Phân lập tuyển chọn các chủng bacillus có khả năng diệt bọ gậy của muỗi

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG NGUYỄN ĐỖ HƯƠNG GIANG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS CÓ KHẢ NĂNG DIỆT BỌ GẬY CỦA MUỖI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đà Nẵng – Năm 2016 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG NGUYỄN ĐỖ HƯƠNG GIANG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS CÓ KHẢ NĂNG DIỆT BỌ GẬY CỦA MUỖI Ngành: CỬ NHÂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn: TS Võ Châu Tuấn Đà Nẵng – Năm 2016 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Từ xưa đến dịch sốt xuất huyết gây lo ngại đe dọa đến sức khỏe người Hằng năm, có hàng triệu ca mắc có hàng ngàn ca tử vong sốt xuất huyết giới Theo Cục Y tế Dự phịng (Bộ Y tế), năm 2015 Việt Nam có gần 82.000 ca mắc sốt xuất huyết, có 52 trường hợp tử vong (Trần Ngoan, 2015) Thời gian gần đây, giới lại phải đối mặt với loại virus nguy hiểm lây truyền qua muỗi gây dị tật bẩm sinh cho thai nhi virus Zika Tổ chức Y tế giới (WHO) cơng bố tình trạng khẩn cấp sức khỏe cộng đồng virus Zika Giải pháp phòng ngừa tốt đưa chống bị muối đốt (Minh Hải, 2016) Với điều kiện thời tiết ngày biến chuyển bất thường, đặc biệt tượng El Nino kéo dài tình trạng kiểm sốt dịch sốt xuất huyết hay virus Zika gặp nhiều khó khăn Tháng 12/2015, Bộ Y tế Mexico thức cơng nhận vaccine chống lại loại virus gây sốt xuất huyết Dengvaxia Theo WHO, vào cuối năm 2014, vaccine có tỷ lệ phịng ngừa đạt hiệu 60,8% (Minh Nguyên, 2015) Tuy nhiên, WHO khuyến cáo phòng ngừa cách tốt biện pháp hiệu diệt trừ bọ gậy lồi muỗi Cuộc chiến phịng chống bệnh dịch người muỗi diễn vô cam go, đời thuốc diệt bọ gậy hóa học đánh dấu thắng lợi to lớn Thuốc hóa học diệt bọ gậy có nhiều ưu điểm vượt trội Thứ nhất, thuốc có hiệu nhanh thể sinh vật hại Thứ hai, thuốc có phạm vi tác dụng rộng Tuy nhiên, với ưu điểm thuốc hóa học diệt bọ gậy tồn nhiều nhược điểm, gây tác hại không nhỏ môi trường sức khỏe người Nếu sử dụng thuốc nhiều lần với nồng độ cao làm cho bọ gậy nhờn thuốc, tạo nên tính kháng thuốc quần thể bọ gậy sau vài hệ chọn lọc Do phổ tác dụng rộng nên thuốc hóa học tiêu diệt sinh vật có ích, làm cân sinh thái Và chất độc nên dùng cho nước sinh hoạt mà bất lợi việc diệt bọ gậy Ngồi ra, thuốc hóa học có thời gian tồn lâu dài môi trường nên gây ô nhiễm lớn đến mơi trường Nếu thuốc tích tụ lâu nước, đất dễ dàng vào chuỗi thức ăn sinh vật, tích tụ đủ lượng sinh học cần thiết gây hại cho sức khẻ người [43] Chính vậy, việc cần thiết phát triển loại thuốc để diệt bọ gậy mới, đảm bảo có tác dụng cao, hiệu lực nhanh; phổ tác dụng rộng; khơng ảnh hưởng đến lồi sinh vật khác; khơng khơng tạo nên tính kháng thuốc bọ gậy; không gây ô nhiễm môi trường không ảnh hưởng đến sức khỏe người có hiệu kéo dài [43] - Chế phẩm diệt trừ bọ gậy có nguồn gốc sinh học đời để đáp ứng yêu cầu thiết yếu Bacillus tên chi gồm vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí thuộc họ Bacillaceae Bacillus có nơi tự nhiên điều kiện sống khắc nghiệt, chúng có khả tạo bào tử gần hình cầu, để tồn thời gian dài Bacillus có nhiều lồi khác nhau, đa số vơ hại Trong có số lồi Bacillus có khả tổng hợp tinh thể protein độc gây tê liệt ấu trùng số lồi trùng Với đặc tính số lồi Bacillus ứng dụng để tạo chế