Chọn tạo các dòng ngô được chuyển gen kháng sâu CryIAc thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 Chọn tạo dịng ngơ chuyển gen kháng sâu (CryIAc) thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Trương Thu Hằng* Trường Cao đẳng Sư phạm Thái Nguyên Đường Quang Trung, Phường Thịnh Đán, TP Thái Nguyên Nhận ngày 09 tháng 10 năm 2012 Chỉnh sửa ngày 24 tháng 10 năm 2013; chấp nhận đăng ngày 10 tháng 10 năm 2013 Tóm tắt Ngô (Zea Mays L.,) ngũ cốc quan trọng (lúa mì, lúa nước, ngơ) giới Phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens với ưu điểm tốn kém, dễ áp dụng đối tượng trồng nên phương pháp phù hợp với điều kiện nước phát triển Việt Nam Đã chuyển thành công gen kháng sâu CryIAc thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào dịng ngơ HR9 nhập nội Đã bước đầu đánh giá biểu gen biến nạp phương pháp PCR phương pháp đánh giá chuyển gen trồng nhà lưới cách li trùng Các kết nghiên cứu có giá trị khoa học có ý nghĩa thực tiễn phát triển giống ngô chuyển gen Việt Nam tương lai Mở đầu∗ Đánh giá phát triển ngơ giới có ngun nhân thúc đẩy tăng suất sản lượng là: i) thay đổi giống (thụ phấn tự do, lai kép, lai đơn); ii) tăng khả chống chịu; iii) áp dụng tiến kỹ thuật iv) tăng suất dòng bố mẹ [1] Ngô (Zea Mays L.,) ngũ cốc quan trọng (lúa mì, lúa nước, ngơ) giới Tính đến năm 2008 diện tích trồng ngơ giới vào khoảng 157, 51 triệu ha, suất 4,96 tấn/ha, sản lượng khoảng 782,96 triệu [1] Một nguyên nhân thúc đẩy phát triển ngô giới tăng cường khả chống chịu giống Khả chống chịu giống bao gồm chống lại tác nhân sinh học (Biotic stresses) phi sinh học (Abiotic stresses) Các tác nhân phi sinh học bao gồm hạn, lạnh, nóng, muối cao, axit….Theo thống kê Dean & Adang [3], Oerke & CS [4] tổn thất mùa màng nghiêm trọng Ở nước ta, ngô lương thực quan trọng thứ sau lúa màu quan trọng Năm 2008, diện tích trồng ngơ đạt 1,1 triệu ha, suất khoảng tấn/ ha, sản lượng 4,53 triệu [2] _ ∗ ĐT: 84-1276390580 E-mail: hanganh10@gmail.com 17 18 T.T Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 toàn cầu sâu bệnh gây ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng lương thực hàng năm, thiệt hại côn trùng chiếm từ 13 – 16% Mức độ thiệt hại có lên tới 70% trồng không áp dụng biện pháp bảo vệ Với ngô, sâu đục thân ngô (miền Nam gọi bắp) chúng có tên khoa học Ostrinia nubilalis thuộc họ Ngài sáng (Pyralidae), Bộ cánh vẩy (Lepidoptera) sâu xám (Agrotis ypsilon) thuộc họ ngài đêm (Noctuidae), Bộ cánh vảy (Lepidoptera) hai loại sâu hại phổ biến ngô, thường gây hại nặng bắp nhiều vùng trồng bắp nước ta Ở nước ta, sâu đục thân ngô thường gây hại nặng nhiều vùng mùa vụ Ở khu vực Đồng sông Cửu Long, sâu phá hại ngô thường tập trung vào tháng mùa mưa độ ẩm cao Ruộng ngô bị sâu đục thân nặng làm số bị hại có lên đến 8090%, dẫn đến suất bị giảm sút Sâu xám loại sâu hại nguy hiểm ngô hoa màu gieo trồng vụ đông xuân miền Bắc nước ta Hàng năm, sâu phát sinh diện tích rộng lớn gây thiệt hại lớn Hiện nay, nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học sử dụng để phịng trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường gây độc hại cho sức khỏe