Phân lập và tuyển chọn các chủng aspergillus có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Công nghệ Sinh học TS.Nguyễn Nhƣ Ngọc, giảng viên trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, ngƣời hƣớng dẫn, định hƣớng nghiên cứu tận tình giúp đỡ em suốt q trình nghiên cứu làm khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy, cô Viện Công nghệ Sinh học, trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam, truyền đạt kiến thức quý báu năm em học tập Kiến thức khơng tảng, sở q trình học tập nghiên cứu mà cịn hành trang quý báu để em bƣớc vào đời cách vững tự tin Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS.Nguyễn Nhƣ Ngọc tạo điều kiện thuận lợi phƣơng tiện, hƣớng dẫn em suốt trình học tập Cuối em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ngƣời động viên cổ vũ em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2018 Sinh Viên Vũ Thị Mến MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát enzyme laccase 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Cấu tạo enzyme laccase 1.1.2 Đặc tính enzyme laccase 1.2 Cơ chế hoạt động enzyme laccase 1.3 Ứng dụng laccase 1.3.1 Ứng dụng enzyme laccase 1.3.2 Xử lý màu thuốc nhuộm 1.3.3 Xử lý sinh học phân hủy sinh học 1.3.4 Tẩy trắng bột giấy 1.3.5 Các ứng dụng khác 1.4 Tình hình nghiên cứu nƣớc laccase 1.4.1 Trong nƣớc 1.4.2 Nƣớc 1.5 Sự phân bố laccase vi sinh vật sinh enzyme laccase 10 1.5.1 Trong thực vật 10 1.5.2 Trong vi khuẩn xạ khuẩn 10 1.5.3 Trong nấm 11 1.5.4 Trong côn trùng 11 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 12 2.3.Vật liệu nghiên cứu 12 2.4 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 12 2.4.1 Hóa chất mơi trƣờng nuôi cấy 12 2.4.2 Dụng cụ, thiết bị 13 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 2.5.1 Phƣơng pháp phân lập nấm mốc từ gỗ mục 14 2.5.2.Phƣơng pháp giữ giống nấm 14 2.5.3 Định tính có mặt enzyme laccase 15 2.5.4 Nghiên cứu đặc điểm hình thái nấm mốc 16 2.5.5 Phƣơng pháp xác định khả sinh số enzyme ngoại bào khác nấm đƣợc tuyển chọn 16 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Phân lập, làm tạo sƣu tập chủng nấm mốc từ gỗ mục 18 3.2 Kết thử hoạt tính chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp laccase 21 3.2.1 Kết tuyển chọn enzyme laccase chất 21 3.2.2 Kết xác định hoạt tính enzyme laccase ngoại bào môi trƣờng lỏng 23 3.3 Định danh, định tên chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp laccase 25 3.3.1 Định danh chủng nấm CN1 25 3.3.2 Định danh chủng nấm CN2 26 3.4 Phƣơng pháp xác định khả sinh số enzyme ngoại bào khác nấm đƣợc tuyển chọn 27 3.4.1 Khả phân giải tinh bột nấm mốc 27 3.4.2 Khả phân giải cellulose nấm mốc 28 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 4.1 Kết luận 29 4.2 Kiến nghị 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 14 Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc số chủng nấm mốc phân lập đƣợc 18 Bảng 3.2 Đƣờng kính vịng