Phân lập tuyển chọn các chủng bacillus có khả năng sinh tổng hợp biofilm và nghiên cứu ứng dụng biofilm trong việc ức chế sự phát triển một số vi sinh vật gây hại

ĐẠI HỌC QUOC GIA HẢ NỘI T R Ư Ờ N G Đ Ạ I H Ọ C K H O A H Ọ C T ự N H IÊ N - # s o P h â n n h lậ p , tu y ể n tổ n g h ợ p c h ọ n b io film tro n g v iệ c ứ c c h ế s ự c c c h ủ n g B a c illu s c ó k h ả n ă n g v n g h ỉê n p h t tr iể n u ứ n g d ụ n g m ộ t s ố v ì sin h b io film v ậ t g â y M ã số: Q G 1 -1 C h ủ tr ì đ ề tà i: P G S T S N g u y ễ n Q u a n g H u y H À NỘI - 2013 h ỉ ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI T R Ư Ờ N G Đ Ạ I H Ọ C K H O A H Ọ C T Ụ 'N H IÊ N Vr* * ilr■*Vc* * * P h â n tố n g lậ p , tu y ế n h ọ p v iệ c ứ c ch ọ n b io film ch ế v cá c c h ủ n g B a c illu s c ó n g h iê n p h t tr iể n u ứ n g d ụ n g m ộ t số v i sin h k h ả n ă n g b io film sin h tr o n g v ậ t g â y h i M ã số: Q G 1 -1 Chủ trì đề tài: PG S.T S N g u y ễ n Q u a n g H u y Cán tham gia: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, TS Phạm Bảo Yên, ThS Trần Thị Hằng, ThS N gơ Thị Kim Tốn, ThS Nguyễn Thị Giang, CN Đoàn Diệu Linh, CN Trịnh Thị Hiền, CN Nguyễn Thị Phương Liên H N ộ i-2 L Ờ I C Ả M ƠN Đ ê t i th ự c h iệ n c ỏ s ự t i t r ợ k in h p h i c ủ a Đ i h ọ c Q u ỏ c G i a H N ộ i , n h â n d ị p n y , t ậ p t h ê c n b ộ th ự c h iệ n đ ê t i x in b y tỏ l ò n g b i ê t n s â u s ă c t i s ự q u a n tà m ủ n g h ò v g i ú p đ ỡ c ù a Đ i h ọ c Q u ố c g i a H N ộ i T ậ p th e t c g i ả x in g ì n l i c m n s â u s ă c t i lã n h đ o T r n g Đ i h ọ c K h o a h ọ c T ự n h iê n , c c p h ò n g b a n c h ứ c n ă n g c ù a n h t r n g đ ặ c b i ệ t p h ò n g K h o a h ọ c v C ô n g n g h ệ , p h ỏ n g K ê h o c h t i vụ Đ ê t i th ự c h iệ n c ó s ự t o đ i ê u k iệ n v ề t r a n g th i ế t b ị, c s v ậ t c h t c ù a B a n C h ù n h iệ m K h o a S in h h ọ c , B a n G i m đ ỏ c P h ò n g th í n g h iệ m t r ọ n g đ i ê m C ò n g n g h ệ E n z y m v P r o t e i n , t ậ p th ê t c g i ả x in g i l i c ả m n tr ù n tr ọ n g C u ô i c ù n g , t ậ p t h ê t c g i ả x in g i l i c m n đ è n c c c n b ộ , s in h v iê n , h ọ c v iê n c a o h ọ c đ ã v đ a n g m v i ệ c P h ò n g e n z y m h ọ c v p h â n tíc h h o t tín h s in h h ọ c , p h ò n g t h í n g h iệ m t r ọ n g đ i ê m C ò n g n g h ệ E n zy m v P r o t e i n , B ộ m ô n S in h l ý th ự c v ậ t v H ó a s in h , K h o a S in h h ọ c đ ã h ợ p t c v ê c h u y ê n m ô n t r o n g q u tr ìn h t h ự c h iệ n đ ề t i n y H N ộ i, n g v t h n g n ă m T h a y m ặ t n h ỏ m n g h iê n c ứ u - - ; - Ị -i B o c o tô n g k ê t đ ê tà i Q G 1 - D A N H SÁ C H N H Ữ N G N G Ư Ờ I T H Ụ C H IỆ N ĐÈ TÀ I PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Trường Dại học Khoa học Tự nhiên, ĐHỌGHN PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN TS Phạm Bao Yên,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHỌGHN TS Phạm Bao Yên Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN ThS Ngơ Thị Kim Tốn, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN T hs Nguyền Thị Giang, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN CN Đoàn Diệu Linh,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG H N CN Trịnh Thị Hiền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQ G H N CN Nguyền Thị Phương Liên, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN - , -J - ^ ii B o c o tò n g k ê t đ ê tà i Q G 11 -1 TÓM TẮT ĐÈ TÀI NGHIÊN c ứ u KHOA HỌC l ê n đ ề tài: P h ân lập, tu y ê n c h ọ n c c c h u n g B a c i l l u s c ó k h a n ă n g s in h tô n g h ợ p b i o f i l m nghiên cứu ứng dụng biofilm việc ức chế sụ phát triển số vi sinh vật gây hại M ã số: ỌCi 11- 16 ( q u an chủ quán: Đại học Ọuốc gia Hà Nội ( o q u a n trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHỌGHN Chú trì đề tài: PGS.TS Nguyễn Quang Huy Các cán th a m gia: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, TS Phạm Bảo n, ThS Ngơ Thị Kin Tốn, ThS, Trần Thúy Hằng, ThS Nguyễn Thị Giang, CN Nguyễn Thị Phương Liên, CN Trịnh Thị Hiền CN Đoàn Diệu Linh Thoi gian thực hiện: từ 8/2011- 5/2013 K i r h p h í : 0 0 ( M ộ t tr ă m b ả y m i t r i ệ u đ ò n g ) Mục tiêu nội dung nghiên cứu: M ụ : tiê u : P h â n lập, t u y ê