người, vật nuôi Để cải thiện tình hình này, cần sử dụng kỹ thuật tiên tiến bảo vệ trồng nhằm xây dựng nông nghiệp sạch, bền vững Việc tạo giống trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified Crops, GMOs) có khả kháng sâu bệnh trùng nhờ kỹ thuật tạo dịng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật quan tâm nghiên cứu ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao suất trồng đem lại lợi ích tối đa cho nông nghiệp Đến hàng loạt gen mã hóa protein có họat tính diệt trùng gây hại (gen kháng côn trùng) gen cry vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hóa chất ức chế proteaza α - amylaza… chuyển vào thực vật nhờ phương pháp thích hợp với sản phẩm trồng có khả tự kháng sâu bệnh Trên giới, nhiều phương pháp chuyển gen thực vật nghiên cứu áp dụng thành công, phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung điện Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao sử dụng rộng rãi phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens Với ưu điểm tốn kém, dễ áp dụng đối tượng trồng nên phương pháp phù hợp với điều kiện nước phát triển Việt Nam [5] Vật liệu 2.1 Vật liệu thực vật Vật liệu sử dụng thí nghiệm hai dịng ngơ nhập nội: HR8, HR9 Các ngơ mẹ cho bắp thí nghiệm trồng nhà lưới 2.2 Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vector biến nạp Chúng sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 mang ADN plasmid vector Padt1 chứa gen kháng sâu CryIAc điều khiển đoạn khởi động Ubiquitin gen chon lọc thực vật hyg (H) Padt2 chứa gen kháng sâu CryIAc điều khiển đoạn khởi động Ubiquitin gen chọn lọc thực vật pmi (M) bảng T.T Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 19 Bảng Thông tin liên quan đến hệ thống biến nạp H M Plasmid vector Vector gốc Kết cấu gen quan tâm Chỉ thị chọn lọc Agrobacterium tumefaciens Chỉ thị chọn lọc thực vật Hệ thống biến nạp Padt1 Pcambia 1300 Ubiquitin + CryIAc + NOS Kanamicin (50µg/ml) Hygromicin (15-50µg/ml) Agrobacterium tumefaciens LBA4404: Padt1 (H) Padt2 Pnov2819 Ubiquitin + CryIAc + NOS Spectomicin (50µg/ml) Mannose (10-15g/l) Agrobacterium tumefaciens LBA4404: Padt2 (M) Phương pháp nghiên cứu 3.1 Biến nạp gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 3.1.1.Tạo dịch huyền phù Agrobacterium tumefaciens Hình Cấu trúc vector pNOV2819 Agrobacterium tumefaciens chủng LB4404 chứa plasmid quan tâm cất giữ glycerol -200C Cấy trải vi khuẩn lên đĩa mơi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh tương ứng, nuôi 210C 2-3 ngày Cấy khuẩn lạc vi khuẩn nuôi môi trường LB đặc sang mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp lắc 150 vịng/phút, 250C, tiến hành nuôi qua đêm Sau 8-12 lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, 40C phút Loại bỏ dịch hồ tan cặn vi khuẩn dịch ni LB lỏng Pha loãng dịch khuẩn đạt OD600 ≈ 0.5-1.0 Thu dịch huyền phù vi khuẩn sử dụng để lây nhiễm với phôi ngô non 3.1.2 Lây nhiễm vi khuẩn với phơi Hình Cấu trúc vector Pcambia 1300 Bắp non thu từ ngô mẹ trồng nhà lưới Ngay sau thu, phôi non tách điều kiện vơ trùng Phơi non sau 20 T.T Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 đưa vào