xuất phản ứng màu laccase chủng nấm mốc 22 Bảng 3.3 Đƣờng kính vịng xuất phản ứng màu laccase 24 Bảng 3.4 Đƣờng kính vịng phân giải tinh bột chủng nấm CN1,CN2 27 Bảng 3.5 Đƣờng kính vịng phân giải cellulose chủng nấm CN1,CN2 28 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc khơng gian enzyme laccase Hình 1.2 Hình ảnh trung tâm hoạt động laccase Hình1.3 Cơ chế phản ứng enzyme laccase Hình 3.1 Một số chủng nấm mốc đƣợc giữ giống 21 Hình 3.2 Kết thử hoạt tính enzyme laccase chất 23 Hình 3.3 Enzyme mơi trƣờng lỏng 24 Hình 3.4 Vịng phân giải acid tanic chủng nấm 24 Hình 3.5 Hình thái nấm quan sinh sản CN1 25 Hình 3.6 Hình thái nấm quan sinh sản CN2 26 DANH MỤC VIẾT TẮT PCB Polychlorinated biphenyl EPR Lò phản ứng hạt nhân LB Luria Bertani SNA Agar Spezieller Nahrstoffarmer ABTS Axit 2,2’-azino-bis 3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic MỞ ĐẦU Việc sử dụng enzyme sản xuất đời sống ngày đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu thực tế cho thấy chế phẩm enzyme đƣợc sử dụng phổ biến nhiều nƣớc mang lại lợi ích kinh tế lớn, đặc biệt enzyme có khả phân hủy hợp chất thơm đa vịng Điển hình số enzyme laccase Laccase enzyme nằm hệ enzyme lignolytic polyphenol oxydase, có khả oxy hóa diphenol hợp chất có liên quan Ƣu điểm vƣợt trội laccase có tính oxy hóa mạnh, laccase đƣợc nghiên cứu ứng dụng rộng rãi công nghiệp, xử lý phụ phẩm nông nghiệp nguồn nƣớc thải nhiễm Laccase cịn đƣợc biết đến nhƣ enzyme thân thiện với môi trƣờng phản ứng laccase cần lấy oxy từ không khí sản phẩm phụ tạo thành sau phản ứng nƣớc Laccase đƣợc thu từ nguồn khác nhƣ nấm mốc, thực vật, vi khuẩn, côn trùng nhƣng phổ biến từ nấm mốc Hiện nhiều chủng nấm sợi đƣợc phát khả tổng hợp laccase cao nhƣ: Trametes versicolor[2], Melanocarpus albomyces, Trametes modesta [4] Hơn nữa, nấm mốc có khả sinh trƣởng phát triển mạnh nên thuận lợi nhiều cho việc sản xuất laccase quy mô lớn phục vụ công nghiệp đời sống Trong năm gần đây, laccase đƣợc ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhƣ tẩy trắng bột giấy, tẩy màu thuốc nhuộm vải, chế biến thực phẩm thông qua việc đƣa vào quy trình xử lý sinh học Ngồi ra, laccase cịn đƣợc sử dụng tổng hợp chất hữu cơ, xử lý nguồn nƣớc thải bị ô nhiễm việc loại bỏ hợp chất phenol, xử lý phụ phẩm nông nghiệp để tạo nguyên liệu cho trình khác Ứng dụng laccase đƣợc mở rộng việc kết hợp laccase với mediator (chất trung gian) làm chúng có khả oxy hóa hợp chất khơng có chất phenol (non-phenol) Với vấn đề cấp thiết nguồn enzyme laccase nên tiến hành đề tài “Phân lập tuyển chọn chủng Aspergillus có khả sinh tổng hợp enzyme laccase” Để tăng thêm số lƣợng chủng có khả sinh enzyme laccase phục vụ cho đời sống ngƣời CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.Khái quát enzyme laccase 1.1.1 Khái niệm Laccase enzyme nằm hệ enzyme lignolytic có khả oxy hóa mạnh hợp chất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB, lignin, dioxin, phân