoza 47 kết hợp với gốc aglucon có màu gọi anthocyanidin Do đó, thủy phân glycozit anthocyanin đường anthocyanidin Tính chất anthocyanin [13] Trong chè, hợp chất anthocyanin thường dạng glycozit chúng có tính chất sau: – Hịa tan tốt nước ln có nước ép thực vật – Màu sắc anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, chất màu khác nhiều yếu tố… Ví dụ như: Khi tăng số lượng nhóm -OH vịng benzen màu xanh đậm (trong vịng benzen có – nhóm OH) Mức độ metyl hóa nhóm -OH vịng benzen cao màu đỏ Nếu nhóm -OH vị trí thứ ba kết hợp với gốc đường màu sắc thay đổi theo số lượng gốc đường đính vào nhiều hay Các anthocyanin tạo phức muối với ion kim loại màu khác nhau: chẳng hạn muối kali cho với anthocyanin màu đỏ máu, muối canxi magie cho với anthocyanin phức có màu xanh ve Hoặc người ta thấy phúc bồn tử đen chuyển sang màu xanh, cịn anh đào chuyển sang màu tím có mặt thiếc, anh đào cho màu tím có mặt nhơm, nhơm lại không ảnh hưởng đến màu nho đỏ Điều đáng ý màu sắc anthocyanin phụ thuộc mạnh vào pH môi trường Thông thường pH > anthocyanin cho màu xanh pH < anthocyanin có màu đỏ Khi đun nóng lâu dài, anthocyan bị phá hủy màu Nhìn chung gia nhiệt, chất màu đỏ dễ dàng bị phá hủy, chất màu vàng khó – Hợp chất anthocyanin có vị đắng Trong chè chứa nhiều anthocyanin thị vị đắng không hợp vị Trong búp chè màu tím có chứa nhiều anthocyanin nên khơng dùng làm nguyên liệu chế biến chè xanh; dùng làm nguyên liệu chế biến chè đen, phẩm chất chè đen có vị đắng, bã chè xám tối II.4 Hợp chất leucoanthocyanin Các hợp chất leucoanthocyanidin thường gặp chè [Error: Reference source not found]:  Leucocyanidin: 48  Leucodelphinidin: Ngoài trạng thái tự do, leucoanthocyanin cịn có dạng glycozit Hmaf lượng chúng chè so với hàm lượng hợp chất catechin Qua nghiên cứu, người ta thấy rằng, chất leucoanthocyanin hợp chất trung gian catechin anthoxanthin [17] OH OH O HO Catechin OH OH + O2 OH OH O HO Leucocyanidin OH OH OH + O2 OH OH Quercetin O HO OH OH O II.5 Các axit phenol cacboxylic Axit phenol cacboxylic nhóm chất tự nhiên có thực vật Đặc điểm nhóm chất phân tử chúng có chứa nhóm phen phenol nhóm cacbonyl Trong chè tươi có chứa nhiều chất thuộc nhóm axut phenol cacboxylic như:  Axit gallic ellagic: 49 Axit gallic Axit ellagic  Axit metadigallic: HO OH OH OCO HO HO COOH  Axit chlorogenic (cafeil-3-quinic) Axit cafeic: Axit chlorogenic Axit cafeic Axit para - coumaric Axit galloylquinic (teogallin): Axit para - coumaric Axit galloylquinic 50 Hàm lượng hợp chất phenolcacboxylic chè không cao lắm, nhiên chúng góp phần tạo nên vị chè III Phân tích thành phần hợp chất flavonoids chè.[21],[22],[23] Trong chè thành phần polyphenol chủ yếu hợp chất flavonoids Và hợp chất flavonoids có nhiều hoạt tính sinh học với giá trị quan trọng Do tìm hiểu nghiên cứu thành phần hợp chất flavonoids có ý nghĩa lớn Dưới phương pháp phân tích thành phần hợp chất flavonoids III.1 Định lượng polyphenol tổng số 1.phương pháp định lượng polyphenol (flavonoid) cách cân Nguyên tắc: Bột mẫu chè chiết thiết bị máy soxhlet với chloroform để loại hết nhựa, chất béo, caroten chlorophyl Sau loại bỏ hết bã bột chè dịch chiết, dịch đem sấy cho bay hết chloroform tiếp tục chiết soxhlet với ethanol 96% đến dịch chiết khơng cịn phản ứng shinoda Dịch chiết ethanol xác định thể tích cách xác