phẩm diệt trừ bọ gậy loài muỗi Bacillus thuringiensis [43, 45] Xuất phát từ sở đây, thực đề tài: “Phân lập, tuyển chọn chủng Bacillus có khả diệt bọ gậy muỗi” Mục tiêu đề tài Tuyển chọn chủng Bacillus có khả diệt trừ bọ gậy lồi muỗi để làm sở sản xuất chế phẩm diệt trừ bọ gậy sinh học Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Cung cấp dẫn liệu khoa học khả diệt bọ gậy muỗi chủng vi khuẩn Bacillus 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu đề tài sở để nghiên cứu, phát triển chế phẩm vi sinh vật diệt muỗi hữu hiệu, góp phần bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS 1.1.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis Lịch sử Bacillus thuringiensis Loius Pasteur phát thấy lồi vi khuẩn có khả gây bệnh cho tằm, ông đặt tên Bacillus bombyces [18] Năm 1901, Shigetane Ishiwatari - nhà sinh vật học người Nhật - thực nghiên cứu nguyên nhân bệnh Sotto gây chết đột ngột, giết nhiều quần thể tằm, phân lập loại vi khuẩn (chính Bacillus thuringiensis) nguyên nhân gây bệnh ông đặt tên loại vi khuẩn Bacillus sotto [18, 34, 45] Ernst Berliner - nhà sinh vật học người Đức - phân lập loại vi khuẩn giết hại mối Mediterranean flour Địa Trung Hải vào năm 1911, ơng đặt tên cho Bacillus thuringiensis, theo tên thị trấn Thuringia, nơi loài mối tìm thấy Năm 1915, Berliner báo cáo tồn tinh thể Bt, hoạt động tinh thể không phát sau [18, 34, 43, 45] Năm 1920, người nông dân nước phát triển bắt đầu sử dụng sinh khối vi khuẩn Bt phun cho trồng loại thuốc phòng trừ sâu bệnh Đặc biệt Pháp, sớm chế tạo loại thuốc có nguồn gốc từ bào tử xác Bt, gọi Sporine [20, 34] Năm 1956, Hannay, Fitz - James Angus nghiên cứu phát tác nhân định khả tiêu diệt mối sâu bọ Bt phân tử protein sản sinh thể vi khuẩn Bt, từ mở hướng nghiên cứu nhà khoa học tác nhân, chế diệt sâu di truyền Bt [20, 34, 45] Trong suốt năm 1960, nhiều chế phẩm thương mại Bt sản xuất nhiều quy mơ khác Mỹ, Pháp, Đức Sau Howard Dulmage Clayton Beesle Viện nghiên cứu Nông nghiệp USA thu thập sưu tầm chủng Bt [20, 34, 45] Năm 1970, Dulmage phân lập chủng HD – sử dụng cho nhiều nghiên cứu chế phẩm Bt [20] Năm 1976, Robert A Zakharyan báo cáo xuất plasmid B thuringiensis đề xuất plasmid có liên quan đến tế bào thực vật hình thành tinh thể [5, 47] Năm 1977, Goldberg Margalit xác định vi khuẩn Bt độc hại ấu trùng muỗi ruồi đen Bt độc cao sinh vật mục tiêu, chúng hình thành bào tử, dễ dàng vận chuyển, xâm nhập lưu trữ thể sinh vật đích Trong thời gian hình thành bào tử, Bt tạo lượng lớn tinh thể độc có nguồn gốc từ protein có khả gây độc ấu trùng muỗi, ruồi đen ăn phải [20, 26] Năm 1978, lần phân lập từ ấu trùng muỗi chết Israel chủng Bt có hoạt lực cao côn trùng, đặc biệt ấu trùng muỗi [45] Cho đến nay, Bt chủng ứng dụng cao việc khống chế, kiểm soát ấu trùng cánh vẩy, hai cánh cánh cứng Tại Việt Nam, việc nghiên cứu Bacillus thuringiensis có nhiều kết đáng kể Nhiều chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực cao phân lập, vài dịng gen nghiên cứu tách dịng, đọc trình tự biểu Chúng ta bước đầu thử nghiệm thành cơng chế phẩm phạm vi phịng thí nghiệm thành cơng chế phẩm vi sinh diệt lăng quăng từ chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp israelensis serotype H14 TS Hồ Thị Hồng Nhung cộng Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2007 [28] Ngoài ra, năm 2013 nghiên cứu nhóm tác giả Nguyễn Thiện Phú cộng phân lập 20 chủng vi khuẩn Bacillus từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ, tuyển chọn chủng có tinh thể độc, có khả ứng dụng vào diệt trừ sâu hại [30] 1.1.2 Phân loại Bacillus thuringiensis Chủng Bacillus thuringiensis phân loại khoa học sau: [34] Giới : Eubacteria Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Bacillates Họ : Bacillaceae Chi : Bacillus Loài : Thuringiensis Cho đến nhà khoa học phân lập, phân loại số lượng lớn chủng Bt dựa theo đặc điểm sau: - Khả hình thành enzyme leucitinase - Cấu trúc tinh thể, khả gây độc - Đặc tính huyết học (kháng huyết tiêm mao (Krieg, 1968)) - Phản ứng ngưng kết tế bào sinh dưỡng với kháng huyết Phương pháp phân loại theo đặc tính huyết phổ biến Theo phương pháp này, dựa vào 50 type huyết chuẩn người ta chia chủng Bt phân lập làm 63 loài phụ (subspecies) [2, 3, 6, 18, 41] Một số type huyết chủng Bt đại diện tương ứng trình bày Bảng 1.1 [45] Bảng 1.1 Một số type huyết chủng Bt đại diện tương ứng Type huyết Chủng đại diện Viết tắt B thuringiensis THU 3a, 3b B kurstaki KUR 4a, 4b B sotto SOT 5a, 5b B candensis CAN De Barjac & Bonnefoi (1972) 8b, 8d B nigeriensis NIG Weiser and prasertphon (1984) 14 B israelensis ISR De Barjac & Cs (1992) 30 B medellin MED Orduz & Cs (1992) 33 B leesis LEE Lee & Cs (1944) 46 B chanpaisis CHA Chainpaisang (1994) Người nghiên cứu Bliner (1915), Heimpel& Angus (1958) De Barjac & Lemill (1970) Ishiwata (1905); Heimpel & Angus (1958) 48 B balearica BAL Iriate Garcia (1995) 49 B muju MUJ Park (1995) 50 B navarrersis NAV Iriate Garcia Gần đây, nhờ phát triển mạnh công nghệ gen, nhà khoa học giải mã hầu hết gen mã hóa cho tinh thể độc Từ sở đó, phương pháp phân loại khác đưa ra: phương pháp phân loại dựa vào lớp gen Cry Với phương pháp này, nhà khoa học đưa 20 lớp gen với đặc điểm protein tinh thể độc, type huyết thanh, trùng đích khác [2, 18] 1.1.3 Đặc điểm hình thái Bacillus thuringiensis Bacillus thurigiensis vi khuẩn đất, gram (+), hơ hấp hiếu khí hiếu khí khơng bắt buộc Tế bào hình que, kích thước khoảng - 6µm, có tiêm mao phủ mỏng, có khả di động, tế bào đứng đơn độc xếp thành chuỗi [17, 33, 43, 45, 46] Bacillus thurigiensis có khả sinh nội bào tử tinh thể độc Bào tử hình trứng với kích thước khoảng 1,5 - µm Tinh thể độc có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 µm có nhiều hình dạng hình van, hình lập phương, hình sao, hình trứng, hình kim Khi tế bào sinh dưỡng bị phá vỡ, nội bào tử thể vùi giải phóng (Hình 1.1) Giống bào tử loại vi khuẩn khác thuộc chi Bacillus, bào tử Bt bền, có khả kháng lại nhiệt, xạ, hố chất cao Có thể quan sát thấy bào tử, tinh thể độc, tế bào sinh dưỡng Bt kính hiển vi điện tử, kính hiển vi quang học [17, 43, 45, 46] 1.1.4 Đặc điểm sinh hóa Bacillus thuringiensis Bacillus thurigiensiss sinh trưởng tối ưu nhiệt độ 28 – 30oC, pH 6,8 - 7,2 Trong q trình sinh trưởng, vi khuẩn chuyển hố thành phần đường môi trường thành acid acetic, lactic, pyruvic… Sau chất lại thể sử dụng tiếp Do pH mơi trường lúc đầu tăng (pha logarit), sau giảm Khả sinh bào tử Bacillus thurigiensis phụ thuộc vào nhiều yếu tố mà đặc biệt yếu tố dinh dưỡng Vi khuẩn có khả nitrit hố, khơng có khả lên men đường arabinoza, xiloza, manitol phát triển yếu mơi trường kị khí [3, 