giải hợp chất vô nhƣ iot [5] Laccase đƣợc ký hiệu p- benzenediol: oxygen oxidoreductase (EC 1.10.3.2) polyphenol oxidase có chứa nhiều nguyên tử đồng trung tâm hoạt động [5] 1.1.2 Cấu tạo enzyme laccase Nguyên tử đồng có chứa 1,4-benzenediol: oxy oxidoreductases Chúng khác trình tự axit amin số tính chất động học xúc tác [6] Laccases chứa nguyên tử đồng đƣợc gọi nguyên tử đồng T1 (nơi chất giảm liên kết) cụm nguyên tử đồng T2 / T3 (nơi oxy liên kết giảm xuống nƣớc) [8] Ba loại đồng đƣợc phân biệt cách sử dụng quang phổ UV nhìn thấy đƣợc quang điện cộng hƣởng (EPR) Nguyên tử đồng T1 chịu trách nhiệm màu xanh protein phát EPR Nguyên tử đồng loại T2 khơng thay đổi màu sắc nhƣng phát EPR Nguyên tử đồngT3 gồm cặp nguyên tử đồng khơng phát tín hiệu EPR [8] Năm 1894 Gabrie Bertrand lần nghiên cứu laccase nhựa sơn mài Nhật Bản, nơi giúp tạo thành sơn mài [16] Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc khơng gian enzyme laccase Hình 1.2 Hình ảnh trung tâm hoạt động laccase 1.1.2 Đặc tính enzyme laccase Các nguyên tử đồng loại 1, loại 2, loại enzyme laccase bị ràng buộc số khu vực Nguyên tử đồng loại loại đƣợc gọi cụm trinuclear Nguyên tử đồng loại có sẵn để hoạt động dung mơi, chẳng hạn nhƣ nƣớc Nó đƣợc di chuyển thủy ngân, đƣợc thay coban loại bỏ qua phức hợp đồng Loại bỏ đồng loại làm giảm hoạt động laccase [21] Tính chất hóa sinh enzyme laccase: trọng lƣợng phân tử, pH, nhiệt độ tối ƣu, nguồn carbon nito, Trọng lƣợng: Năm 1998 Judewicz cộng ƣớc tính đƣợc trọng lƣợng phân tử enzyme laccase Cerrena unicolor 59 kDa [9] Ảnh hƣởng pH: laccase hoạt động tốt khoảng pH – 8, tăng giảm pH làm ức chế hoạt tính laccase ion hydroxide Hoạt tính enzyme laccase pH khác tăng chênh lệch thể oxi hóa khử tác dụng ức chế nguyên tử đồng ion hydroxide [7] Ảnh hƣởng nhiệt độ: Nhiệt độ bền laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc vi sinh vật Nhìn chung, laccase bền 30oC– 50oC nhanh chóng hoạt tính nhiệt độ 60oC Laccase bền nhiệt đƣợc phân lập chủ yếu từ loài thuộc prokaryote [10] Ảnh hƣởng nguồn Carbon Nitơ: Hệ thống lignolytic nấm thối trắng đƣợc kích hoạt giai đoạn chuyển hóa thứ cấp nấm đƣợc kích hoạt suy giảm nitơ Các nguồn carbon dƣ thừa cản trở phát triển enzyme Một số ảnh hƣởng khác: Các chất ức chếnhƣ axit amin, axit béo, florua, Laccase gây ức chế hoạt động enzyme cách liên kết với nguyên tử đồng loại 3, dẫn đến gián đoạn trình truyền electron bên (các ion kim loại nhƣ halogenua azide, xyanua), biến đổi axit amin thay đổi cấu hình Cu chelation (ion kim loại, axit béo), loại bỏ chọn lọc nguyên tử đồng dimethyl glyoxime Năm 2009 Valeriano cộng tìm thấy hoạt động laccase tinh khiết từ Stereum ostrea ổn định pH tối ƣu 6.0 nhiệt độ 40°C [11] 1.2.Cơ chế hoạt động enzyme laccase Laccase enzyme oxy hóa khử có khả oxy hóa diphenol hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử Sự phù hợp chất laccase định hai nhân tố Thứ phù CN3 CN4 CN5 CN6 