Sau đem dịch chiết đuổi hết dung môi áp suất thấp sau chiết lại với nước nóng Tiếp tục chiết lại dịch với etylacetat Sau tiếp tục đuổi kiệt dung môi máy cất quay chân không tới trọng lượng khơng đổi cân xác cân kĩ thuật xác định hàm lượng flavonoid tổng số Phương pháp định lượng polyphenol tổng số phương pháp Folin – Denis Nguyên tắc : Cho hợp chất polyphenol có mẫu thực vật bị oxy hóa thuốc thử Folin – Denis tạo sản phẩm màu xanh lam Cường độ màu hỗn hợp tỷ lệ thuận với hàm lượng polyphenol dung dịch Căn vào cường độ màu đo máy so màu bước sóng 660nm đồ thị chuẩn axit gallic với thuốc thử xác địn hàm lượng polyphenol tổng số mẫu nghiên cứu Thuốc thử Folin – Denis gồm : Tung stat Walframat (Na2WO4.H2O) : 100g; Axit phosphomolypdic : 20g; Axit phosphoric 85% : 50ml; Nước cất : 750ml; Hỗn hợp đun cách thủy 2h, để nguội, dùng nước cất định mức đến vạch 1000 ml thuốc thử Folin- Denis Phương pháp định lượng polyphenol tổng số phương pháp Ferrous sulphate 51 Nguyên tắc : Định lượng polyphenol dịch chiết thuốc thử Ferrous sulphate Dựa sở pholyphenol có phản ứng tạo màu với ion Fe 2+ có thuốc thử Ferrous sulphate tiến hành đo cường độ màu Căn vào cường độ màu đo đồ thị chuẩn axit gallic với thuốc thử xác định hàm lượng polyphenol tổng số III.2 Định tính flavonoid phản ứng hóa học đặc trưng 1.phản ứng shinoda : Pha mẫu thử ethanol với lượng cho nhận dung dịch màu vàng nhạt(dung dịch thử) Sau cho vào vài giọt axit chlohydric đặc, chia dung dịch nhận vào ống : ống 1: dùng dể làm ống đối chứng ống : thêm vài mảnh Mg, đun nóng nồi cách thủy vài phút ống nghiệm xuất màu hồng, đỏ hay da cam chứng tỏ mầu thử có thành phần hợp chất flavonoids (kết phản ứng dương tính) Phản ứng với dung dịch kiềm Dung dịch thử Chia dung dịch vào ống ống : dùng làm đối chứng ống : nhỏ thêm vài giọt dung dịch NaOH phản ứng có kết dương tính xuất màu vàng, vàng da cam Phản ứng diazo Thuốc thử hỗn hợp thành phần sau: - Dung dịch I : paranitroanilin 0,5% HCl 2N - Dung dịch II : natri nitrit 5% nước cất - Dung dịch III : acetat natri 20% nước cất Khi dùng, trộn 2ml dung dịch I + 3-5 giọt dung dịch II đến màu dung dịch + ml dung dịch III ta dung dịch thuốc thử diazo Cho vào ống nghiệm 0,5 ml dung dịch thử thêm 2-3 giọt thuốc thử diazo Dung dịch cho màu da cam phản ứng dương tính Phản ứng với FeCl3 52 Nhỏ dung dịch FeCl3 1% nước vào ống nghiệm có đựng thuốc thử pha lỗng ethanol 96% Phản ứng có kết dương tính dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen Phản ứng định tính catechin Thuốc thử : dung dịch vanilin1% HCl đặc Nhỏ giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên giọt thuốc thử Kết cho màu đỏ son phản ứng dương tính Phản ứng với axit sunfuric Cho vào ống nghiệm ống 1ml dịch flavonoids toàn phần ethanol 96% (2 ống ống làm thí nghiệm ống đối chứng) Thêm vào ống thí nghiệm vài giọt axit sunfuric đặc Phản ứng cho màu xanh đậm cho thấy có mặt flavon flavanol; Phản ứng cho màu đỏ hay đỏ nâu cho thấy có mặt chalcon auron III.3 Phân tích sắc kí lớp mỏng quang phổ tử ngoại(UV-VIS) 1.Sắc kí lớp mỏng Sử dụng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F 254 Độ dày 0,2mm Từ dịch chiết flavonoid tổng số, tiến hành chạy sắc kí lớp mỏng chiều (bản mỏng 5x20) với hệ dung môi TEAF, phát màu sắc kí đồ điều kiện ánh sáng thường ánh sáng tử ngoại 