n c h ọ n c c c h ủ n g B a c i l l u s c ó h o t tín h tạ o b i o f i l m , n g h i ê n u ứnị dụng biofilm đê ức chế phát triển số vi sinh vật gây hại NộidurìịỊ' Phân lập tuyển chọn chùng vi sinh vật từ điều kiện mơi trường, sinh thái khác có hoạt tính tạo bioíĩlm NgHên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa khả phát triển tạo biofilm cùa sơ (hung Bacillus có hoạt tính tạo biofilm mạnh đồng thời có hoạt tính ức chế phát triểa số vi sinh vật gây bệnh Bưrc đầu xây dựng quy trình lên men quy mơ phịng thí nghiệm với chủng Bacillus rghiên cứu thừ nghiệm sản phâm Các k ế t q u ả đ t đ ợ c : K ế t khoa học - Đà phân lập 90 chung vi sinh vật từ nguồn đất, nước nông nghiệp n c c thai c ó h o t tính tạ o b i o í ì l m - Đi tuyên chọn, phân loại 05 chung Bacillus có hoạt tính tạo biofilm đồng thời có tie dụng ức chế sinh trương số nhóm sinh vật gây hại - Ị iii Báo cáo tông kêt đê tài QG 11-16 - Eã x â y d ự n g q u y trình tạ o b i o f i l m từ 01 c h u n g B a c i l l u s ứ n g d ụ n g c h o v i ệ c p h ò n g chcng số nhóm vi sinh vật gây bệnh K e, q u ả ú n g d ụ n g : - X ây d ự n g 01 q u y trình lên m e n c h u n g B a c i l l u s có h oạ t tính tạ o b io f i lm v b c đầt thư nghiệm có hoạt tính ức chế phát triển vi khuân gây bệnh thực vậl K ếi q u a c ô n g b ỏ : - Đì cơng bơ 06 cơng trình gơm 01 báo toàn văn tiếng Anh hội nghị khoa học qucc tế (thành phố Hồ Chí Minh), 02 báo tiếng Anh tạp chí Khoa học (Đ1IQGHN), 02 háo tiếng Việt tạp chí Sinh học tạp chí Khoa học (Viện Khja học Cơng nghệ Việt Nam) 01 báo cáo Hội nghị quốc tế (phối hợp với trương Đại học Sogan, Hàn Quốc) N g u y e n Q uang H uy, N guyen Thi Phuong L ie n , Tran Thuy Hang, 2011 Characterization o f biofilm-forming bacteria isolated from soil in Vietnam Journal of Sciince VNU 27 (2S): 187-193 'ran T h u y H a n g , N g u y e n Q u a n g H u y , 1 I s o la te b i o f i l m f o r m i n g B a c i l l u s strains from contamination site in trade villages in Vietnam Journal o f Science VNU 27 (2S): 157-162 Nguyễn Ọuang Huy, Tran Thúy Hang, 2012 Phân lập chủng B a c illu s có hoạt tint tạo màng sinh vật (bioíĩlm) tác dụng kháng khuân chúng Tạp chí Sinh học 34(1): 99-106 Tỉguyen Ọuang Huy, Trinh Thi Hien, Ngo Thi Kim Toan, Pham Bao Yen, 2012 Biớìlm forming bacteria isolated from wastewater in Vietnam International synposium on Green technology and Sustainable development Ho Chi Minh city 2930/ 1/2012, pp : 13-19 ĩíguyen Ọuang Huy, Nguyen Thi Phuong Lien, Tran Thuy Hang, Isolation and Characterization o f Biofilm- forming bacterial strains from contamination sites in Vienam 1st HUS- SOGANG Internationa] symposium on Advance research and T r a m n g , H a n o i 15 F e b , 2 T'guyen Quang Huy, Đoàn Diệu Linh, Nguyễn Thị Giang, Ngơ Thị Kim Tốn, 2012 Đặc điêm sinh học hai chung vi khuân tạo biofilm phân lập từ nước thai ri rác Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 50(3D): 127-134 - iv ^ — - B o c o tô n g k ê t đ ẻ tà i Q G 1 - Kết qua đào lạo : Pào lạo 03 thạc sĩ chuyên ngành sinh học thực nghiệm: Trần Thị Hằng, tốt ng hệp năm 201 1; Nguyền Thị Giang, tốt nghiệp năm 2012; Ngơ Thị Kim Tốn, tốt ngh ệp năm 2012 ~ Pào tạo 03 cư nhân neành sinh học: Doàn Diệu Linh; Trịnh Thị Hiền Ngtyền Thị Phương Liên, tốt nghiệp năm 2011 03 cư nhân ngành sinh học công nghr sinh học tốt nghiệp 6/2013 Thanh tốn để tài: Đã hồn thành C h ủ n h i ệ m K h o a Sinh học C h ủ tr ì đề tài L Il u ỉ P G S TS N g u y ễ n Ọ u a n g H u y T R Ư Ờ N G ĐẠ• I H Ọ• C K H O A H Ọ• C T Ụ• N H I Ê N V B o c o t ò n g k ê t đ ề t i OCì 1 - SUMMARY P roject: Isolation o f biofilm formation active B a c illu s strains and effects of biofilm for pathogenic bacteria C o d e : QG 1-16 M anaging Institution: N a t i o n a l U n i v e r s i t y Hanoi Implementing Institution: VNU, Hanoi University o f Science K ey im p lem en te r: N gu y en Q uang Huy, PhD P articip an ts: B u i T h i V i e t H a , P h D ; P h a m B a o Y e n , P h D ; Tran T h i H a n g , M S c ; N g o Thi Kim Toan, MSc; Nguyen Thi Giang, MSc; Doan Dieu Linh, BSc; Trinh Thi Hien, BSc and Nguyen Thi Phuong Lien, BSc D uration : from 8-2011 to 5-2013 B udg et : 170,000,000 V N D O b je c ti v e s a n d m a i n actives: Objectives: Isolation and