mơi trường IM có bổ sung AS dịch huyền phù vi khuẩn 30-60 phút, lắc nhẹ nhiệt độ 210C, điều kiện tối - Đồng nuôi cấy Phôi sau lây nhiễm với vi khuẩn chuyển sang môi trường nuôi cộng sinh CCM, nuôi tối, nhiệt độ 210C ngày - Nuôi phục hồi Chuyển phôi biến nạp từ môi trường CCM sang môi trường ReM, nuôi tối 25oC ngày - Chọn lọc mô sẹo chuyển gen Mô sẹo tạo thành từ phôi non biến nạp môi trường ReM cấy chuyển sang mơi trường ReM có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật tương ứng, nuôi tối 25oC, thời gian 20 ngày - Tạo chồi Mô sẹo phơi hố tạo thành mơi trường chọn lọc ReM cấy chuyển sang mơi trường ReM có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật thích hợp để tái sinh chồi, nuôi sáng 25oC, thời gian 20 ngày - Tái sinh biến nạp gen hoàn chỉnh Chồi tái sinh môi trường chọn lọc SeM cấy chuyển sang mơi trường tạo hồn chỉnh RM có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật, ni sáng 25oC, thời gian 10-20 ngày A Chuyển đất: Cây tái sinh môi trường chọn lọc RM có 2-3 lá, 3-4 rễ chuyển đất trồng Môi trường sử dụng bước chuyển gen thể bảng Bảng Môi trường sử dụng biến nạp gen nhờ Agrobacterium tumefaciens Thành phần N6 MS Sucrose g/l Glucose g/l L-proline (g/l) MES (g/l) Hygromycin (mg/l) 2,4-D (mg/l) Ph Phytagel (g/l) AgNO3 (1mg/ml) AS (Mm) Cefotaxime (mg/ml) Myo-inositol (g/l) IMAS + 30 60 5.2 100 - CCM + 30 0.7 2.5 5.8 0.5 100 - ReM + 30 0.7 0.5-1,5 15-50 2.5 5.8 0.5 150 - SeM + 30 0.7 0.5-1,5 15-50 5.8 0.5 150 - RM + 60 15 -50 5.8 150 Bảng Môi trường sử dụng thị manose biến nạp gen nhờ Agrobacterium tumefaciens Thành phần IMAS CCM ReM SeM RM N6 + + + + - MS - - - - + Sucrose g/l 30 30 30 30 60 Glucose g/l 60 - - - - T.T Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 L-proline (g/l) - 0.7 0.7 0.7 - MES (g/l) - - 0.5-1,5 0.5-1,5 - Hygromycin (mg/l) - - - - - 2,4-D (mg/l) - 2.5 2.5 Ph 5.2 5.8 5.8 5.8 5.8 Phytagel (g/l) - 5 5 AgNO3 (1mg/ml) - 0.5 0.5 0.5 - AS (Mm) 100 100 - - - - Cefotaxime (mg/ml) - - 150 150 150 Myo-inositol (g/l) - - - - 3.2 Phân tích biến nạp gen 3.2.1 Phương pháp tách chiết AND tổng số từ mô ngô Các tái sinh đưa đất Khi có thứ tiến hành thu mẫu để tách chiết ADN ADN tách chiết tinh phương pháp CTAB Saghai Maroof (1984) [6] có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Hóa chất sử dụng để tách chiết ADN sau: A Đệm CTAB 100 ml gồm: + CTAB (Cetyltrimethyl bromide): 2,25 gam ammonium + β-Mercapto ethanol : 250 µl + EDTA (Ethylenediamine tetraacetate): 4,5 ml + NaCl M : 30 ml + Tris HCl 8,0: 15 ml + H2O: 55 ml A Đệm TE EDTA Ph 8,0 gồm: + Tris HCl 8,0: 10 Mm + EDTA 8,0:1 Mm - Enzym Rnase: 10 µg/ml - Cồn tuyệt đối lạnh 21 - NaCl M - Dung dịch (24:1) gồm Chloroform/ Isoamylalcohol pha theo tỷ lệ 24/1 - Ispropropanol - Dung dịch rửa cồn 75% Tách chiết ADN từ ngô: Bước 1: Nghiền 0,3- 0,5 gam ngô nitơ lỏng thành bột mịn Bước 2: Chuyển bột vào ống ly tâm 1,5 ml Thêm 0,8 ml đệm CTAB ủ 650 C 10 phút Bước 3: ủ ống ly tâm 650 C 90 phút, lắc nhẹ nhàng dứt khoát 20 phút lần để việc tách có hiệu Bước 4: Ly tâm 12.000 vịng/phút, hút lớn dịch sang ống bổ sung 0.7ml dung dịch 24:1, lắc nhẹ nhàng 10 phút tiến