CN7 - Khuẩn lạc ban đầu có màu vàng viền trắng bao quanh sau chuyển sang màu cam viền trắng - Khuẩn lạc có hệ sợi - Kích thƣớc khuẩn lạc: 28 x 41 mm, có dạng hình khác tùy vào điều kiện ni cấy - Khuẩn lạc ban đầu có màu xám viền trắng bao quanh sau chuyển sang màu xanh dƣơng viền trắng - Có hệ sợi - Kích thƣớc khuẩn lạc: 28 x 30 mm có dạng hình cầu - Khuẩn lạc có màu xanh non viền trắng bao quanh - Khuẩn lạc có ó dạng bột - Kích thƣớc khuẩn lạc: x 12 mm, có dạng hình khác phụ thuộc vào điều kiện ni cấy - Khuẩn lạc có màu xanh dƣơng viền trắng bao quanh sau chuyển sang màu xanh lục viền màu xanh nhạt, - Khuẩn lạc có dạng bột - Khuẩn lạc phát triển xung quanh đĩa - Khuẩn lạc có màu xanh dƣơng viền trắng bao quanh sau chuyển sang xanh đen - Khuẩn lạc có dạng bột - Khuẩn lạc phát triển xung quanh đĩa 19 CN8 - Khuẩn lạc có màu xanh sau chuyển sang màu xanh rêu - Khuẩn lạc có dạng hệ sợi - Khuẩn lạc phát triển xung quanh đĩa CN9 - Khuẩn lạc ban đầu có màu trắng sau chuyển sang màu xanh lục viền trắng - Khuẩn lạc có phát triển hệ sợi - Khuẩn lạc phát triển xung quanh đĩa 10 CN10 11 - Khuẩn lạc ban đầu có màu vàng chanh viền trắng bao quanh sau chuyển sang màu xanh viền trắng - Khuẩn lạc có hệ sợi - Kích thƣớc khuẩn lạc: 20 x 20,5 mm có dạng hình cầu - Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng bao quanh đĩa - Khuẩn lạc phát triển xung quanh đĩa CN11 12 CN12 - Khuẩn lạc ban đầu có màu xanh sau chuyển sang màu lục - Khuẩn lạc làm thay đổi mơi trƣờng - Có dạng hình khác tùy vào điều kiện nuôi cấy 20 13 CN13 - Khuẩn lạc ban đầu có màu xanh sau chuyển sang màu rêu - Khuẩn lạc có dạng bột - Có dạng hình khác tùy vào điều kiện ni cấy Năm 2012 tác giả Kiều Thị Bích phân lập chủng nấm mốc từ nguồn nguyên liệu khác phân lập đƣợc chủng nấm mốc từ gỗ mục Vĩnh Phúc Với địa điểm lấy mẫu khác số lƣợng lồi nấm mốc địa điểm khác Mỗi loài nấm phát triển phụ thuộc vào môi trƣờng sống thuận lợi loài nhƣ độ ẩm, nhiệt độ, ánh sáng, Vì phân lập nấm vị trí khác số lƣợng nấm phụ thuộc vào điều kiện môi trƣờng khu vực lấy mẫu Sau phân lập chủng nấm, tiếp tục tiến hành nuôi cấy nấm môi trƣờng thạch nghiêng mẫu nấm ăn lan bề mặt môi trƣờng CN1 CN2 CN4 CN3 CN7 CN6 CN8 CN5 CN9 CN10 CN13 Hình 3.1 Một số chủng nấm mốc đƣợc giữ giống ống nghiệm 3.2 Kết thử hoạt tính chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp laccase 3.2.1 Kết tuyển chọn enzyme laccase chất 21 Để sàng lọc chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp laccase, tiến hành định tính khả sinh laccase chất acid tannic Kết cho thấy: Sau ngày nuôi cấy chất acid tannic 0,5% thu đƣợc chủng nấm mốc có vùng xung quanh khuẩn lạc chuyển từ màu trắng đục sang màu nâu q trình oxi hóa gây lên Các chủng nấm mốc đƣợc cho có khả sinh tổng hợp hệ enzyme lignolytic enzyme hệ lignolytic đƣợc tổng hợp oxy hóa acid tannic làm xuất vùng thẫm màu xung quanh khuẩn lạc [4] Kết đƣợc thể vịng oxi hóa acid tannic qua bảng số liệu