Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 103-108 Nuôi cấy làm giàu quần xã vi khuẩn kỵ khí từ mẫu trầm tích có khả chuyển hóa tất đồng phân dichlorobenzene Ngô Quỳnh Phương1, Ngô Thị Thêu1, Trần Thị Vân Thi2, Nguyễn Hiền Trang3, Nguyễn Thi Việt1, Nguyễn Hữu Đồng4, Trần Hòa Duân1,* Khoa Cơng nghệ Hóa Mơi trường, Trường Cao Đẳng Cơng Nghiệp Huế Khoa Hóa học, Đại học Khoa học Huế Khoa Cơ khí Cơng nghệ, Đại học Nơng Lâm Huế Khoa Sư phạm Tự nhiên, Đại học Hà Tĩnh Nhận ngày 16 tháng năm 2017 Chỉnh sửa ngày 20 tháng năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: Các đồng phân dichlorobenzene sử dụng ngày cảng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp khác gây mối quan ngại lớn mặt môi trường Các dichlorobenzene bị chuyển hóa 02 quần xã vi khuẩn kỵ khí thu từ việc ni cấy làm giàu 05 mẫu trầm tích kênh rạch Thừa Thiên Huế Mẫu ni cấy M1 chuyển hóa tất đồng phân dichlorobenzene theo đường ưu tiên chuyển hóa chlorine vị trí sườn đơn với sản phẩm cuối monochlorobenzene chuyển hóa chlorine vị trí lập diễn Ngược lại, mẫu ni cấy M2 chuyển hóa dichlorobenzene theo đường ưu tiên chuyển hóa chlorine vị trí lập với monochlorobenzene benzene sản phẩm trung gian sản phẩm cuối ngoại trừ mẫu nuôi cấy M2 với 1,2-dichlorobenzene (M2.2 phát benzene) Khả chuyển hóa quần xã vi khuẩn M1 M2 dichlorobenzene ổn định môi trường ni cấy tổng hợp hồn tồn qua lần cấy chuyển loại bỏ yếu tố môi trường ảnh hưởng có mẫu trầm tích Từ khố: Các đồng phân dichlorobenzene; quần xã vi khuẩn kỵ khí; chuyển hóa sinh học Mở đầu trùng, làm dung mơi chất trung gian nhiều ngành cơng nghiệp hóa chất, dược phẩm nơng nghiệp [1] Sự ô nhiễm chlorobenzene tác động xấu đến hệ sinh thái sức khỏe người động vật chúng có khả tích lũy khuếch đại sinh học thâm nhập vào thể hợp chất chúng minh có khả gây bệnh ung thư cho người [2] Ngoài ra, hợp chất chlorobenzene hợp chất hữu Chlorobenzene nhóm chất gây ô nhiễm môi trường hàng đầu thu hút quan tâm lớn từ nhà nghiên cứu việc sử dụng ngày rộng rãi hợp chất hữu làm chất diệt nấm, diệt _ Tác giả liên hệ ĐT.: 84-937077055 Email: duan.tranhoa@hueic.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4636 103 104 N.Q Phương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 103-108 bền môi trường trước tác động yếu tố vật lý, hóa học sinh học Trong số hợp chất chlorobenzene đồng phân dichlorobenzene (1,2-; 1,3- 1,4dichlorbenzene) thường dễ dàng phát loại mẫu môi trường khác nước thải sinh hoạt, nước thải công nghiệp, nước ngầm, trầm tích bãi xử lý chất thải Ngoài ra, chúng sản phẩm trung gian sản phẩm cuối chuyển hóa sinh học hợp chất hữu bền chlorobenzene chứa nhiều gốc chlorine hexachlorobenzene, đồng phân trichlorobenzene (1,2,3-; 1,2,4- 1,3, 5-trichlorbenzene) Sự chuyển hóa sinh học hợp chất dichlorobenzene nhóm vi khuẩn kỵ khí chứng minh [3, 4] Tuy nhiên, chúng sản phẩm cuối nhiều chuyển hóa sinh học hợp chất hữu chlorobenzene, điều chứng tỏ chúng tương đối khó chuyển hóa sinh học Do đó, việc nghiên cứu chuyển hóa