hành ly tâm 10 phút tốc độ 10.000 vòng/phút nhiệt độ phòng Bước 5: Hút lớp dịch sang ống bổ sung 10µl ARNase (nồng độ 1µg/µl), ủ đến tiếng nhiệt độ 370C, Bước Bổ sung 0.6ml dung dịch 24:1, lắc nhẹ 10 phút Rồi tiến hành ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút 10 phút 22 T.T Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 Bước 7: Hút lớp sang ống mới, sử dụng iso propanol lạnh (0.6 ml – 0.8 ml) 10µl NaCl M để kết tủa ADN ống Bước 8: Ly tâm phút tốc độ 10.000 vòng/phút nhiệt độ phòng để thu kết tủa ADN Thêm ml dung dịch rửa (cồn 75 %), lắc vài phút, ly tâm phút tốc độ 10.000 vòng/phút Lặp lại việc rửa cồn từ đến lần theo mẫu ADN thu Thổi khô AND để khơ tự nhiên Bước 9: Hịa tan ADN kết tủa dung dịch TE 8,0 Bảo quản ADN 40 C ADN sau tinh sach theo phương pháp đo nồng độ nhờ máy quang phổ Nanodrop dựa vào để pha lỗng ADN nồng độ 50 ng/µl nước cất khử ion để chuẩn bị cho nghiên cứu 3.2.2 Phân tích PCR biến nạp gen Nguyên tắc PCR dựa vào phối hợp khả lai đặc hiệu ADN khả tổng hợp ADN in vitro ADN polymerase để nhân in vitro đoạ ADN (gen) khác lên hàng triệu lần so với ban đầu ADN polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khn mồi, mơi trường thích hợp có Dntp kéo dài thành sợi bổ sung với sợi khn Vì để nhân đoạn ADN đích, người ta cần phải biết trình tự nucleotide hai đầu đoạn ADN cần nhân để từ thiết kế cặp mồi đặc hiệu Mồi dùng phản ứng PCR thường có chiều dài từ 10 đến 40 nucleotide, tùy thuộc vào mức độ khuyếch đại đặc hiệu trình tự đích tùy thuộc vào mục đích nhà nghiên cứu Sau tiến hành chạy PCR với mẫu phân tích, sai khác ADN kiểm tra dựa vào phương pháp điện di Chúng sử dụng hai cặp mồi pmi xác định có mặt gen kháng manose (chị thị thực vật) cặp mồi CryIAc xác định có mặt gen kháng sâu CryIAc Hỗn hợp phản ứng bao gồm: - H2O Dung dịch đệm 10Xpcr 2,0µl MgCl (50 Mm) Dntp (1 Mm) Mồi xi (50 ng/ µl) Mồi ngược (50 ng/ µl) Tag- polymerase (5UI/µl ) ADN (25 ng/µl ) 13,5µl 1,0µl 2,5µl 0,5µl 0,5µl 0,5µl 1µl Phản ứng chạy máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc, USA) Chương trình chạy với cặp mồi PMI sau: - 940 C phút 940 C phút 590 C 30 giây 35 chu kỳ 720 C phút 30 giây 720 C 10 phút 40 C Chương trình chạy với cặp mồi Cry sau: - 940 C phút 940 C phút 550 C 45 giây 720 C phút 720 C 10 phút 40 C 35 chu kỳ Sản phẩm PCR sau điện di gel agarose nồng độ 1% Chuẩn bị gel: - Chuẩn bị khay điện di, lau khô, cài lược, chỉnh cho cân - Chuẩn bị gel agarose 1%, đưa vào lò vi sóng khoảng phút cho agarose tan hồn tồn dung dịch 1Xtbe Để nguội hỗn hợp 50-600C, bổ sung ethidium bromide đổ vào khay điện di - Sau khoảng 45-60 phút gel đông lại Rút lược khỏi gel Đặt khay vào bể điện di, bổ sung thêm dung dịch 1Xtbe cho ngập mặt gel, Tra mẫu ADN: 23 T.T Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 - Lấy 2µl đệm tra mẫu, thêm vào 8µl ADN sản phẩm, trộn tra vào giếng Tra thêm ADN marker kb vào giếng để xác định độ dài băng ADN Kết 4.1 Khả biến nạp gen kháng sâu (CryIAc) vào dịng ngơ HR8, HR9 vụ đông xuân 2007-2008 - Lắp nguồn điện vào bể điện di, chỉnh điện từ 85V-100V khoảng 45 phút đến ADN di chuyển từ cực âm sang cực dương