29, 43, 45, 46] Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis [10] 1.1.5 Các độc tố Bacillus thuringiensis Bacillus thurigiensiss có khả tạo loại độc tố: - Ngoại độc tố α (α - exotoxin) - Ngoại độc tố β ( β - exotoxin) - Ngoại độc tố γ (γ - exotoxin) - Nội độc tố δ (δ - endotoxin) Trong loại độc tố, nội độc tố δ có tác dụng mạnh đến nhiều loại côn trùng ứng dụng rộng rãi bảo vệ thực vật loại thuốc sâu không độc hại với môi trường, người động vật [12, 41, 43, 45] a Ngoại độc tố α Ngoại độc tố α phát năm 1950 từ vi khuẩn Bacillus thurigiensis vanenlesti C Toumaroff Ngoại độc tố α gọi enzyme Leucintinase, có hoạt tính phospholipase - tác động chủ yếu lên gốc phospholipit màng tế bào sâu, giúp cho vi khuẩn gây bệnh dễ xâm nhập vào xoang thể côn trùng Do vậy, enzyme Leucintinase trực tiếp tham gia vào việc công, gây tổn thương tế bào thành ruột Ngoại độc tố α có trọng lượng phân tử thấp, tan tốt nước, hoạt động pH 6,6 – 7,2 khơng bền nhiệt nên cịn gọi ngoại độc tố không bền nhiệt, tác động đặc hiệu đến loài như: ong cắn lá, sâu thuộc cánh cứng, cánh vẩy [11, 29, 39, 44, 45] b Ngoại độc tố β Do Hall Arkavc phát năm 1959 nuôi ấu trùng muỗi thức ăn chứa Bt Đây độc tố bền nhiệt có chất nucleotide Khi xử lý 120oC 15 phút giữ hoạt tính Cơ chế tác động ngoại độc tố β cạnh tranh ATP với enzyme ARN polymerase, dẫn đến kìm hãm hoạt động enzyme, ngừng tổng hợp ARN, gây rối loạn sinh tổng hợp protein Mặt khác, ngoại độc tố β cộng hưởng tác động với nội độc tố δ khiến trùng chết nhanh chóng Ngoại độc tố β gây độc cho nhiều loại côn trùng thuộc cánh cứng, hai cánh, đặc biệt côn trùng giai đoạn ấu trùng, sâu non Ngoại độc tố β gây cản trở lột xác côn trùng Nếu sử dụng nồng độ cao, độc tố β tiêu diệt trứng côn trùng [29, 39, 45, 46] c Ngoại độc tố γ Ngoại độc tố γ phospholipase, có chất mạch peptide ngắn số axit amin tự Độc tố tan tốt nước, mẫn cảm với khơng khí, ánh sáng, nhiệt độ oxy nên hữu dụng thực tế đồng ruộng Cơ chế tác dụng ngoại độc tố γ tương tự ngoại độc tố α [29, 39, 45] d Nội độc tố δ Nội độc tố δ hình thành khoảng pha cân Tinh thể bền nhiệt (tới 80oC), không tan nước, dung môi hữu tan tốt mơi trường có pH kiềm Mỗi tế bào Bt sinh hai tinh thể độc Khối lượng tinh thể độc chiếm tới 30% khối lượng tế bào mang δ – endotoxin cịn gọi protein tinh thể độc tồn dạng tinh thể với nhiều protein tinh thể khác nhờ cầu nối disufua liên kết kị nước Về chất độc tố protein với 1180 gốc axit amin chủ yếu gồm loại glutmic, asparaginic axit amin chịu trách nhiệm cho đặc tính điểm đẳng điện thấp tinh thể Cystein chiếm tỷ lệ thấp góp phần quan trọng việc giữ vững cấu trúc tinh thể, làm tinh thể khơng có khả KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu thu được, rút số kết luận sau: - Đã phân lập chủng vi khuẩn Bacillus môi trường nuôi cấy T3 từ mẫu đất mẫu nước khu vực trường Đại học Sư phạm - Tuyển chọn chủng vi khuẩn H3 có khả hình thành bào tử, tinh thể độc nhiều với 15,07x109 bào tử/ml dịch lên men hoạt tính diệt bọ gậy cao với hiệu diệt 100% sau 72 xử lí - Chủng vi khuẩn H3, có khả sinh trưởng tốt môi trường LB Broth với điều kiện pH trung tính (6,5 – 7,5), nhiệt độ 30 – 35oC ĐỀ NGHỊ Cần tiếp tục nghiên cứu vấn đề sau: - Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính diệt bọ gậy địa điểm khác - Khảo sát môi trường nuôi cấy