365nm không phun thuốc thử có phun thuốc thử đặc trưng Từ màu sắc sắc kí đồ điều kiện khác cho phép xác định có mặt flavonoid phân nhóm chúng Qua sơ định hướng đặc điểm cấu tạo, có mặt vị trí nhóm phân tử Việc sử dụng chất flavonoid chuẩn góp phần khẳng định có mặt flavonoid có mẫu - Dung mơi: hệ TEAF toluen/etylacetat/aceton/axit formic 5:2:2:1 - Hiện hình: quan sát đèn UV 254 360nm - Phun dung dịch thuốc thử NaOH, diazo, vaninlin 1% Quang phổ tử ngoại (UV-VIS) 53 Thành phần flavonoid xác định phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại Dùng mỏng chạy sắc kí Sấy khơ tuyệt đối, từ cạo vết, vết cho vào ống nghiệm riêng Sau giải hấp phụ MeOH lần, lần 5ml, đun sôi nhẹ nồi cách thủy lọc Dịch lọc dùng để xác định hấp thụ tia tử ngoại máy quang phổ tử ngoại GBC instrument- 2855 quét liên tục bước sóng 200- 600 nm III.3 Phân tích sắc kí lỏng trung áp (MPLC) Thực thiết bị Backstrom SEPARO AB, sử dụng bơm định lượng trung áp QD-OSsy nén dung môi qua cột tách (tốc độ dòng 0-100ml/phút, áp lực nén 0,5-6,9 bar) Cột tách cao 100-250mm; đường kính 20mm; nhồi chất hấp phụ silicagel Merk 60 (cỡ hạt 10-40  m) nén chặt thiết bị chuyên dùng Thuốc thử hoa tan MeOH, dung dịch tẩm vào silicagel Merk 60 (cỡ hạt 10-40  m, sau dung môi bay hết, đưa silicagel có tẩm thuốc thử lên đầu cột tách thiết bị MPLC Cột tách nhồi silicagel đến độ cao 15cm Rửa giải tiến hành với tốc độ 5ml/phút/ phân đoạn theo Gradient dung môi: CHCl 3/MeOH với tỷ lệ: 49/1; 9/1; 4/1; 2/1; 1/1; 0/1 Gom phân đoạn thu nhóm có thành phần III.4 Phân tích sắc kí lỏng cao áp (HPLC) Các phần chiết phân tích sắc kí lỏng cao áp HPLC với điều kiện phân tích : Cột: YMC HPLC column J’sphere DOS-H80 (150 x 4.6mm I.D S-  m,8nm) Pha tĩnh: DOS –H80 Pha động: A = 2% axit acetic, B = 100% acetonitrile Gradient tuyến tính: 6% đến 40% B 40 phút sau 100% B trong phút Gradient tuyến tính: 11% đến 32% B 55 phút , sau 100% B phút Tốc độ dịng: 1ml/phút ; thể tích mẫu 10  l ; Detector : UV-VIS Chất chuẩn: C, GC, EC, EGC, EGCG, theaflavin, quercetin, quercitrin, kaempferol glucozit, kaempferol 3- rhamnozyl glycozit,… III.5 Phân lập chất tinh khiết phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) điều chế Sắc kí lớp mỏng điều chế silicagel G, độ dày 1mm Tiến hành chạy sắc ký điều chế mỏng 20x20cm (SiO2, CM), lượng mẫu đưa lên bảng mỏng 20mg flavonoid tổng số, số mỏng dùng cho lần điều chế Bản mỏng sau chạy sắc kí tiến hành giải hấp phụ chất , chất giải hấp phụ từ silicagel methanol lặp lại lần 54 điều kiện có khuấy từ nhiệt độ 50 C/30 phút/ lần Gộp tất dịch thu sau lần giải hấp phụ, cất đuổi dung môi điều kiện áp suất thấp ta chất III.6 Nghiên cứu cấu trúc chất tinh khiết thu Các chất tinh khiết thu tiếp tục thu phân tích cấu trúc phương pháp hóa lý Điểm nóng chảy đo máy đo điểm nóng chảy Butchi Cấu trúc hợp chất khảo sát nhờ sụ kết hợp phương pháp phổ: phổ hồng ngoại(IR), phổ lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân H NMR, 13C NMR Phổ hồng ngoại (IR) ghi máy Impact 410- Nicolet FT-IR Phổ khối lượng (MS) ghi máy Hawlett Packad 5890, Serie II Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ghi máy Bruker AM400 IV Phân tích hoạt tính sinh học chế phẩm flavonoid.[24],[25],[26],[27] IV.