characterization o f biofilm- forming Bacillus strains from contamination sites in Vietnam and applied M ain activities: Isolate bacteria strains which have biofilm forming activated from sites in Vietnam Study on physiological and biochemistry characteristics o f Bacillus strains selected and characterization of biofilm forming and antibacterial activities o f them Establish a standard operating procedure for fermentation one Bacillus strain and research on applying Results Scientific results: Isolated more than 90 strains from soils, waters and wastewater have biofilm forming activity V/ B o c o tỏ n g k ê t đ è tà i Q G 1 -1 Selected and characterized 05 B a c illu s strains which have b i o f i l m forming activity and antibacterial I stablished a standard operating procedure for fermentation one Bacillus strain PuHications: Nụuyen Quang Huy, Nguyen Thi Phuong Lien, Tran Thuv Hang, 2011 Characterization of biofilm-forming bacteria isolated from soil in Vietnam Journal o f Science VNU 27 (2S): 187-193 Tran T h u y H a n g , N g u y e n Q u a n g H u y , 1 I s o la te b i o f i l m f o r m in g B a c i l l u s strains from contamination site in trade villages in Vietnam Journal o f Science VNU 27 (2S): 157-162 N g u y ễ n Q u a n g H u y , Tran T h ú y H a n g , 2 Ph ân lập c c c h u n g B a c i l l u s c ó h oạ t tính tạ o m n tỉ s in h vậ t ( b i o f i l m ) v tác d ụ n g k h n g k h u â n c ủ a c h ú n g T p c h í S in h học (1): 99-106 N g u y e n Q u a n g H u y , T rinh T hi H ie n , N g o T hi K im T o a n , P h a m B a o Y e n , 2 B io film fo r m in g b a cte ria i s o la t e d fr o m w astew ater in V ietn am In ternation al symposium on Green technology and Sustainable development Ho Chi Minh City 29-30/11/2012, pp: 13-19 Nguyen Quang Huy, Nguyen Thi Phuong Lien, Tran Thuy Hang, Isolation and Characterization o f Biofilm- forming bacterial strains from contamination sites in Vietnam 1st HUS- SOGANG International symposium on Advance research and Training, Hanoi 15 Feb, 2012 Nguyền Ọuang Huy, Đoàn Diệu Linh, Nguyền Thị Giang, Ngơ Thị Kim Tốn, 2012 Đặc điêm sinh học cùa hai chủng vi khuân tạo biofilm phân lập từ nước thải ri rác T p c h í K h o a h ọ c C ô n g n g h ệ ( D ) : - Resỉarch training: Contribution in training bachelor’s degree: Contribution in training m aster’s degree: Bucgct: Payment in full 17/ - , ——— B o c o t ỏ n g k ê t đ ê tà i Q G 1 - B Ả N G KÍ H I Ệ U V I É T T Ấ T APS Amoniuni persulfate Per sunphat anion bp Base pair Cặp base cv crystal violet Tím kết tinh CSLM scan lazer microscope Kính hiên vi tiêu điẻm quét EPS Extracellular Polymeric Substances Hợp chất ngoại bào kl)a Kilo Dalton Kilo Daltơn LB Luria Bertani Môi trường LB LPS Lipopolysaccharide lipoppolysacaride PAGE Poly Acrylamide Gel Electrophorensis Điện di gel polyacrylamide PNA polysaccharide polysaccharide nội bào PNAG poly-N-acetylglucosamine poly-N-acetylglucosamine TEMED Tetra methyl ethylene diamin Tetra methyl ethylene diamin SDS Sodium Dodecyl Sulfate Sodium Dodecyl Sulfate SEM Scaning electro microscope Kính hiển vi điện tử quét VPS Vibrio polysaccharide Polysacarit chủng Vibrio w/v Weight (g)/volume (ml) Khối lượng (g)/thể tích (ml) - _ - í — —— -viii B o c o tỏng, k ê í đ ê t i Q G 1 - tuyên chọn TS Bùi Thị Việt Hà CN Trần Thuý Hằng Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Thành viên Thử nghiệm ức chế cùa số nhóm vi sinh vật có hại trồng, ăn mòn kim loại từ biofilm cùa chùng Bacillus tuyển chọn Thành viên Đánh giá tối ưu điều kiện sinh lý sinh hóa cửa số chùng Bacillus lựa chọn việc hình thành biofilm Tối ưu điều kiện lên men quy mơ phịng thí nghiệm tạo bìo 20 II MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ SẢN PHÀM D ự KIÊN 10 - Mục tiêu F’hân lập tuyển chọn chùng Bacillus có khả tạo biofilm Nghiên cứu úng dụng biofilm để ức chế phát triển vi sinh vật gây hại 11 - Nội dung nghiên cứu khoa học (Nêu rõ nội dung khoa học, công nghệ cần giải quyết, ý nghĩa, hiệu quà cùa việc nghiên cửu, phướrng Ún g iả i quyết, chi rõ nội dung mới, tính kế thừa phát triến, nội dung có tínhrủi ro g iã i p h p khắc p h ụ c , g h i rõ cá c chuyên đề cần thực tron g n ội dung) Nội dung 1: Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus từ điều kiện mơi trường khác Ctó hoạt tính tạo biofilm - C h u yên đề 1: Phân lập số chủng Bacillus hệ sinh thái khác - Chuyên đề 2: Sàng lọc chủng Bacillus phân lập chủng cỏ để tuyển clhọn chùng cỏ hoạt tính tạo biofilm mạnh C h u yên đề 3: Phân loại chủng B acillu s có hoạt tính phucmg pháp hình thái kết hợp với c;ác đặc điểm sinh lý, sinh hóa phưcmg pháp sinh học phân tử qua so sánh trình tự gen Nội dung có kế thừa phương pháp phán lập vi sinh vật có tính cách thức sáng’ lọc chùng Bacillus có hoạt tính tạo biofilm lần đầu Việt Nam Nội dung 2: Nghiên cửu đặc điểm lý hóa, thành phần biofilm từ Bacillus'.; xây diựng quy trình tạo biofilm quy mơ phịng thí nghiệm c,'huyên đề 1: Nghiên cứu lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp, đặc điểm sinh học tối ưm cho phát triển tạo biofilm từ chủng Bacillus tuyển chọn Chuyên đề 2: Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo biofilm quy mơ phịng thí nghiệm clnùng Bacillus lựa chọn - Chuyên dề 3: Xác định số chất hoạt tính hình thành từ Bacillus, thành phần cùa I biofilm từ chùng B a cillu s tuyên chọn N ội Jung có tính kế thừa c c kết q nghiên cứu tố i ưu hóa điểu kiện ni cấ y vi sinh vật nhw m g việc x c định cấu trúc thành p h an hóa học cùa bio/ilm lần đầu nghiên cứu Việt Nam Thừ r nghiệm yếu to ảnh hướng đến q trình lẽn men quy mỏ phịng thí nghiệm Nộiiỉ dung 3: Bước đầu áp dụng thử nghiệm chủng Bacillus tạo biìlm ức chế phát triển ( số vi sinh vật có hại - ( Chuyên đề 1: Ảnh hường cùa biofilm từ Bacillus tuyển chọn với khả ức chế số vi sinh wật gây hại Pseudomonas, Xanthomonas - (Chuyên đề 2: Tác dụng cùa biofiim từ Bacillus tuyển chọn với khả nảng ức chế vi khuẩn kị khí 1*khử sunphat (Sulfate-reducing bacteria) gây ăn mòn kim loại Nội I dung đánh g iả hiệu quà sử dụng biofilm từ chùng Bacillus tuyến chọn với việc ức chế ^vi sinh vật có hại nơng nghiệp ăn mịn kim loại Tính nội dung việc có mặt m để thu nhận chế chẩm protease có hoạt tính cao dùng chế biến thực phẩm [3] Gần nhórm tác già Quyền Đình Thi cộng sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để nhân dòng đọc Itrình tự gen mã hố subtilisin từ chùng B subtilis GI vào vecto pAC7 để biểu B subtiilis WB800 Ngô Tự Thành nghiên cứu phân lập, tuyển chọn số chùng Bacillus có khà măng sàn xuất protease ngoại bào mạnh ứng dụng số lĩnh vực khác chế biến, sàn xuất da giày [1,2] Việc sử dụng hoá chất bảo vệ thưc vật nhàm tăng sản iượng nông nghiệp từ lâu phồ biển V iệt Nam với chùng loại thuốc bảo vệ thực vật rât đa dạng M01 năm Việt Nam sử dụng khoaảng 0 thuốc hoá học diệt sâu bệnh, việc tìm kiếm chùng vi sinh vật có B a ciillu s có tác dụng đối kháng vi sinh vật gây hại cần thiết N hiều chùng B acillus có hoạt tính I kháng khuẩn nhà khoa học nước phân lập Các nghiên cứu mặt cho thấy / tiềm hoạt tính sinh học quý cùa chủng Bacillus từ thiên nhiên Việt Nam !ớn T uy nhiên chưa công bố cơng trình nghiên cứu khoa học thức liên I quan đến màng sinh vật nói chung đặc biệt màng sinh vật từ chùng Bacillus Các ứng dụngg cùa Bacillus bao trùm hàng loạt ngành chuyên ngành với doanh sổ khổng lồ Tuy nhiên I nghiên cứu V iệt Nam lĩnh vực ứng dụng nghiên cứu nhỏm vi khhuẩn cịn q ít, rời rạc, phân tán chưa có hệ thống Chính việc phân lập, tuyển chọm nghiên cứu yếu tố ảnh hường đến việc hình thành biofilm từ Bacillus nhằm ứng dụng hết ssức cần thiết Nhóm tác giả đăng ký đề tài cán có kinh nghiệm việc tuyển chọn chùnng giống theo hướng công nghệ nhằm khai thác đa dạng vi sinh vật có Bacillus Việt Nam.1 Bàn thân chủ trì đề tài có đề tài, cơng trình báo cáo khoa học cơng bố ngoàài nước việc tuyển chọn chùng vi sinh vật có hoạt tính sinh học Trong sưu tập giống cùa nhónm tác già lưu giữ 100 chùng vi khuẩn Bacillus Hơn với điều kiện thiên nhiênn nhiệt đới nhiệt đới đa dạng, hồn tồn tìm nhiều chủng có hoạt tính monịig muốn Bởi vậy, v iệc nghiên cứu đa dạng loại B acillu s đặc biệt lồi B acillus có khả I sinh biofilm việc làm có ý nghĩa khoa học thực tiễn V iệc thực đề tài hồn tồn tìm kiếm tuyển chọn chùng vi sinh vật có tính tương đương vượt trội sso với chủng nước N hững nội dung cần nghiên cứu Đ ề tài, luận giải cần thiết, tính cấp bách, ý nghĩa lý luận ' thực tiễn ( Trênn c s đảnh g iả tình hình nghiên cứu n gồi nước, ph ân tích cơng trình nghiên cứti ccó liên