sinh học dichlorobenzene nuôi cấy làm giàu quần xã vi khuẩn kỵ khí từ mẫu trầm tích thu Việt Nam trình bày báo Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng vi khuẩn Các quần xã vi khuẩn kỵ khí có mẫu trầm tích có khả chuyển hóa hợp chất hữu bền chlorobenzene 2.2 Hóa chất Tất hóa chất sử dụng thí nghiệm thuộc hóa chất phân tích có độ tinh khiết cao, 1,2-; 1,3- 1,4-dichlorobenzene mua từ hãng Sigma-Aldrich (CHLB Đức) với độ tinh khiết 99.9% Các khí N2, CO2 H2 cung cấp cơng ty khí TNHH Messer Việt Nam có độ tinh khiết 99.8% Titanium chlorine 15% mua từ công ty hóa chất Merck (CHLB Đức) 2.3 Phương pháp 2.3.1 Cấy mẫu điều kiện nuôi cấy Các mẫu trầm tích thu điều kiện kỵ khí hồn toàn kênh rạch xã Phú Thượng, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế Các mẫu sau vận chuyển, bảo quản cấy vào bình tích 60 mL chứa 30 mL mơi trường khống lỏng điều kiện kỵ khí tuyệt đối [5] Các bình đóng cao su có chứa Teflon dập kín nắp nhơm Các mẫu sau bổ sung 0.3 mL dung dịch vitamin nồng độ 100X dung dịch TiCi 1,5% [6], NaHCO3 1M, Natri acetate 0.5 M làm chất khử oxy, dung dịch đệm ổn định pH nguồn carbon Ngoài ra, bình ni cấy bổ sung dung dịch dichlorobenzene với nồng độ khoảng 50 µM Phần bình ni cấy (headspace) bổ sung khí H2 có độ tinh khiết 99.999% với áp suất 0.5 bar thời gian 10 giây Các bình ni cấy sau ni cấy nhiệt độ 37 oC trạng thái tĩnh Mỗi thí nghiệm thiết lập với 03 bình ni cấy kết thí nghiệm giá trị trung bình cộng kết 03 bình ni cấy Thí nghiệm đối chứng thiết lập cho thí nghiệm với điều kiện mơi trường ni cấy hồn tồn giống mẫu thí nghiệm khơng có bổ sung nguồn mẫu trầm tích Mẫu định kỳ phân tích chuyển hóa hợp chất hữu chlorobenzene thử nghiệm sản phẩm chuyển hóa chúng 15 ngày lần đợt 2.3.2 Cấy chuyển Các mẫu có kết chuyển hóa dichlorobenzene cấy chuyển qua hệ để kiểm ta tính ổn định đường chuyển hóa mẫu nuôi cấy Các hệ tiếp nhận 1% thể tích mẫu ni cấy hệ trước nuôi cấy điều kiện hồn tồn giống 2.3.3 Phương pháp phân tích Mẫu ni cấy chứa dichlorobenzene sản phẩm chuyển hóa sinh học gửi sang Trung tâm nghiên cứu Môi trường UFZ (Helmholtz Centre for N.Q Phương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 103-108 105 Environmental Research-UFZ), LeipzigCHLB Đức để phân tích định tính định lượng máy sắc ký khí GC (Gas Chromatography) -5890 Hewlett Packard hãng Agilent – Mỹ sử dụng đầu dị ion hóa lửa FID (Flame Ionization Detector) với cột mao quản (HP-5, 5% phenyl methyl siloxane, Agilent) có chiều dài 30 mét; đường kính bên cột 320 µm bề dày cột 0.25 µm Nhiệt độ ban đầu cột cài đặt 55 oC thời gian phút Sau nhiệt độ cột tăng lên 200 oC với bước tăng nhiệt độ 15 oC phút Cuối cùng, nhiệt độ cột tăng lên 250 oC với bước tăng nhiệt độ 8oC/phút mẫu trầm tích M1 M2 trình bày qua Hình Kết nghiên cứu bàn luận Để làm sáng tỏ đường tạo thành benzene, mẫu M2.1; M2.2 M2.3 gốc tiến hành nuôi cấy với monochlorobenzene làm chất nhận điện tử cuối Kết cho thấy ba mẫu M2.1; M2.2 M2.3 có khả chuyển hóa monochlorobenzene thành benzene với