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa chế phẩm flavonoid thông qua ảnh hưởng lên hoạt độ peroxydaza máu người theo phương pháp E.C.Xavron Nguyên tắc: Dựa sở xác định tốc độ phản ứng oxy hóa indigocarmin H 2O2 môi trường axit yếu có mặt peroxydaza máu người Trong thí nghiệm xác định ảnh hưởng flavonoid lên phản ứng oxy hóa indigocarmin Thông qua thay đổi hoạt độ ezym có mặt flavonoid nồng độ khác IV.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa hợp chăt polyphenol chè xanh Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua ảnh hưởng lên q trình peroxy hố lipit màng tế bào gan chuột.[24],[25] Nguyên tắc: trình peroxy hóa lipit(POL) xảy phản ứng dạng oxy hoạt động với chất hữu thể, chủ yếu axit béo chưa no tổ chức màng Sản phẩm trình POL dialdehyt malonic (MDA), ankan (etan, pentan)….Xác định lượng sản phẩm trình POL hình thành nhiều hay để đánh giá mức độ q trình POL mạnh hay yếu suy tương quan dạng oxy hoạt động chất chống oxy hóa thể tăng hay giảm Kết xác định qua lượng MDA hình thành trình POL dịch đồng thể gan theo phương pháp G.Blagodorov phản ứng với axit thiobarbituric để tạo thành phức có màu hồng, với độ hấp thụ cực đại với  max = 532nm Đo cường độ màu phức bước sóng suy lượng MDA có mẫu Hoạt tính chống oxy hóa flavonoid đánh giá tỷ lệ phần trăm MDA giảm mẫu có flavonoid so sánh với mẫu đối chứng (khơng có flavonoid) 55 sử dụng phương pháp điện hóa nghiên cứu chống oxy hóa polyphenol Nguyên lý: hợp chất polyphenol tự nhiên có khả oxy hóa mạnh, theo phản ứng redox chug sau: Re1-ne +Ox2 =Ox1 + Re2 (1) Trong Re1 kí hiệu hợp chất polyphenol tự nhiên, chất khử, Ox1 sản phẩm oxy hóa chất polyphenol , n số điện tử e Re1 đi, Ox2 Re2 cặp redox môi trường Trong thực tế Ox2 gốc tự do, đặc biệt thể người, tác dụng khử gốc tự phòng chống ung thư quan trọng họ hợp chất Nếu phản ứng xảy điện cực, điện tử chuyển qua điện cực tạo dịng điện Faraday, đo xác, từ xác định định lượng nồng độ chất phản ứng Mặt khác, phản ứng redox (1) xảy mức lượng hoạt hóa  G xác định, có tính đặc trưng cho phản ứng Mức lượng hệ điện hóa thể điện điện cực E, tính chuyển đổi (về mặt động học theo cơng thức đổi:  G =-n.F.E Trong F số Faraday, n số điện tử phản ứng Như điều kiện định xác định điện phản ứng E có tính đặc trưng cho chất oxy hóa Trên sở xác định định tính polyphenol từ mối tương quan điện phản ứng so sánh xác định khả chống oxy hóa mạnh hay yếu chúng IV.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bảo gan chuột bị nhiễm độc CCl hợp chất flavonoid.[24] Nguyên tắc: thử nghiệm với lơ chuột thí nghiệm gây độc cách tiêm cho uống chất độc CCl4 ta dùng chế phẩm flavonoid tiến hành điều trị cho chuột bị độc cách cho chúng uống chế phẩm nồng độ khác sau theo dõi qua thời gian 24h,72h … tiến hành giết chuột thí nghiệm lấy máu xác định số AST (Alanin amino transferase) ALT (Aspartate amino transferase), định lượng MDA Cũng tiến hành xác định số với chuột đối chứng Lô đối chứng (-) chuột hồn tồn khỏe mạnh k bị gây độc Lơ đối chứng (+) chuột bị gây độc không điều trị chế phẩm So sánh kết lô thí nghiệm với lơ đối chứng thấy tác dụng bảo vệ gan bị nhiễm độc chế phẩm flavonoid IV.4 Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật.[26],[27] 1.