sau: Bảng 3.2 Đƣờng kính vịng xuất phản ứng màu laccase chủng nấm mốc Vòng xuất màu phản ứng acid tannic STT Chủng nấm CN1 1.27 0,03 CN2 1,28 0,04 CN3 1,26 0,02 CN4 1,15 0,04 CN5 1,26 0,02 CN6 CN7 1,17 CN8 CN9 1,20 0,03 10 CN10 1,24 0,04 11 CN11 1,13 0,03 12 CN12 13 CN13 1,17 22 0,02 0 0,02 CN1 CN2 CN3 CN10 CN5 Hình 3.2 Hoạt tính laccase chủng nấm mốc đƣợc tuyển chọn Nhìn vào bảng 3.2 có 10 chủng nấm mốc sau ngày ni cấy có phản ứng tạo màu với acid tannic Vì laccase có khả oxi hóa chậm mơi trƣờng chứa acid tannic lên phản ứng có trình oxi hóa diễn chậm lên cần ngày để có phản ứng tạo màu diễn rõ to Trong có chủng CN8, CN6, CN12 không tạo màu với acid tannic không xuất màu thẫm ăn lan môi trƣờng Sau sàng lọc 10 chủng nấm mốc thu đƣợc chủng nấm mốc có phản ứng tạo màu với acid tannic nạnh chủng nấm mốc CN1,CN2,CN3,CN5,CN10 lên chọn chủng để tiếp tục nghiên cứu Năm 2015 tác giả Trịnh Thu Thủy cộng phân lập đƣợc 37 chủng nấm mốc từ gỗ mục tuyển chọn đƣợc 12 chủng có khả phân giải acid tannic Tuy nhiên chủng nấm mốc có khả phân giải acid mạnh mẽ 3.2.2 Kết xác định hoạt tính enzyme laccase ngoại bào môi trường lỏng Các nhà khoa học nghiên cứu laccase enzyme ngoại bào lên dễ dàng tiết enzyme mơi trƣờng lỏng Dùng chủng nấm CN1, CN2,CN3,CN5,CN10 đƣợc tuyển chọn, sợi nấm đƣợc cấy vào môi 23 trƣờng lỏng nhằm xác định đƣợc hoạt tính enzyme ngoại bào Dƣới hình ảnh sau ngày ni lắc CN1 CN2 CN3 CN5 CN10 Hình 3.3 Hình ảnh chủng nấm tuyển chọn môi trƣờng PDB lỏng Sau nuôi cấy sinh khối nấm có hình dạng viên trịn, dạng bột, có dịch Thử hoạt tính mơi trƣờng chuyển sang màu trắng đục sang màu nâu đen Kết biểu bảng sau: Bảng 3.3 Đƣờng kính vịng xuất phản ứng màu laccase CN1 D-d (mm) 17 0,1 CN2 19 CN3 0,2 0,2 CN5 15 0,3 CN10 16 0,2 CN3 CN2 CN1 CN10 CN5 Hình 3.4 Vịng xuất phản ứng màu acid tannic chủng nấm mốc đƣợc tuyển chọn 24 Qua bảng 3.3 thấy đƣợc CN1, CN2 có vịng phân giải lớn CN5,CN10 có đƣờng kính phân giải tƣơng ứng Cịn chủng nấm CN3 có khả phân giải acid tannic Chứng tỏ CN1, CN2 phân hủy lignin mạnh Năm 2015 tác giả Trịnh Thu Thủy cộng tìm chủng sinh tổng hợp laccase cao Với vòng phân giải lớn làm thay đổi môi trƣờng xung quanh nấm sang màu nâu đen rõ 3.3 Định danh, định tên chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp laccase Trong q trình thực chủng nấm CN1,CN2 có sinh tổng hợp laccase mạnh Tiến hành theo dõi trình sinh phát triển chủng CN1, CN2 môi trƣờng PDA, kết hợp quan sát đặc điểm sợi nấm hình thành bào tử chủng CN1, CN2 dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần 1,000 lần 3.3.1 Định danh chủng nấm CN1 Qua trình quan sát bào tử nấm mắt thƣờng quan sinh sản nấm CN1 kính hiểm vi quang học đƣợc thể qua hình 3.5 Hình 3.5 Hình thái nấm quan sinh sản CN1 Đặc điểm khuẩn lạc: Khuẩn lạc có màu xanh đậm, khuẩn ty khí sinh phát triển cao, tạo khuẩn lạc hình bán cầu, khuẩn ty chất vàng nhạt, đƣờng kính khuẩn lạc sau ngày ni đạt 3,5 cm Mặt trái không màu, không ăn lan vào môi trƣờng Sinh trƣởng môi trƣờng lỏng: cuộn lại tạo thành khối trịn, xù xì có màu trắng, kích thƣớc lớn, dịch ni 25 Quan sát dƣới kính hiển vi quang học: bào tử hình dạng hình cầu, đính đầu cành bám nhiều vị trí khác cành bào tử Bào tử nhỏ, trịn, màng ngồi trơn Sợi nấm khơng có vách ngăn Từ kết thu đƣợc, dựa khóa phân loại nấm mốc Hệ sợi nấm mốc Việt Nam – Ts.