mức độ Chúng tiến hành thử nghiệm khả khử chlorine vị trí lập monochlorobenzene mẫu nuôi cấy M1 Kết cho thấy mẫu (M1.1; M1.2 M1.3) có khả chuyển hóa monochlorobenzene sau tháng ni cấy 3.1 Sự chuyển hóa đồng phân dichlorobenzene bới quần xã vi khuẩn kỵ khí mẫu trầm tích Chúng tiến hành nuôi cấy thử nghiệm 05 mẫu trầm tích với tất đồng phân chlorobenzene kết cho thấy có 02 mẫu trầm tích cho kết chuyển hóa tất đồng phân dichlorobenzene ký hiệu M1 M2 Trong mẫu M1 chuyển hóa tất dichlorobenzene với sản phẩm cuối monochlorobenzene (ký hiệu mẫu M1.1; M1.2 M1.3 cho mẫu M1 nuôi cấy với 1,2-; 1,3- 1,4-dichlorobenzene) Hàm lượng monochlorobenzene mẫu M1.1 cao nhiều so với hàm lượng monochlorobenzene phát mẫu M1.2 M1.3 Mẫu M2 chuyển hóa tất đồng phân dichlorobenzene (ký hiệu M2.1; M2.2 M2.3 cho mẫu M2 nuôi cấy với 1,2-; 1,3- 1,4-dichlorobenzene) với monochlorobenzene benzene phát đồng thời sản phẩm trung gian sản phẩm cuối chuyển hóa 1,3- 1,4-dichlorobenzene Riêng mẫu M2.1 ni cấy với 1,2 dichlorobenzene, benzene sản phẩm chuyển hóa phát hàm lượng benzene mẫu M2.1 thấp nhiều so với hàm lượng benzene mẫu M2.2 M2.3 Kết chuyển hóa dichlorobenzene 3.2 Thử nghiệm tính ổn định đường chuyển hóa dichlorobenzene Kết phân tích 03 lần thí nghiệm cấy chuyển mẫu ni cấy M1 M2 khẳng định chuyển hóa dichlorobenzene quần xã vi khuẩn kỵ khí có mẫu trầm tích M1 M2 ổn định đường mức độ chuyển hóa 3.3 Thử nghiệm xác định chế hình thành benzene mẫu ni cấy 3.4 Bàn luận Sự chuyển hóa dichlorobenzene không diễn mẫu đối chứng chứng tỏ q trình chuyển hóa đồng phân dichlorobenzene mẫu thử chuyển hóa sinh học nhóm vi khuẩn kỵ khí có mặt mẫu trầm tích chịu trách nhiệm Con đường chuyển hóa dichlorobenzene trì ổn định qua 03 hệ cấy chuyển khẳng định quần xã vi khuẩn kỵ khí mẫu trầm tích có khả chuyển hóa dichlorobenzene điều kiện ni cấy hồn tồn tổng hợp Thêm vào đó, kết quản nghiên cứu cho thấy yếu tố môi trường chưa xác định (unknown factors) có trầm tích khơng phải yếu tố ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển hoạt động chuyển hóa chlorine quần xã vi khuẩn kỵ khí [7] 106 N.Q Phương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 103-108 Hình Sự chuyển hóa dichlorobenzene mẫu trầm tích M1 (A: M1.1 chuyển hóa 1,2-dichlorobenzen; B: M1.2 chuyển hóa 1,3-dichlorobenzen; C: M1.3 chuyển hóa 1,4-dichlorobenzene) Hình Sự chuyển hóa dichlorobenzene mẫu trầm tích M2 (A: M2.1 chuyển hóa 1,2-dichlorobenzen; B: M2.2 chuyển hóa 1,3-dichlorobenzen; C: M2.3 chuyển hóa 1,4-dichlorobenzene) Mẫu ni cấy M1 với monochlorobenzene sản phẩm cuối hàm lượng monochlorobenzene từ chuyển hóa 1,2-dichlorobenzene cao nhiều so với hàm lượng monochlorobenzene tạo từ chuyển hóa hai đồng phân 1,3 - 1,4-dichlorobenzene Điều giải thích quần xã vi khuẩn kỵ khí có mẫu M1 ưu tiên chuyển hóa chlorine dichlorobenzene vị trí sườn đơn (preferentially singly-flanked chlorine removal) chuyển hóa chlorine vị trí lập (preferentially isolated chlorine removal) (Hình 3) Sự ưu tiên chuyển hóa chlorine vị