Định tính kháng khuẩn theo phương pháp khoang giấy 56 Nguyên tắc: dựa khuếch tán hoạt chất vào mơi trường có cấy vi sinh vật Kiểm định khả ức chế vi khuẩn chế phẩm đánh giá qua đường kính vịng kháng kháng khuẩn Định lượng kháng khuẩn theo phương pháp hệ nồng độ Nguyên tắc: phương pháp định lượng kháng khuẩn nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh hay yếu chế phẩm thông qua giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) (nồng độ mà giới hạn vi khuẩn khơng phát triển được) chất kháng khuẩn IV.5 Nghiên cứu tác dụng chống viêm động vật thực nghiệm Nguyên tắc: Tiến hành thử tác dụng chế phẩm lên chuột gây viêm theo mơ hình Courvoisier Tiêm 0,1 ml dung dịch dextran 5% gang bàn chân chuột đẻ tạo viêm tấy Đánh giá tác dụng chống viêm cách đo độ phù chân chuột Xác định khác biệt lô chứng (-) lô không bị viêm phù, lô chứng dương (lô bị viêm phù mà không dùng chế phẩm) lơ thí nghiệm (lơ bị viêm phù có sử dụng chế phẩm) IV.6 Nghiên cứu tác dụng kìm hãm phát triển ung thư in vivtro Nguyên tắc: Đánh giá độc tính chế phẩm tế bào ung thư nuôi cấy cách so sánh phần trăm tế bào sống - chết bổ sung chế phẩm.vào môi trường nuôi cấy (sau thời điểm bắt đầu nuôi cấy tế bào 0h, 12h,24h,48h,72h,…) với mẫu đối chứng không cho chế phẩm Tác dụng gây độc tế bào thử với dịng tế bào ung thư biểu mơ người (carcinoma) Hep-2, tế bảo u tủy chuột Sp-2/0 Sarcoma S-180 IV.7 Nghiên cứu hoạt tính chống ung thư chống di ung thư động vật thực nghiệm Nguyên tắc: Dùng dòng tế bào S-180 với số lượng 5x10 tế bào tiêm vào đùi chuột Các tế bào ung thư S-180 phát triển mô liên kết xen mô để gây ung thư cho chuột Điều trị chuột mang ung thư chế phẩm flavonoid đánh giá khả hạn chế phát triển tế bảo ung thư chế phẩm số Growth Delay (GD) so sánh lô chứng (chuột khỏe mạnh k uống chế phẩm) lơ thí nghiệm (chuột bị ung thư điều trị chế phẩm) qua thời điểm khác 5,6,12,14 ngày Và khả hạn chế di tế bào ung thư từ u đùi lên gan phổi: tác dụng hạn chế di đánh giá thông qua việc đếm nốt di kính núp IV.8 Xác định độc tính cấp chế phẩm động vật thực nghiệm 57 Nguyên tắc: Dựa theo nguyên tắc thử độc tính cấp thuốc theo Wallace Hayes Dùng chuột làm thí nghiệm Dùng chế phẩm với liều để thăm dò gây độc động chuột cách cho chuột nhiều nhóm khác nhóm có liều lượng riêng uống ổn đinh ngày Sau theo dõi chuột ngày kể từ ngày bắt đầu cho uống thuốc So sánh với mẫu đối chứng, ghi nhận biểu lâm sàng nhận xét kết Kết luận Nhóm hợp chất polyphenol nhóm rộng lớn, phức tạp mà nghiên cứu nhóm hợp chất trải qua thời gian dài nghiên cứu tìm hiểu, thực nghiệm nhà khoa học tìm cơng thức cấu tạo tính chất đặc trưng cho nhóm hợp chất Với tính chất phong phú phản ứng phức tạp tạo cho nhóm hợp chất hoạttính sinh học đáng q, có ích lợi lớn cho người phản ứng gốc tự để chống oxy hóa từ chống lại nhiều bệnh tật người Chuyên đề bước đầu tìm hiểu hợp chất phenolic vào nghiên cứu hợp chất polyphenol chè Các cơng thức cấu tạo tính chất chủ yếu nhóm hợp chất tìm hiểu nghiên cứu Để ứng dụng sử dụng hợp chất cách có ích lợi ứng dụng rộng rãi người cần nghiên cứu sâu có nhiều thực nghiệm để kiểm tra đặc tính khác tiềm ẩn hợp chất mà chưa biết Do dựa vào kiến thức để sâu vào nghiên cứu biến đổi sinh hóa hợp chất polyphenol chè 58 Tài liệu tham khảo Wilfred Vermerris Ralph Nicholson (2006) Phenolic compound biochemistry Hà Thị Thanh Bình – luận án tiến sĩ sinh học Phenolic compounds; http//www.bilogie.uni-humburg.de/b-online/e20/20d.htm FLAVONOID