điện trường Dựa vào vị trí vạch màu để dừng trình điện di Trong biến nạp gen thực vật, đặc biệt biến nạp gen thơng qua vi khuẩn Agrobacterium khả sống sót mức độ tái sinh hồn chỉnh mẫu biến nạp sau trải qua giai đoạn nuôi cấy chọn lọc quan trọng, định đến hiệu trình biến nạp Nhuộm gel chụp ảnh - Gel soi ánh sáng tử ngoại bước sóng 245 nm-260 nm máy soi chụp ảnh gel máy CLS-Microdoc (Clever Scientific Ltd,) Trong thí nghiệm chúng tơi, phơi non hai dịng ngơ sử dụng làm vật liệu hai hệ thống biến nạp khác biệt (H) (M) Hệ thống biến nạp (H) vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 mang AND plasmid vector – Padt1 chứa gen kháng sâu (CryIAc) thị chọn lọc thực vật hygromicin Ngược lại, hệ thống biến nạp (M) vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 mang AND plasmid vector – Padt2 chứa gen kháng sâu (CryIAc) thị chọn lọc thực vật manose Kết thí nghiệm thể bảng 3.2.3 Phương pháp đánh giá tính kháng sâu điều kiện nhà lưới Các dịng ngơ tái sinh 2-3 chuyển đất trồng Khi 5-6 lá, sâu đục thân tuổi đến tuổi Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp thả vào nõn ngô chuyển gen đối chứng Sau thả sâu tiến hành quan sát theo dõi mức độ kháng sâu chuyển gen đối chứng qua thông số sau: số bị sâu đục thân cắn, số lỗ bị đục cùng, kích thước lỗ bị đục, sâu bị chết Trong trình thu hoạch kiểm tra sinh trưởng phát triển sâu bắp đặc biệt thân ngô Bảng Kết biến nạp hai dịng ngơ chuyển gen vụ đơng xn 2007-2008 STT Dịng HR8 HR9 Chủng biến nạp Số lượng mẫu SeM TL tạo mô sẹo TL tái sinh chồi Cây bầu Cây ruộng Cây kết hạt CCM ReM H 420 125 21% 0 0 M 159 33 25 31% 0 0 H 230 77 47% 0 0 M 1458 500 207 76% 3% 18 24 T.T Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 Qua bảng ta thấy khả tiếp nhận gen CryIAc dòng HR9 tốt dịng HR8 Tỷ lệ tạo mơ sẹo, tỷ lệ tái sinh số bầu sử dụng hệ thống biến nạp (M) cao sử dụng hệ thống biến nạp (H) hai dòng HR8 HR9 Để phân biệt tế bào chuyển gen với tế bào không chuyển gen, trình chuyển nạp người ta thường đưa vào lúc với gen hữu dụng gen mã hố chất kháng sinh T-ADN Do tế bào chuyển gen phát triển mơi trường ni cấy có chất kháng sinh Các gen kháng sinh tồn chuyển gen với gen hữu dụng Tuy nhiên việc biểu độc tố kháng sinh chuyển gen sản phẩm chúng hạn chế lớn an toàn sinh học, làm chậm tiến độ ứng dụng chuyển gen sản xuất nông nghiệp Để khắc phục nhược điểm này, hệ thống chọn lọc tích cực đường mannose sử dung Hệ thống chọn lọc mannose dựa việc sử dụng gen pmi – phân lập từ Escherichia coli – làm gen thị để điều khiển tạo enzyme phosphomannose isomerase Trong môi trường nuôi cấy có thêm mannose, tế bào đối chứng khơng mang gen pmi, enzyme hexokinase tế bào làm biến đổi mannose thành mannose 6-phosphate nguồn carbon mà tế bào không sử dụng nên không phát triển Tế bào có mang gen pmi, enzyme phosphomannose isomerase tạo thành làm chuyển hoá mannose-6-phosphate thành fructose-6-phosphate nguồn carbon mà tế bào sử dụng cho sinh trưởng phát triển Vì vậy, có trồng có mang gen pmi có khả phát triển bình thường mơi trường ni cấy có chứa mannose, tế bào khơng có gen pmi không phát triển Hệ thống chọn lọc mannose áp dụng tạo