Đặng Vũ Hồng Miên, sơ xếp chủng CN1 thuộc chi Aspergillus 3.3.2 Định danh chủng nấm CN2 Qua trình quan sát bào tử nấm mắt thƣờng quan sinh sản nấm CN2 kính hiểm vi quang học đƣợc thể qua hình 3.6 Hình 3.6 Hình thái nấm quan sinh sản CN2 Đặc điểm khuẩn lạc: Khuẩn lạc có màu đen có viền bao quanh màu trắng, khuẩn ty khí sinh phát triển cao, tạo khuẩn lạc hình bán cầu, khuẩn ty chất có màu đen, đƣờng kính khuẩn lạc sau ngày nuôi đạt 4,5 cm Mặt trái không màu, không ăn lan vào môi trƣờng Sinh trƣởng mơi trƣờng lỏng: tạo dạng bột có màu trắng, kích thƣớc nhỏ, dịch ni Quan sát dƣới kính hiển vi quang học: bào tử hình dạng hình cầu, đính đầu cành bám nhiều vị trí khác cành bào tử Bào tử nhỏ, trịn, màng ngồi trơn Từ kết thu đƣợc, dựa khóa phân loại nấm mốc Hệ sợi nấm mốc Việt Nam – Ts.Đặng Vũ Hồng Miên, sơ xếp chủng CN2 thuộc chi Aspergillus 26 3.4 Phƣơng pháp xác định khả sinh số enzyme ngoại bào khác nấm đƣợc tuyển chọn 3.4.1 Khả phân giải tinh bột nấm mốc Tinh bột đƣợc cấu tạo gốc α – D- glucopiranoza liên kết với qua dây nối 1- glucozit tạo thành mạch thẳng không phân nhánh mylopectin: chiếm 75% tinh bột, chứa 0,1 – 0,8% photpho, bắt màu tím hay màu đỏ tím với dung dịch iốt Sau nuôi cấy 24 nhuộm thuốc thử lugol thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.4 Bảng 3.4 Đƣờng kính vịng phân giải tinh bột chủng nấm CN1,CN2 Đƣờng kính vịng phân Hình ảnh phân giải tinh bột giải tinh bột D-d (mm) nấm mốc ĐC CN1 10 ĐC 0,3 CN1 ĐC CN2 11 0,2 CN2 Kết cho thấy chủng nấm CN1, CN2 có khả phân giải tinh bột, với đƣờng kính vịng phân giải 10 – 11 mm Năm 2012 Phạm Thị Ngọc Lan cộng nghiên cứu khả phân giải tinh bột nấm từ ao nuôi tôm thấy đƣợc đƣờng kính phân giải tinh bột chủng – 14 mm 27 3.4.2 Khả phân giải cellulose nấm mốc Nhằm kiểm tra khả sinh cellulose chủng nấm mốc tuyển chọn đƣợc phƣơng pháp đục lôc thạch Sau 24 nhuộm thuốc nhuộm, chủng có hoạt tính mạnh mẽ cho vịng phân giải lớn rõ, cịn chủng có hoạt tính yếu khơng có vịng phân giải vịng phân giải nhỏ Đƣờng kính phân vịng giải chủng nấm đƣợc thể qua bảng 3.5 Bảng 3.5 Đƣờng kính vịng phân giải cellulose chủng nấm CN1,CN2 CN1 Hình ảnh phân giải cellulose CN2 nấm mốc ĐC D – d (mm) 21 0,2 31 0,3 CN1 CN2 Dựa vào kết đo đƣờng kính vịng phân giải thấy chủng CN2 có vịng phân giải lớn sáng chủng CN1 Vậy giả thiết chủng nấm chủng mang nhóm enzyme cellulose khác Vì thủy phân cellulose khơng hồn tồn Và chọn đƣợc chủng CN2 to sáng rõ Năm 2007 Khƣu Phƣơng Yến Anh phân lập tuyển chọn chủng nấm phân giải cellulose nhiều loại nguyên liệu với thân gỗ mục có đƣờng kính phân giải cao 25,5 – 24,5 mm Qua thấy đƣợc chủng nấm nấm phân giải cellulose cịn phụ thuộc lồi khả phân giải khác 28 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trong trình nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng nấm có khả sinh tổng hợp enzyme laccase từ gỗ mục, đề tài rút số kết luận sau: - Từ mẫu gỗ mục rừng núi Luốt Đại học Lâm Nghiệp phân lập đƣợc 13 chủng nấm mốc có đặc điểm hình thái khuẩn lạc hệ sợi khác đƣợc kí hiệu từ CN1 – CN13 - Tuyển chọn đƣợc chủng nấm mốc CN1, CN2, CN3, CN5, CN10 sinh tổng hợp laccase cao với vòng xuất phản ứng với acid tannic từ 15 – 19mm - Xác định sơ đƣợc chủng nấm CN1 CN2 thuộc chi Aspergillus có khả sinh tổng hợp laccase - Xác định khả phân giải tinh bột CN1, CN2 với đƣờng kính vịng phân giải 10 – 11mm - Xác định khả phân giải cellulose CN1, CN2 rõ sáng với đƣờng kính vịng phân giải 20 – 31mm 4.2 Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu hạn chế nên chƣa thể tiến hành hoàn chỉnh đƣợc Vậy đề tài đƣa đề nghị sau: - Khảo sát điều kiện nuôi cấy nhƣ pH, nhiệt độ, thời gian đến khả sinh tổng hợp enzyme cao - Tuyển chọn thêm số chủng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cao - Tối ƣu điều kiện ni cấy ảnh hƣởng đến họat tính enzyme chúng 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Nguyễn Lân Dũng (dịch 1983) Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Trung học Hà Nôi [2] Đặng Vũ Hồng Miên.Hệ sợi nấm mốc Việt Nam [3].Nguyễn Mai Dƣơng Lê Thị Hiền Nguyễn Thị Lan Anh Nguyễn Văn Huynh Đào Thị Ngọc Ánh Đặng Thị Cẩm Hà (2014), “So sánh khả loại màu thuốc nhuộm ca bốn chủng nấm đảm phân lập từ Ba Vì Hà Nội” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 12(4), tr.731-741 [4] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Tỵ (2000) Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục Tài liệu t iếng Anh [5].Biobleaching of orange tree pruning cellulose pulp with xylanase and laccase mediator systems [6] Bourbonnais R., Paice M., Reid I., Lanthier P., Yaguchi M (1995) Lignin oxidation by laccase isozymes from Trametes versicolor and role of the mediator 2,2'-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) in kraft lignin depolymerization Applied and Environmental Microbiology, 61: 1876 [7].Dube, E., F Shareck, Y Hurtubise, C Daneault and M Beauregard, 2008 Uniformity, expression, and characterization of a laccase from Streptomyces coelicolor and enzyme decolourization of indigo dye Appied Microbiol Biotechnol., 79: 597-603 [8].Han, MJ and HT Choi and HG Song, 2005 Filter and characterization of laccase from Trametes versicolor white rot fungus J Microbiol., 43: 555-560 [9].Laura-Leena Kiiskinen (2005), “Characteration and heterologuos production of novel laccase from Melanocarpus albomyces”, Doctor Thesis, Helneski University of Technology [10] Kunamneni A., Ballesteros A., Plou F.J., Alcalde M (2007) Fungal laccase - a versatile enzyme