trí sườn đơn quần xã vi khuẩn kỵ khí M1 làm cho mức độ chuyển hóa 1,2-dichlorobenzene nhanh nên hàm lượng monochlorobenzene tạo mẫu M1.1 nhiều Tuy nhiên, thử nghiệm mẫu nuôi cấy M1 (M1.1; M1.2 M1.3) với monochlorobenzene làm chất nhận điện tử cuối khơng có chuyển hóa hợp chất hữu bền chuyển hóa chlorine vị trí lập có khả diễn quần xã vi khuẩn kỵ khí Điều giải thích monochlorine thường bền đồng phân dichlorobenzene tác động của yếu tố phân hủy sinh học Thêm vào đó, khả chuyển hóa chlorine vị trí lập quần xã vi khuẩn M1 lại tương đối yếu Đối với mẫu ni cấy M2 xuất monochlorobenzene benzene từ chuyển hóa 1,3- 1,4-dichlorobenzene tạo thành benzene từ thử nghiệm nuôi cấy mẫu M2.2 M2.3 với monochlorobenzene chứng tỏ quần xã vi khuẩn kỵ khí có mẫu trầm tích M2 ưu tiên chuyển hóa chorine vị trí cô lập (preferentially isolated chlorine removal) Sự tạo thành benzene từ 1, 2-dichlorobenzene cho thấy quần xã vi khuẩn kỵ khí mẫu trầm tích M2 có khả chuyển hóa chlorine vị trí sườn đơn Tuy nhiên, khơng ưu tiên chuyển hóa chlorine vị trí sườn đơn quần xã vi khuẩn N.Q Phương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 103-108 kỵ khí có mẫu trầm tích M2 nên sản phẩm trung gian chuyển hóa 1,2dichlorobenzene monochlorobenzene nhanh chóng chuyển hóa thành benzene Điều giải thích cho việc monochlorobenzene khơng phát mẫu M2.1 nuôi cấy với 1,2-dichlorbenzene Điều chứng minh thử nghiệm mẫu nuôi cấy M2.1 với monochorobenzene làm chất nhận điện tử chuyển hóa monochlorobenzene thành benzene diễn nhanh 107 Nói tóm lại, kết nghiên cứu với đường chuyển hóa dichlorobenzene quần xã vi khuẩn kỵ khí ưu tiên loại bỏ chlorine vị trí sườn đơn vị trí lập thực có tiềm lớn việc ứng dụng vào thực tiễn việc xử lý sinh học khu vực bị nhiễm chlorobenzene để tạo thành sản phẩm khơng cịn chứa chlorine (benzene), hợp chất độc dễ bị khống hóa so với hợp chất vịng thơm chứa chlorine Hình Con đường chuyển hóa dichlorobenzene mẫu trầm tích M1 M2 (A: M1; B: M2; mũi tên đậm: đường chuyển hóa chính; mũi tên nhạt: đường chuyển hóa phụ) Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106-NN.0042015.48 Ngoài ra, nhóm tác giả chân thành cảm ơn giúp đỡ khoa Hóa Địa Sinh Đồng Vị thuộc Trung tâm Nghiên cứu Môi trường -UFZ-Leipzig- CHLB Đức (Department of Isotope Biogeochemistry-UFZ - Leipzig, Germany) q trình phân tích mẫu Tài liệu tham khảo [1] Chaudhry GR., and Chapalamadugu S., Biodegradation of halogenated organic compounds, Microbiological Reviews 55 (1991) 59 [2] Kamrin MA., and Fischer LJ., Workshop on human health impacts of halogenated biphenyls and related compounds, Environmental Health Perspectives 91 (1991)157 [3] Bosma TNP., Van der Meer JR., Schraa G., Tros ME., and Zehnder AJB., Reductive dichlorination of all trichloro- and dichlorobenzene isomers, FEMS Microbiology Letters 53 (1988) 223 [4] Liang X., Mundle SOC., Nelson JL., Passeport E., Chan CCH., Lacrampe-Couloume G., Zinder SH., and Lolar BS., Distinct carbon isotope fractionation during anaerobic degradation of