quan, kết q u m i lĩnh vực nghiên cứu để tài, cần nêu rõ vấn để cịịn tồn tại, từ đ ó nêu đư ợc m ục tiêu nghiên cứu hướng g iả i qu yết mới, nội dung cần thực I - trả lờ i cá u h ỏi đ ề tà i nghiên cứu g iả i qu yết vấn đề gì) Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus có hoạt tính tạo biofilm: Bacillus vi khuẩn hàng ' đầu mặt ứng dụng, với doanh số hàng tỷ đôla, ngày nghiên cứu sâu nmở rộng ứng dụng Trong khí nghiên cứu V iệt Nam lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng ' nghiên cứu vi khuẩn cịn q rời rạc, phân tán, chưa có hệ thổngg Chưa có nguồn ồn định chùng Bacillus với hoạt tính sinh học quý Tại Việt Nam < chưa có nghiên cứu việc phân lập chùng vi sinh vật có hoạt tính tạo biofilm ĩ chưa có nhiều g trình nghiên cứu ứng dụng đánh giá hiệu sử dụng sản pbhẩm V iệc nghiên cứu trình hình thành, ứng dụng biofilm với vi sinh vật nói chung Bacillllus nói riêng cịn mẻ Việt Nam cần có đầu tư nghiên cứu Việc nghiên cứu thành cơng đề tài góp phần chủ động việc tạo sản phẩm có nguồn gốc sinh học từ vi sinh vật phân lập V iệt Nam Với thiên nhiên nhiệt đới nhiệt đới với đề tài tìm nhiều chủng Bacillus có hooạt tính mong muốn Bởi việc nghiên cứu tuyển chọn loài Bacillus có khả tạo biofilnm cịn góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật quý việc có ý nghĩa khoa học thực titiễn điều kiện V iệt Nam 10 Toi ưu hóa diều kiện lên men, xác định thành phần bỉìlm: Hiện có nhiêu đê tẵi có ý nghĩa việc tuyển chọn chùng vi sinh vật có hoạt tính sinh học chi dừng mức độ nghiên cứu chưa mạnh dạn ứng dụng sản xuất Với thiết bị lên men đầu tư cùa Phịrtig thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein mạnh dạn tiến hành sản xuất lên rmen quy mơ phịng thí nghiệm chùng Bacillus có hoạt tính tạo biofilm Xác định điều kiện tối ư-u v ê nhiệt độ, pH, hàm lượng chất dinh dưỡng, chất kích thích, kìm hãm cho việc tạo biofiilm từ Bacillus Biofilm coi ’’bioreactor” nên nội dung nghiên cứu thật s ự nội dung Việc xác định cấu trúc hóa học cùa biofilm từ Bacillus cùa đề tài nội dung thể mức độ liên ngành cao cùa đề tài N ội dung có tham gia cùa nhà vi sinh vật học, hóa học hóa sinh học Việc xác định cấu trúc hóa học giúp cho chất lượng nghiên cứu cùa đề tài nâng ca o kết thu đăng Hội nghị quốc tế K h i kháng khuẩn Bacillus có hoạt tính tạo biĩlm: Hiện đề tài nghiên cứu v/ề hợp chất có tính kháng khuẩn từ Bacillus khơng ít, nhiên lại số nhữnig đề tài đề cập đến việc kháng khuẩn đổi với nhóm vi sinh vật kị khí, khử sunphát có tác dụng ăn mòn kim loại Đây nội dung Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu đtề cập đến X ác định hoạt tính số enzym tham gia vào q trình sinh hình thành biofilm cùa chủng Bacilllus tuyển chọn Nội dung góp phần làm rõ chế sinh hình thành biofilm Đây tirong hướng nghiên cứu mà nhóm nghiên cứu chủ trì đề tài đã, tiến hành nhữnjg nă.m qua thể qua báo cơng bố ngồi nước 14- L„iệt ìkê danh mục cơng trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài trích dẫn khỉ điánh giá tổng quan I Ngô' Tụ Thành, 2004 Nghiên cứu sử dụng hai chủng Bacillus T20 M27 chế phẩm sinh học để tăng suất rau cải Brassica oleracea var albolabra bailey Tạp chí Kho'Ci học Đ ại học Quốc g ia Hà Nội ,2 : 167-172 Ngô Tự Thành, Vũ Thị Minh Đức, Bùi Thị Việt Hà, Chu Văn Mần, 2007 Bacillus từ v ù n g sinh thái khác nghiên cứu đặc tính sinh học chủng Tạp ch í Khotữ học Đ ại học Quốc g ia Hà Nội., 23: 36- 39 Nguyễn Hoàng Lộc, Nguyễn Văn Song, Hoàng Tấn Quảng, Lê Đức Dũng, Dương Đức Lợi, Trưang Thị Bích Phương, Đỗ Thị Bích Thủy, 2008 Cloning and expression of neutral iprotease gene from Bacillus subtil is, Tạp Công nghệ sinh học., 6: 963-970 Asaj.a o and Shoda M, 1996 Biocontrol of Rhizoctonia solani damping off of tomato with S a c i llus subtilis RB14 Appl Environ M icrobiol., 62: 4081-4085 IBais HP, Fall R Vivanco JM, 2004 Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arahidopsis roots by Pseudom onas syringae is gacilitated by biofilm formation and surfactin [production, Plant physiology., 134: 307-319 (Costerton w, Veeh R, ShirlifT M, Pasmore M, Ehrlich G, 2003 The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections J Clin Invest., 112: 14661477 Chatlopadhyay A, Bhatnagar NB, Bhatnagar R, 2004 Bacterial insecticidal