tối ưu chủng vi khuẩn có hoạt lực mạnh phân lập TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngơ Đình Bính ( 2005), “Thuốc trừ sâu vi sinh” Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Hà Nội, tr 10 - 43 10 Nguyễn Lân Dũng (1962), “Giáo trình Vi sinh vật học” - Đại học Tổng hợp 11 Nguyễn Lân Dũng, (1981), “Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại trồng”, nhà xuất KHKT 12 Ngơ Đình Quang Đính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Hoài Trâm, Trịnh Thế Cường (2000), “Nghiên cứu phân bố đa dạng sinh học Bacillus thurigiensis phân lập số tỉnh Việt Nam”, Những vấn đề nghiên cứu công nghệ sinh học, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Hà Nội, tr 484 - 488 16 Cao Thị Hạnh (2007), “Nghiên cứu nuôi vi khuẩn Bacillus thu sinh khối để sản xuất chế phẩm EMINA dùng chăn nuôi vào bảo vệ môi trường” , Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Nơng nghiệp I – Hà Nội 17 Lê Thị Thu Hiền, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình, Nơng Văn Hải( 1998), “Gen kháng côn trùng ứng dụng công nghệ chuyển gen thực vật” Kỉ yếu viên công nghệ sinh học 19 Bùi Thị Hương Đinh Duy Kháng cs (2003), “Phân lập chủng B thuringiensis var kurstaki Việt Nam”, Viên sau thu hoạch 27 La Thị Nga cs (2003), “Đa dạng phân tử Bacillus thuringiensis tỉnh Bắc Bắc Trung bộ”, Viện Công nghệ sinh học 28 Hồ Thị Hồng Nhung cs (2007), “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis diệt lăng quăng muỗi”, Đề tài khoa học 29 Lê Văn Nhương, Nguyễn Văn Cách, Quản Lê Hà, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng, Hồng Đình Hịa, Nguyễn Lan Hương, Ngơ Thị Mai, Đinh Kim Nhung, Khuất Hữu Thanh, Nguyễn Quang Thảo, Phạm Thị Thùy, Phạm Văn Toản, (2006), Cơ sở Công nghệ Sinh học tập (Công nghệ vi sinh), NXB Giáo Dục 30 Nguyễn Thiện Phú cs (2013), “Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu”, Tạp chí khoa học Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh, số 51 năm 2013, tráng 21 – 27 33 Trần Văn Quang, Dương Gia Đức (2010), “Nghiên cứu xử lý nước thải thủy sản Surimi mơ hình kỵ khí (UASB), hiếu khí (SBR)” Báo cáo hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học lần thứ Đại học Đà Nẵng 2010 411 – 416 38 Lê Minh Tâm (2007), “ Phương pháp phân tích số tiêu vi sinh thực phẩm” , NXB Hà Nội 39 Lê Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản ( 2003), Giáo trình cơng nghệ vi sinh vật sản xuất nông nghiệp xử lý ô nhiễm môi trường, NXB Nơng nghiệp 41 Lưu Đình Thúy (2005), “Nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bacillus thruringiensis ứng dụng phịng trừ sâu hại”, Khóa luận tốt nghiệp 42 Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục 43 Phạm Thị Thuỳ (2004), Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật, NXB Đại học quốc gia Hà Nội 44 Trần Linh Thước (2006), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, NXB Giáo dục 45 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), Công nghệ sinh học tập - Công nghệ vi sinh môi trường, NXB Giáo dục 46 Nguyễn Thị Thanh Vân (1996), “Nghiên cứu điều kiện đơn giản nhân giống Bacillus thurigiensis, lựa chọn phương pháp sản xuất giống để cung cấp cho vùng trồng rau sạch”, Luận văn thạc sĩ sinh học Tiếng Anh Amos Navon(1993), “Control of Lepidoteran pets with Bacillus thurigiensis", Bacillus