dichlorobenzene isomers, Environmental Science & Technology 48 (2014) 4844 [5] Widdel F., and Pfennig N., Studies on dissimilatory sulfate-reducing bacteria that decompose fatty acids, Archives of Microbiology 129 (1981) 395 [6] Zehnder AJB., and Wuhrmann K., Titanium (iii) citrate as a nontoxic oxidation-reduction buffering system for the culture of obligate anaerobes, Science 194 (1976) 1165 [7] Baqar RZ., and Syed HI., Factors affecting microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbon phenanthrene in the Caribbean coastal water, Marine Pollution Bulletin 38 (1999) 737 108 N.Q Phương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 103-108 Enrichment of All Dichlorobenzene Isomers Transforming Anaerobic Mixed Cultures From Sediments Ngo Quynh Phuong1, Ngo Thi Theu1, Tran Thi Van Thi2, Nguyen Hien Trang3, Nguyen Thi Viet1, Nguyen Huu Dong4, Tran Hoa Duan1 Faculty of Chemical and Environmental Engineering, Hue Industrial College Faculty of Chemistry, Hue University of Sciences Faculty of Engineering and Food Technology, Hue University of Agriculture and Forestry Faculty of Teacher Training in Natural Science, Ha Tinh University Abstract: Isomers of dichlorobenzene have been widely used in many industries and cause a big concern for the environment Dichlorobeznenes were bio-transferred by 02 anaerobic mixed cultures enriched from 05 sediments obtained in Thua Thien Hue province’s canal The fisrt mixed culture, named M1 transferred all of isomers of dichlorobenzene with the pathway of preferentially dechlorinating singly-flanked chlorine substituents to produce monochlorobenzene as the end product although the culutre was able to remove isolated chlorine substituents Reversely, the second mixed culture, named M2 transferred dichlorobenzenes with the pathway of preferentially removing isolated chlorine substituents to produce monochlorobenzene and benzene as intermediate and end product, respectively, except M2 culture enriched with 1,2-dichlorobenzene (benzene was found in M2.2 culture) The dechlorination ability of M1 and M2 cultures remained stable in a completely synthetic medium over three transfers which abolished the environmental unkown factors in sediments affecting the growth and dechlorination ability of active anaerobes Keywords: Dichlorobenzene isomers; anaerobic mixed culutres; bio-transformation; sediments ... obligate anaerobes, Science 194 (1976) 1165 [7] Baqar RZ., and Syed HI., Factors affecting microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbon phenanthrene in the Caribbean coastal water, Marine... Germany) q trình phân tích mẫu Tài liệu tham khảo [1] Chaudhry GR., and Chapalamadugu S., Biodegradation of halogenated organic compounds, Microbiological Reviews 55 (1991) 59 [2] Kamrin MA., and... dissimilatory sulfate-reducing bacteria that decompose fatty acids, Archives of Microbiology 129 (1981) 395 [6] Zehnder AJB., and Wuhrmann K., Titanium (iii) citrate as a nontoxic oxidation-reduction