biến đổi gen củ cải đường [7], ngơ, lúa mì [8] lúa indica Trong thí nghiệm chúng tơi, đường mannose không sử dụng thị chọn lọc thực vật mà nguồn cung cấp chất dinh dưỡng nhằm chọn tạo dòng ngơ biến đổi gen có tính an tồn sinh học cao (hình 3) A Sự phơi hóa mộ sẹo B Cây tái sinh bình tam giác Hình Một số hình ảnh tạo chồi tái sinh dịng ngơ vụ đơng xn 2007-2008 25 T.T Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 4.2 Khả biến nạp gen kháng sâu (Cry IAc) vào dịng ngơ HR9 vụ hè thu 2007-2008 Từ kết biến nạp vụ đông xuân 2007-2008, định sử dụng hệ thống biến nạp (M) dịng ngơ HR9 làm vật liệu nghiên cứu Với gần 5000 phơi dịng HR9 (trong 20 lần thí nghiệm) sử dụng làm vật liệu biến nạp vụ hè thu 2007-2008 Kết trình bày tóm tắt bảng Bảng Kết biến nạp gen vào dòng HR9 vụ hè thu Vụ Dịng Số lượng mẫu TL tạo mơ sẹo TL tái sinh chồi Cây bầu Cây ruộng 3% 18 33% 250 114 Cây kết hạt CCM ReM SeM RM Vụ đông xuân (đối chứng) Vụ hè thu HR9 1458 4305 207 244 HR9 4446 4305 1129 244 Qua bảng nhận thấy tỉ lệ tạo mô sẹo, tỉ lệ tái sinh chồi, số bầu số đưa đất thành công vụ hè thu tốt so với vụ đông xuân 2007-2008 Cây ngô chịu ảnh chặt chẽ với yếu tố môi trường (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm ) Sự sinh trưởng phát triển chúng chúng thời vụ khác năm ảnh hưởng lớn đến chất lượng phôi non Do ảnh hưởng tới khả tiếp nhận gen lạ mức độ hình thành mơ sẹo phơi hóa, tỉ lệ tái sinh hồn chỉnh A Sự phơi hóa mơ sẹo 76% 79% 68 Hơn mùa vụ ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm trình biến nạp, ảnh hưởng đến khả sống sót đưa đất, ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển ngô sau đưa đất ảnh hưởng đến khả hoa kết hạt sau đưa đất Như vậy, ngồi yếu tố kiểu gen (dịng HR9), cấu trúc vector hệ thống chọn lọc thực vật yếu tố thời vụ (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…) ảnh hưởng đến hiệu trình biến nạp gen CryIAc vào dịng ngơ HR9 (hình 4) B Cây tái sinh bình tam giác 26 T.T Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 C Hình ảnh tái sinh bình tam giác D Cây tái sinh đưa đất trước đưa mơi trường tự nhiên Hình Một số hình ảnh q trình biến nạp tái sinh dịng ngơ HR9 Bảng Kết phân tích PCR hệ To vụ hè thu 4.3 Phân tích biến nạp gen hệ to Trong số 114 đưa đất thành công vụ hè thu, chúng tơi thu 68 có hạt Để kiểm tra có mặt gen CryIAc gen chọn lọc pmi 68 dịng ngơ này, ADN tổng số chúng sử dụng thí nghiệm phân tích PCR Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% Kết trình bày hình bảng Hình Kết phân tích PCR số dịng ngơ HR9 hệ To (M:1kb ADN ladder ready-to-use # SM1163; +: vector pADT2; (-):H2O; CM8: dòng ngơ khơng biến nạp gen (làm đối chứng); 1,3,7,10,11:dịng ngơ biến nạp mang gen CryIAc;2,4,5,6, 8,9,12: dịng ngơ khơng mang gen CryIAc) STT Dòng HR9 Cây thu hạt Kết phân tích PCR pmi CryIAc 68 16 10 Qua bảng nhận thấy số 68 dịng HR9 thu hạt có 10 To có chứa gen CryIAc Như hiệu suất biết nạp gen CryIAc vào dòng HR9 sử dụng hệ thống biến nạp (M) đạt 0,22 % (10/4446) Trong thí nghiệm với 4446 phoi non ngô biến nap với hệ thống biến nạp (M) thu 16 mang gen pmi 10 mang gen CryIAc Hiệu suất trình biến nạp cải thiện