thurigiensis an environment biopestiside theory and practide, tr 126 – 146 Balaraman K., Balasubramaniam M., and Manonmani L M - Bacillus thuringiensis H -14(VCRCB – 17) formulation as mosquito larvicide, Indian journal of medical Research, 77(1983) Brunhes, J.; Rhaim, A.; Geoffroy, B Angel G Hervy J P Les Moustiques de l'Afrique mediterranéenne French/English Interactive identification guide to mosquitoes of North Africa, with database of information on morphology, ecology, epidemiology, and control Mac/PC Numerous illustrations Cheng, Thomas Clement biên tập (1984) Pathogens of invertebrates: application in biological control and transmission mechanisms tr 159 Chilcot C.N and P J Wigley (1994), “Insecticidal activity of Bacillus thurigiensis crystal protein”, Proceeding of the 2nd Canberra meeting on Bacillus thurigiensis, tr 43 – 52 Clements, Alan (1992) The biology of mosquitoes 1: Development, Nutrition and Reproduction London: Chapman & Hall Davidson, Elizabeth W (1981) Pathogenesis of invertebrate microbial diseases Montclair, N.J: Allanheld, Osmun Deluca A.J, Simonson J.G and larson A D(1981), “Bacillus thurigiensis distribution on soil of the United States”, Microbiol, 27: tr 865 – 870 13 Egorov N.X, Nguyễn Lân Dũng dịch (1983), Thực hành vi sinh vật, NXB Mir Matcova, NXB KT-KH Hà Nội 14 F S Josephine, et al (2012), Isolation, production and characterization of protease from Bacillus sp isolated from soil sample, J Microbiol Biotech Res., Vol (1), 163 – 168 15 Gillett, J D 1972 The Mosquito: Its Life, Activities and Impact on Human Affairs Doubleday, Garden City, NY, 358 p 18 Hofte, H., and Whiteley, H R 1989 Insecticidal Crystal proteins of Bacillus thringiensis Microbiol ReV 20 Hyun - Woo Park, 1Baoxue Ge, 2Leah S Bauer, and Brian A Federici1, “Optimization of Cry3A Yields in Bacillus thuringiensis by Use of SporulationDependent Promoters in Combination with the STAB-SD mRNA Sequence” 21 Iizuka T(1999), “Historical review on Bacillus thurigiensis", Biotechnology of Bacillus thurigiensis, Eds : Yuzinin, Sun Ming and Liu Ziduo, Vol 3: tr 3-5 22 Jahn GC, Hall DW, Zam SG (1986) “A comparison of the life cycles of two Amblyospora (Microspora: Amblyosporidae) in the mosquitoes Culex salinarius and Culex tarsalis”.Coquillett J Florida Anti-Mosquito Assoc 57: 24–7 23 Kale, H.W., II (1968) “The relationship of purple martins to mosquito control” The Auk 85: 654–61 24 Klowden M J and Bullar L A.Jr – Oral toxicity of Bacillus thuringiensis var israelensis to adult mosquitoes, Applied Environmental Microbiology 48(1984) 25 Laurent P H, Ripauteau H, Dumamoir V.C, Frachon E, Lecadet M-M(1996), “A micromethod for serotyring Bacillus thurigiensis”, Microbiol.22: tr 259261 26 Mario Ramírez – Lepe and Montserrat Ramírez – Suero, (2012), Biological Control of Mosquito Larvae by Bacillus thuringiensis subsp Israelensis 31 Powel, C.A Charlton and T Yanamoto(1994), “Recent advences in structure and fuction reseach on Bacillus thurigiensis crystal protein”, Bacillus thurigiensis biotechnology and environmental benefits, Vol 1: tr 1-20 32 Pries F G(1992), “ Biological control of Mosquitoes and other bitting flies by Bacillus thurigiensis and B sphaericus”, Journal of Applied Bacteriology,72: tr 357- 369 34 Roh, JY; Choi, JY; Li, MS; Jin, BR; Je, YH (2007) “Bacillus thuringiensis as a specific, safe, and effective tool for insect pest control” Journal of microbiology and biotechnology 17 (4): 547–59 35 Sakhi V F P Parenti, G.M.Hanazet, B.Giordara, P Lluthy(1986), “Bacillus thurigiensis toxin inhibits K+ - gradient dependent amino acid transport across the brush border membrane of pieris brassicae midgut cell”, Microbiol Rev.53: tr 213 – 218 36 Shahram Aramideh, Mohammad Hassan Saferalizadeh, Ali Asghar Pourmirza, Mahmuod Rezazadeh Bari, Mansureh Keshavarzi and Mahdi Mohseniazar (2010),“Isolation and identification native Bacillus thuringiensis in different habitat from west azerbaijan and evaluate effects on indian moth plodia interpunctella (hubner) (lepidoptera: pyralidae)”, Mun Ent Zool, Vol 5, pp.1034-1037 37 Spielman, A., and M D'Antonio 2001 Mosquito: A Natural History of Our Most Persistent and Deadly Foe Hyperion Press, New York, 256 p 40 Thiery and E Frachon( 1997), “ Indentification, isolation culture and preservation enbromo pathogenic Biologocal techniques manual of technology in Insect pathology”, A academicpress, tr 55 – 56 47 Zakharyan R.A et el (1979) “Plasmid thuringiensis” Microbiologiya 48 (2): 226–9 DNA from Bacillus PHỤ LỤC MỘT SỐ MƠI TRƯỜNG SỬ DỤNG Mơi trường T3 đặc Tryptone :3g Tryptose :2g Cao nấm men : 1,5 g Na2HPO4 : 0,05 g MnCl2 : 0,005 g Agar : 10 – 20 g Nước cất : bổ sung đủ 1000 ml Môi trường nhân giống cấp I, II Thịt bò : 100 g Peptone : 10 g CaCl2 : 0,01 g KH2PO4.7H2O : 0,02 g ZnSO4.7H2O : 0,001 g Glucose : 10 g Nước cất : bổ sung đủ 1000 ml pH :7 Môi trường LB Broth Cao nấm men :5g Tryptone : 10 g NaCl : 10 g Agar : 10 g Nước cất : bổ sung đủ 1000 ml LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận nghiên cứu trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Đỗ Hương Giang LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp, tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - Môi trường tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành nghiên cứu phục vụ thật tốt cho Khóa luận tốt nghiệp lần Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô giáo Khoa Sinh - Môi trường giảng dạy cho tảng kiến thức vững để tiếp thu tốt kiến thức khoa học tạo cho hội học hỏi quý giá Đặc biệt, xin cảm ơn TS Võ Châu Tuấn tận tình hướng dẫn, quan tâm, dạy, định hướng có góp ý cho tơi suốt q trình thực Khóa luận tốt nghiệp vừa qua Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình,bạn bè động viên, giúp đỡ, tiếp thêm động lực vật chất lẫn tinh thần để tơi hồn thành khóa luận cách tốt Xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 28 tháng 04 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Đỗ Hương Giang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT WHO (World Health Organization) : Tổ chức Y tế giới Bt : Bacillus thuringiensis UNEP (United Nations Environment Programme) : Tổ chức Môi trường giới ILO (International Labour Organization) : Tổ chức Lao động Quốc tế Đk : Đường kính DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Một số type huyết chủng Bt đại diện tương ứng 3.1 Các chủng Bacillus phân lập từ mẫu đất nước 26 3.2 Hình thái khuẩn lạc chủng Bacillus phân lập 27 3.3 Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc chủng 28 Bacillus 3.4 Số lượng bào tử/ml dịch lên men 30 3.5 Tỷ lệ phần