for biotechnological applications Mendez-Vilas A (Ed.), p 233 – 245 [11].Klaus Piontek, Matteo Antorini, Thomas Choinowski Crystal (2002), “Structure of a Laccase from the FungusTrametes versicolor at 1.90-Å Resolution Containing a Full Complement of Coppers”, The Journal of Biological Chemistry, 277,pp.37663-37669 [12].Nyanhongo G.S., Gomes J., Gubitz G., Zvauya R., Read J.S Steiner W (2002) Production of laccase by a newly isolated strain of Trametes modesta Bioresource Technology, 84: 259 [13] Susana Rodríguez Couto and José Luis Toca-Herrera (2009), “Lacasses in the textile industry”, Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 1(4), pp.115-120 [14].Thurston, CF, 1994 Structure and function of fungal laccases Microbiology, 140: 19-26 [15].Toca-Herrera, J.L., J.F Osma and S Rodriguez-Couto, 2007 Potential of Solid-State Fermentation for Laccase Production In: Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, MendezVilas, A (Ed.) Formatex Publishers, Spain, ISBN: 9788461194223, pp: 391400 [16].Valeriano, VS, AMF Silva, MF Santiago, MTF Bara and AG Telma, 2009 Production of laccase By Pynocorpus sanguineus uses 2.5-xylidine and ethanol Braz J Microbiol., 40: 790-794 [17].Verma, A.K., C Raghukumar, P Verma, Y.S Shouche and C.G Naik, 2010 Four marine-derived fungi for bioremediation of raw textile mill effluents Biodegradation, 21: 217-233 [18] Viswanath, B., Chandra, M.S., Pallavi, H and Reddy, B.R (2008), “Screening and assessment of laccase producing fngi isolated from different environmental samples”, African J Biotech, 7(8), pp 1129-1133 [19] Zeng, G.M., Yu, H.Y., Huang, H.L., Huang, D.L., Chen, Y.N, Huang, G.H and Li, G.B (2006), “Laccase activities of a soil fungus Penicillium simplicissimum in relation to lignin degradation”, W J Microb Biotech, 22(4), pp 317-324 Phụ lục Phụ lục 1: Bảng kết đo đƣờng kính vịng xuất phản ứng màu laccase chủng nấm mốc D/d(mm) STT 10 11 12 13 Đƣờng kính vịng xuất phản ứng màu D/d (mm) Chủng nấm Lần Lần Lần 1.26 1.24 CN1 1.3 1.28 1.24 CN2 1.33 1.25 1.24 CN3 1.29 CN4 1.19 1.16 1.11 1.25 1.24 CN5 1.29 CN6 1 CN7 1.2 1.16 1.16 CN8 1 CN9 1.25 1.24 1.2 1.24 1.2 CN10 1.28 CN11 1.16 1.13 1.11 CN12 1 CN13 1.19 1.18 1.15 Phụ lục 2: Hoạt tính laccase chủng nấm mốc CN4 CN5 CN11 CN6 CN8 CN10 ... chúng có khả oxy hóa hợp chất khơng có chất phenol (non-phenol) Với vấn đề cấp thiết nguồn enzyme laccase nên tiến hành đề tài ? ?Phân lập tuyển chọn chủng Aspergillus có khả sinh tổng hợp enzyme laccase? ??... cứu phân lập chủng nấm mốc từ mẫu gỗ thu thập từ rừng núi Luốt - Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp laccase cao - Xác định sơ đặc điểm sinh hóa chủng nấm tuyển chọn - Xác định khả sinh. .. bị phân hủy nấm có chủng nấm có mặt tham gia vào q trình phân giải lignin có hoạt tính laccase Vì đề tài đƣợc chọn mẫu gỗ mục từ rừng núi Luốt để phân lập chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp enzyme