toxins Cril Rev M ic r o b io l , 30: 33-54 11 8S Davey ME and O’Toole GA, 2000 Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics M icrobiol.M ol Biol Rev., 64: 847-867 9) Kearns DB, Chu F, Branda s, Kolter R, Losick R, 2005 A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis Mol M ircobiol., 55: 739-749 110 Kcikare CR, Chakraborty s, Khopade AN and Mahadik KR, 2009 Biofilm: Importance and applications Ind J.Biotechnol., 8:159-168 111 Lemn KP, Earl AM, Vlamakis HC, Aguilar c and Kolter R, 2008 Biofilm development with and emphasis on Bacillus sublilis, Curr Top Microbiol I m m u n o l 322: 1-16 1.2 Morikvva M, 2006 Beneficial biofilm formation by industrial bacteria Bacillus subtilis and rel ated species J Bioscien Bioeng., 101: 1-8 1:3 Neil H, Kevin B, Nigel DC, 2003 A color handbook of biological control in Plant protection ed, Manson Publising 1-4 O’Toole G, Kaplan HB, Kolter R, 2000 Biofilm formation as microbial development Annu R ev M icrobiol., 54: 49-79 1:5 W ilso n M , 1996 Susceptibility o f oral bacterial biofilm s to antimicrobial agents J M ed MUcrobiol., 44: 79-87 1(6 Zu«o R and W ood TK, 2004 Inhibiting mild steel corrosion form sulfate-reducing and iron- oxi'dizing bacteria using gramicidin S-producing biofilms Appl M icrobiol Biotechnol., 65: 747-753? 15; - Các h tiếp cận, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng (L.uận c ứ rõ cách tiếp cận vẩn đế nghiên cứu, thiết kế nghiên cứu,ph ơn g p h p nghiên cứu, kỹ thiuậí s ẽ sử dụ ng g ắ n vớ i từ ng n ội dung cù a đề tài; so sánh vớ i cá c ph ơn g p h áp g iả i qu yết tưcơng tự khúc phân tích để làm rõ tính mới, tính độc đáo, tính sảng tạo cùa đề tài) Cáích tiếp cận : Từ c c nghiên cứu giới năm gần việc ứng dụng chủng Bacillus', đặc b'iệt nghiên cứu chọn Bacillus mơ hình chuẩn cho việc nghiên cứu tạo biofilm tự nhiên, ưu điểm nhược điểm biofilm Từ cảc cơng trình cơng bố số hợp chất có hoạt tính sinh học ức chế vi sinh vật có hạ.i từ chủng Bacillus Các nghiên cứu rời rạc Việt Nam cho thấy triển vọng việc úng dụng Bacillus có tiềm Phiương Lpháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng: Các phương pháp nghiên cứu việc phân lập vi sinh vật môi trường chọn lọc, mơi trường khống Phươrng pháp sàng lọc chủng có hoạt tính tạo bioflim Phươmg pháp phân loại vi sinh vật kết hợp hình thái (kính hiểnvi điện tử quanghọc) đặc điểm sinh lý sinh hóa (các phàn ứng hoá sinh, thử khả sử dụng loại đường sinh học phân tử (trình tự gen mã hóa ARNr 16S) Xác định cấu trúc hỏa học biofilm phương pháp đại phổ IR, phổ cộng hường tù, ch ụp ảnh kính hiền vi điện tử quét (SEM)và xuyên (TEM) 12 Xác định hoạt độ sơ enzyrrTtham gia q trình tạo, tong hợp biofilm Phưorng pháp xác định độ gây chết tế bào vi khuẩn (killing), ức chế phát triển vi khuẩn Phương pháp tạo biofilm với quy mơ phịng thí nghiệm Định lượng protein thu theo phương pháp đo độ hấp phụ bước sóng A280 phương pháp Bradford Đánh giá độ tinh cùa chế phẩm enzym thu phương pháp điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) cùa Laemmli 'iTiính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo: Nghiên cứu phân lập chủng Bacillus có hoạt tính kháng khuẩn khơng phải giới Việt Nam Tuy nhiên nghiên cứu mới, Việt Nam khả liên kết tế bào tạo biofilm từ chùng vi sinh vật nói chung Bacillus nói riêng 1(6- Khả sử dụng sở vật chất, trang thiết bị (tên phịng thí nghiêm sứ dụng trrotng đ ề tài) Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym-Protein,Trường ĐHKHTN Phịng thí nghiệm cùa Bộ mơn Sinh lý thực vật Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN Phịng thí nghiệm Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội Đ.'ậ)v p h ị n g th í nghiệm đạt chuẩn quốc gia Việc thực đ ể tà i tạ i cá c ph ịn g thí nghiệm ncày> m ột y ế u tổ q u yết định thành côn g củ a đ ể tài 177 - Phương án phối hợp vói tổ chức nghiên cứu sở sản xuất nước (nếu có) (ĨTrìình bà}' rõ ph ơn g án ph ối hợp: tên tổ chức p h ố i hợp tham g ia thực để tài nội đium g còng việc tham g ia đề tài, kể sở sàn xuất ngiỉời sử dụng két ngịhũên cứu; khả nâng đón g g ó p nhân lục, tài chính, c s hạ tầng-nếu có) Phối hợp với Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, ĐHỌGHN để có thêm tư liệu, chủng chuẩn vi sinh vật bào tàng giống chuẩn để sàng lọc chủng B acillus Các phịng thí nghiệm mơn thuộc Khoa sinh học, Trường ĐHKHTN 18< - Phương án hợp tác quốc tế (nếu có) (TYrìinh b ày rõ phư ơng án p h ổ i hợp: tên đ ổ i tác nước ngoài; nội dung đ ã hợp tác- đ ố i với đ ố i tác đ ã có >hìựp tác từ trước; nội dung cần hợp tác khn khổ để tài; hình thức thục Phản tích rõ lý dỉo cần hợp tác d ự kiến két hợp tác, tá c độn g cù a hợp tác đ ố i vớ i kết q cùa Đ ề tài) ỈPIhịng thí nghiệm GS Masaaki Morikawa, Đại học Tổng hợp Hokkaido, Nhật Bản Đây phịng thí nghiệm mà chù nhiệm đề tài hợp tác; phịng thí nghiệm có ]nhiều cơng trình cơng bố liên quan đến hướng nghiên cứu cùa đề tài Việc trao đổi kinh nghiệm nghiên cứu, họp tác với phịng thí nghiệm cùa Giáo sư M Morikawa Igiúp cho kết nghiên cứu đề tài sớm đăng ký bàn quyền hay công bố quốc tế, inâng cao chất lượng nghiên cứu 13 19 - T ó m lẫ t kế hoach lộ trình th c hiên (L O G F R A M E ) ST7T M ục tiêu Sản phẩm C ác nội d u n g, hoạt đ ộn g chủ yếu Phân lập, tuyển chọn chùng Bacillus từ điều kiện mơi trường khác 1-2 chùng Sàng có hoạt tính tổng hợp Bacillus có hoạt tính tạo Phân lập, tuvển chọn chùng biofilm B a cillu s Thông Á X SÔ vê nhiệt độ, pH, chất dinh dưỡng, giá thể tối ưu ch o việc tạo biofilm có hoạt tín h tạo b iofilm Bacillus Đ in h giá khả ức c h é phát triển cùa m ột số nhóm vi khuẩn có hại từ biofilm cùa chùng B acillu s tuyển chọn lọc Điểu kiên thưc hii :n D ự kiến Cá nhân , tổ Thịi gian chức thực kỉnh phí (bắt đầu, (triệu đồng) 15,0 chùng sinh học phân tử Xây Xác định thành phần biofilm Hoạt tính ức ch ế phát triển vi sinh vật có hại Nghiên cứu tạo biofilm quy m phịng thí nghiệm Xác định thành phần 7- 9/2011 7-12/2011 15,0 N.Q Huy N.T Thành T.T.Hằng B.T.V H a 7-12/2011 20,0 N.Q Huy N.T Thành T.T.Hằng B.T.V H a Lựa chọn thay đổi điều Lụa chọn giá thể tối ưu cho phát triển biofilm 15,0 dựng phân loại kiện nhiệt độ, pH, dinh dưỡng cho tổng họp biofilm N.Q Huy N.T Thành T.T.Hằng kết thúc) N.Q Huy N.T Thành T.T.Hằng biofilm mạnh X ác định tên 3-4 chùng B acillus mức độ hình thái 15,0 15,0 N Q Huy N.T Thành T.T.Hằng B.T.V H a N Q Huy N.T Thành T.T.Hằng B.T.V H a 12-2/2012 2-4/2012 4-6/2012 15,0 T.T.Hằng N.H M Q uyên 6-8/2012 Hoạt độ số enzym liên quan đến tổng hợp biofilm 15,0 T.T.H ằng N.H M Q uyên 8-9/2012 Nghiên cứu khả ức chế phát triển vi sinh vật gây hại trồng 15,0 N Q Huy N T Thanh B.T.V H 8-12/2012 15,0 1-5/2012 kị khí ăn mịn N.Q Huy N.T Thành B.T.V H Tối ưu hóa điều kiện cho hoạt tính ức chế biofilm vi sinh vật gây hại vi sinh vật 15,0 N.Q Huy N.T Thành B.T.V.Hà 5-6/2013 biofilm Nghiên cứu khả ức chế phát triển vi khuẩn kỵ khí 14 III H ÌN H T H Ử C S À N P H À M K H O A H Ọ C CỦA Đ Ế T À ! 20) - - Cấu trúc dự kiến báo cáo kết đề tài Báo cáo dự kiến ngồi phần tóm tất phần tình hình sử dụng kinh phí cùa đề tài có phiầrìn với nội dung sau Pềhầần ỉ Mở đầu Nêu bật cấp thiế, ý nghĩa thời cùa đề tài nghiên cứu Đây hướng nghiên cứu đurợơc nhà khoa học quan tâm thời gian gần PHtẩần Tổng quan vẩn đề liên quan đến để tài nghiên cứu Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam biofilm, chế hình thành biofilmtừ mức độ' titế bào đến mức độ phân tử Trình bày tồng quan nhóm vi sinh vật có khả tạo biofilm nghiên cứu théê Ị giới, ưu điểm ứng dụng biofilm lĩnh vực ức chế phát triển sinih vật có hại nơng nghiệp, ăn mịn kim loại, xử lý nhiễm môi trường, lọc nước Các nghiên cứu chuyên sâu việc xác định hoạt chất hoá học cùa biofilm từ Bacillus Phiầtìn : Nguyên liệu phương pháp 3.1 Nguyên liệu: Các mẫu đất, nước từ địa điểm có điều kiện mơi trường sống khác nhiauu 3.2 Các phương pháp nghiên cứu: Các kỹ thuật dùng để thực đề tài, bao gơim phương pháp lựa chọn môi trường chọn lọc việc phân lập chùng Bacillus Phương pháp nhận biết, phân loại vi sinh vật dựa đặc điểm hình thái (phương phiápp quan sát chụp ảnh kính hiển vi điện tử kính hiển vi quang học), đặc điểm sinh lý, siìinh hố nhận dạng sinh học phân tử qua việc tách chiết A D N tổng số, PCR nhân đoạn gem I mã hóa ARNr 16S, phương pháp xác định trình tự nucleotid Phương pháp chụp ảnh kính hiển vi điện tử để xác định cấu trúc biofilm Phương pháp sàng lọc chùng Bacillus có khả hình thành biofilm Phương pháp đánh giá khả ức chế, giết vi khuẩn gây hại phương pháp pha loãingg, khuếch tán đĩa thạch