trăm bọ gậy chết chế phẩm Bacillus 31 DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu Tên hình ảnh Trang 1.1 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2 Quá trình xâm nhập gây độc Bt 11 2.1 Sơ đồ tóm tắt q trình nghiên cứu 20 3.1 Quá trình phân lập 28 3.2 Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc chủng 29 hình ảnh Bacillus 3.3 Hình ảnh hiệu diệt bọ gậy 32 3.4 Biểu đồ ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng 33 vi khuẩn H3 3.5 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng vi khuẩn H3 34 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài .3 Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn .4 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS .5 1.1.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.2 Phân loại Bacillus thuringiensis .6 1.1.3 Đặc điểm hình thái Bacillus thuringiensis .8 1.1.4 Đặc điểm sinh hóa Bacillus thuringiensis .8 1.1.5 Các độc tố Bacillus thuringiensis 1.1.6 Các yếu tố hình thành chế tinh thể độc 11 1.2 CHẾ PHẨM BACILLUS THURINGIENSIS .13 1.2.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất sử dụng chế phẩm vi sinh Bt 13 1.2.2 Ảnh hưởng chế phẩm Bt đến người, động vật thực vật .16 1.3 GIỚI THIỆU VỀ MUỖI 19 1.3.1 Giới thiệu chung 19 1.3.2 Vịng đời đặc tính sinh học muỗi .20 1.3.3 Tác hại muỗi 20 1.3.4 Các biện pháp phòng diệt trừ muỗi 21 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22 2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 22 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1 Phương pháp thu mẫu thực địa 21 2.3.2 Phương pháp phân lập giữ giống vi sinh vật 21 2.3.3 Phương pháp quan sát hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc vi khuẩn Bacillus thuringiensis 22 2.3.4 Phương pháp khảo sát khả diệt bọ gậy chủng Bacillus 22 2.3.5 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn Bacillus .24 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu .25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 3.1 PHÂN LẬP BACILLUS 28 3.1.1 Sự phân bố chủng Bacillus mẫu đất nước 28 3.1.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 29 3.2 QUAN SÁT HÌNH DẠNG TẾ BÀO, BÀO TỬ, TINH THỂ ĐỘC 30 3.3 ĐÁNH GIÁ HOẠT LỰC DIỆT BỌ GẬY CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS 32 3.3.1 Nhân giống cấp I, II lên men 32 3.3.2 Xác định số lượng bào tử .32 3.3.3 Khả diệt bọ gậy muỗi chủng Bacillus 33 3.4 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA CHỦNG VI KHUẨN H3 ĐƯỢC TUYỂN CHỌN 35 3.4.1 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng vi khuẩn H3 35 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng vi khuẩn H3 .36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH ... cứu: Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus từ nước đất Đánh giá khả diệt bọ gậy chủng Bacillus phân lập được, tuyển chọn chủng có hoạt lực mạnh Khảo sát đặc điểm sinh học chủng Bacillus tuyển chọn. .. lồi Bacillus ứng dụng để tạo chế phẩm diệt trừ bọ gậy loài muỗi Bacillus thuringiensis [43, 45] Xuất phát từ sở đây, thực đề tài: ? ?Phân lập, tuyển chọn chủng Bacillus có khả diệt bọ gậy muỗi? ??... trùng vào) có tỉ lệ bọ gậy chết 0% sau ngày thí nghiệm - Trong số chủng Bacillus sinh nhiều bào tử/tinh thể độc phân lập, đáng ý hiệu diệt bọ gậy chủng sau: + Chủng H3 có hiệu diệt bọ gậy cao,