http://www.friedli.com/herbs/phytochem/flavonoids.html Bio-Flavonoid; http://www.suckhoecongdong.com/content/view/830/104/ Harborn J.B, Mabry TJ and Mabry H (1975), The flavonoids, Academic press, London and Newyork Bùi Thế Trường ‘ Tìm hiểu trà xanh’ http://www.khoahoc.net/baivo/buithetruong/timhieuvetraxanh Nghiên cứu khả chống ung thư thành phần flavonoid chiết xuất từ số cay thuộc chi CLERODENDRON Việt Nam - Hà Việt Hải - Hồng Thanh Hương, Nguyễn Hữu Khơi - Viện hóa học hợp chất thiên nhiên -Trung tâm KHTN CNQG Catherine A Rice – Evans, Nicholas J Miller and George Paganga; Antioxidant properties of phenolic compounds; trends in plant science reviews; p 152 – 154 59 10 Nguyễn Thị Hải Hà, luận văn thạc sỹ, p20 – 30 11 Lawrance Peter Wright, Biochemical analysis for identification of quality in balck tea (Camellia sinensis), Doctoral Thesis, University of Pretoria, South Africa, 2005 12 Tống Văn Hằng, Cơ sở sinh hóa kĩ thuật chế biến trà, Tp.HCM, 1985 13 Hóa sinh cơng nghiệp – Lê ngọc tú P 249 – 282 14 Qiong Guo, Baolu Zhao, Shengrong Shen, Jingwu, Jungai Hu, Wenjuan Xin, ERS study on the structure – antioxidant activity relationship of tea catechins and their epimers, Biochimia et Biophysica Acta 1427, p 13-23, 1999 15 Yukiaki, Yukihiko Hara, Antimutagenic and anticarcinogenic acitivity of tea polyphenols, Mutation Reasearch 436, p 69 – 97, 1999 16 Ngô Văn Thu, Bài giảng dược liệu, BM Dược liệu ĐH Y Dược Tp.HCM, BM Dược liệu ĐH Y Dược Hà Nội, Hà Nội, 1998 17 J.C.CHEFTEL,H.CHEFTEL Introduction la biochimie et la technologie des aliments, Pari, 1992 18 D.I Tsimigiannis, V.Oreopoulou, Free radical scavenging and antioxidant activity of 5,7,3’,4’ – hydroxy substituted flavonoids, Innovative food science and emerging technologies 5, p 523 – 528, 2004 19 Hemingway, R.W, Larks, Polyphenol plant, Lees G.L, 1992 20 Dr.Parul Lakhanpal, MD and Dr Deepak Kumar Rai, MD (29/3/2007) Quercetin: aversatile flavonoid 21 Harborn J.B (1964), Biochemistry of phenolic cpmpounds, Acedemic press, London and New York 22 Harborne JB, Mabry TJ and Mabry H (1975) The Flavonoids Academic Press, New York 23 Harborn J.B (1994), The flavonoids advances in research since 1980 Chapman& Hall 24 Nguyễn Quang Trường (1995),’ Các phương pháp xác định số xu hướng nghiên cứu thuốc gắn với q trình peroxy hóa ‘ Tạp chí dược học ,3, tr 23-26 25 Blagodorov (1987) ,Pharm Chemi J.N0 1987;p292-299 60 26 Beale J.M (2004) Antibacterial antibiotics Wilson and Gisvold’s Textbook of Organic Medicinal and Pharmaceutial Chemistry Lippincott Williams$ Wilkins New York 11 th ed pp.299-366 27 NCCLS,(2000) Method for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; Approved Standard – fifth edition, p,6-13 Vol.20, N0 Pennzylvania, USA 61 ... Hợp chất catechin - Hợp chất anthoxanthin - Hợp chất anthocyanin - Hợp chất leuco anthocyanidin - Các axit phenol cacboxylic số chất khác II.1 Hợp chất catechin Các hợp chất catechin có chè Hợp. .. 23 Sinh tổng hợp flavonoid [20]: 26 Tính chất hợp chất flavonoids 29 II Các hợp chất polyphenol chè 35 II.1 Hợp chất catechin 36 Các hợp chất catechin... cứu, sơ đồ sinh tổng hợp sau đề nghị cho hợp chất catechin chè: Hình 1.35: Chu trình sinh tổng hợp hợp chất 42 catechin II.2 Hợp chất anthoxanthin [13] Giới thiệu chung Các hợp chất anthoxanthin