Phương pháp sử dụng thiết bị lên men quy mơ phịng thí nghiệm Phiầnn Kết nghiên cứu thảo luận 'T rong phần trình bày tồn kết nghiên cứu cùa đề tài bàn luận kết quải t thu với g trình cơng bố có liên quan, cụ thể về: f Kết phân lập tuyển chọn chủng Bacillus có hoạt tính tạo biofilm 15 24 ị Sản phẩm dự kiến đăng ký bảo hộ quyền sở hữu cơng nghiệp, giải pháp hữu ích Chùng Bacillus có hoạt tính tạo biìlm cỏ tính ức chế phát triển vi khuẩn \ Sản p h ẩ m đ o tạo S ĨT T C a p đ o tạo " 11 N hiệm vụ đ ợc giao liên quan đển dề tài — — Tiên sỹ Thạc sỹ 33 Sỗ lượng Cử nhân Dự kiến kinh phí ( Triệu đồng ) ■ Phân lập, tuyên chọn nghiên cứu đặc tính số chùng Bacillus Việt Nam có hoạt tính tạo biofilm cao Nghiên cứu chế hình thành biofilm từ số chùng Bacillus bước đầu úng dụng việc ức chế phát triển số vi sinh vật cỏ hại ■ Phân lập tuyên chọn chủng Bacillus từ điều kiện khác Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phát triển tạo biofilm từ số chủng Bacillus tuyển chọn Nghiên cứu khả ứng dụng biofilm việc ức chế phát triển vi sinh vật cỏ hại ăn mòn kim loại. 15,0 10,0 26.* Ngày: Bảo mật: a Phổ biến rộng rãi y b Phổ biến hạn chế: c Bảo mật: 'ITóm tắt kết nghiên cứu: - Phân lập 90 chủng vi sinh vật từ khu vực sinh thái khác có hoạt tính tạo m àng sinh học - Đ ã tuyển chọn phân loại chủng Bacillus có hoạt tính tạo biofilm m ạnh có hoạt tính ức chế phát triển số vi sinh vật gây hại từ nguồ n đất nước ô nhiễm đất nông nghiệp - X ác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng Bacillus lựa chọn chùng cho việc nghiên cứu quy trình lèn men, bổ sung giá thể m ang cho việc tạo chế phẩm ức chế vi sinh vật gây hại C c k ế t q u ả v ề đ o tạ o Đ ã đào tạo dược 02 thạc sĩ chuyên ngành sinh hục thực nghiệm Đ ã đào tạo dược Ơ3 cử nhân sinh học Tham gia 04 báo cáo Hội nghị Khoa học sinh viên cấp Khoa C c kết q u ả c n g tr ì n h cô n g bố Đ ã công bố 06 công trình: N g uyen Q uang Huy, N guyen Thi Phuong Lien Tran T huy Mang 2011 Characterization o f biofilm -form ing bacteria isolated from soil in Vietnam Journal o f S cience VNƯ, 27(2S): 187-193 T ran Thu Hang, N guyen Q uang Huy, 2011 Isolate biofilm forming Bacillus strains from contam ination site in trade villages in Vietnam Journal o f Science V N U , 27(2S): 157-162 N g u y ễn Q u an g Huy, Trần Thúy Hằng, 2012 Phân lập chủng Bacillus có hoạt tính tạo m àng sinh vật (biìlm ) tác dụng kháng khuẩn cùa chúng Tạp chí Sinh học, 34(1): 99-106, 2012 N g u y en Q u ang Huy, N go Thi Kim Toan, Trinh Thi Hien and Pham Bao Y en, 2012 Biofilm form ing bacteria isolated from w astew ater in Vietnam International sym posium on G reen technology and Sustainable developm ent, Hochim inh city 2729/9/2012 13-19 N g u y ễn Q uan g Huy, Đoàn Diệu Linh, N guyễn Thị Giang, N gơ Thị Kim Tốn, 2012 Đặc điểm sinh học hai chủng vi khuẩn tạo biofilm phân lập từ nước thài rỉ rác.Tạp chí K hoa học C ông nghệ 50 (3D): 127-134 N g u y en Q uang Huy, N guyen Thi Phuong Lien, Tran T huy Hang, 2012 Isolation and C haracterization o f Biofilm- forming bacterial strains from contamination sites in Vietnam 1st H U S - S O G A N G International Sym posium on A dvance research and Training, Hanoi 15 Feb, 2012 ] Kiến n g h ị quy mô đối tư ợ n g áp dụng nghiên cứu: ' Tiếp tục m rộng nghiên cứu quy m ô pilot, nghiên cứu chế phân tử hình 1thành biofilm cùa chủng Bacillus Họ tên Chủ nhiệm Thủ trưởng Chủ tịch Hội đồng Thủ trưởng đề tài quan chủ trì đề tài đánh giá thức quan quản lý đề tài N guyễn Pttíirn/ I Q uang Huy Học hàm học vị V /T - vl I L G I A M PGS.TS (-77 DO C S M U Ỉ t a Ậ HỌC • CĨNG N (| h Ệ Ó TRƯỚNG ' 'Ov/ y tễrTSKH 'jMMMf đ d ỏ v y 3A N ... thú y [32], Xuất phát từ thực tế thực đề tài ? ?Phân lập, tuyến chọn chủng Bacillus có khả sinh tơng họp biofilm nghiên cứu ứng dụng vi? ??c ức chế phát triến số vi sinh vật gây hại? ?? v i m ụ c t iê... số nhóm vi sinh vật phân lập 26 Hìrh 3.2 Khả tạo thành màng sinh vật chủng vi sinh vật phân 27 lập từ mẫu nước thải làng miến Lại Trạch Hỉrh 3.3 Khả tạo màng sinh vật chung vi sinh vật phân lập. .. Hiện vi? ??c ứng dụng vi sinh vật tạo biofilm có lợi hạn chế vi sinh v ậ t tạo biofilm có hại thu hút quan tâm cùa nhiều nhà khoa học, cơng ty ĩro n g mơ hình nghiên cứu biofilmm chủng vi khuẩn Bacillus