đáng kể tỉ lệ nhiễm q trình biến nạp (lúc ni cấy phục hồi, đồng nuôi cấy, nuôi cấy chọn lọc tái sinh hoàn chỉnh ) giảm thiểu tối đa, đồng thời nâng cao tỉ lệ sống sót tỉ lệ kết hạt đưa đất T.T Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 3.4 Sự biểu gen kháng sâu (CryIAc) hệ T1 Trong nghiên cứu chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens, loài vi khuẩn thường tồn lâu dài mô tế bào thực vật trải qua trình loại bỏ vi khuẩn chọn lọc tế bào thực vật chuyển gen Và với nhiều loại đối tượng (i): vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen chuyển cịn tồn khối mơ hay gian bào mẫu phân tích; (ii) gen chuyển tồn tự tế bào chất, biến qua sinh sản hữu tính; (iii) gen chuyển tồn không họat động, tức không biểu thành protein có chức sinh học Hiện tượng thường thấy nhiều loại đối tượng Tuy nhiên mẫu phân tích thực vật qua nhân giống hữu tính, tức qua hệ T1, T2 … dạng hạt hồn tồn loại trừ khả Do để khẳng định biểu gen (CryIAc) kiểu gen kiểu hình hệ T1, 1500 hạt 10 dòng hệ To có chứa gen kháng sâu (CryIAc) trồng nhà lưới cách li (Hình 6) Khi 5-6 tiến hành thu mẫu để lưu giữ tủ lạnh sâu 800C, sau tiến hành thả sâu đục thân từ tuổi 1-2 với lần lập lại để đạt mật độ 9-10 con/cây Kết thí nghiệm số 1500 cá thể thuộc 10 dòng HR9 hệ To mang gen CryIAc có khoảng 100 cá thể thuộc 10 dịng To nói có biểu kháng sâu đục thân cao (Hình 7) Để kiểm tra có mặt gen CryIAc 100 cá thể T1 trên, ADN tổng số chúng tách chiết sử dụng thí nghiệm phân tích PCR Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% Kết trình bày hình 27 Trong biến nạp gen nói chung biến nạp gen thực vật nói riêng, việc tạo cá thể mang gen quan tâm yếu tố cần có, song biểu gen cá thể mang chúng yếu tố quan trọng định đến hiệu quả trình biến nạp Thơng thường, biểu gen quan tâm cá thể biến nạp gen phụ thuộc vào: cấu trúc vector: (đoạn khởi động, đoạn kết thúc ), số lượng đính vào hệ gen vị trí mà định vị Trong thí nghiệm chúng tơi gen CryIAc xác định có mặt cá thể T1 có biểu kháng sâu đục thân Do kết luận gen CryIAc biến nạp thành cơng vào dịng ngơ HR9 Để tạo dịng ngơ biến đổi gen, thơng thường tác giả trước phải biến nạp gen quan tâm vào dịng ngơ mơ hình Sau từ dịng ngơ mơ hình mang gen quan tâm lai chuyển sang dịng ngơ thương mại phương pháp chọn giống truyền thống Hơn nữa, để tạo giống ngơ thương mại, có suất cao, chống chịu tốt với điều kiện bất lợi, đồng thời phải có chất lượng tốt, mầu sắc hạt tiêu quan trọng Trong thực tế giống ngơ mầu vàng mầu đỏ có giá trị thương mại cao Trong chọn giống có giống bố mẹ có hạt mầu vàng/ đỏ có khả tạo giống lai mầu vàng/ mầu đỏ Các dịng ngơ biến đổi gen HR9 lần tạo Việt Nam có hạt mầu vàng khơng chứa gen kháng sinh Đây vật liệu lý tưởng chương trình chọn tạo giống ngơ Việt Nam có khả chống chịu với sâu bệnh điều kiện bất lợi, có khả thương mại hố cao 28 T.T Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 Hình Hạt 10 dịng ngơ hệ To có chứa gen kháng sâu (CryIAc) trồng nhà lưới cách li Hình Các dịng ngơ biến đổi gen hệ T1 có biểu kháng sâu đục thân (Sâu chết a,b; sâu sống (đối chứng):c; sâu chết thân:d) Hình Kết phân tích PCR số cá hệ T1 dịng ngơ biến nạp HR9 hệ To mang gen CryIAc ( M:1kb ADN ladder ready-to-use # SM1163 +: vector pADT2;(-):H2O; CM8: dịng ngơ khơng biến nạp gen; 2,4,5,6,8,13: dịng ngơ T1 có biểu kháng sâu; 1,7,9,10,11,12: dịng ngơ T1 khơng biểu tính kháng sâu) T.T Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 17-29 cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam”, Nhà Xuất Tài liệu tham khảo Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội [1] FAOSTAT (1986/ 2008), http://faostat.fao.org/ faostat/notes/citation.htm/online [2] Tổng cục thống kê (2008), Niên giám thống kê, tr 12-20 Dean D H., Adang M.J (1992), “Protein engineering of Bacillus thuringiensis δendotoxins and genetic manipulation for plant protection”, In: Plant Protein Engineering, Shewry P.R., Gutterdge S (Eds.), Cambridge University Press, Cambridge, UK, pp 293-311 Oerke E.C., Dehne H.W., Schonbeck F., Weber A (1994), “Crop production and crop protection: Esitimated losses in major food and cash crops”, Elsevier, Amsterdam [3] [4] [5] 29 Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn, (2003), “Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên [6] Saghhai Maroof, M.A.,Solima,K.M., Jorgenson, R.A.,Allard, R.W (1984), “Ribosome DNA spacer –length polymorphisms in barley:Mendelian inheritance,choromosomal location,and population dynamics.” Natl.Aca.Sci.USA 81: 8014 - 8018 [7] Joerbo M., Donaldson I., Kreiberg J., Peterson S.G., Brunstedt J.and Okkels F.T (1998), “Analysis of mannose selection used for transformation of suger beet”, Molecular Breed (4), pp 111-117 [8] Wright M., Dawson J., Dunder E., Suttie J., Reed J., Kramer R., Chang Y.F., Novitzky R Wang H and Artim-Moor L (2001), “Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) and wheat (Triticum aestivum L.) using the phosphomannose isomerase gene, pmi, as the seletable marker”, Plant Cell Report (20), pp 429-436 Choosing and Creating Maize Lines Carrying Insect Resistant Gene (CryIAc) by using Agrobacterium Tumefaciens Trương Thu Hằng Thái Nguyên teacher traning College, Quang Trung road, Thịnh Đán quarter, Thái Nguyên city, Thái Nguyên province Abstract: Maize, together with wheat and water rice, is one of the most important cereals of the world Gene transformation via Agrobacteria tumefaciens has been popular among developing countries like Viet Nam for being cost – saving and easily appilicable on various kinds of plants Insect resistant gene (CryIAc) has been transferred successfully into HR9 imported maize lines The research has initially assessed the expression of the transgenic gene by PCR method and assessment method for transgenic plants grown in insect isolated grid house Findings and results of thesis are of scientific value and practically significant for developing transgenic corn trees in Viet Nam in future  ... 3.4 Sự biểu gen kháng sâu (CryIAc) hệ T1 Trong nghiên cứu chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens, loài vi khuẩn thường tồn lâu dài mô tế bào thực vật trải qua trình loại bỏ vi khuẩn chọn lọc tế... chất kháng sinh Các gen kháng sinh tồn chuyển gen với gen hữu dụng Tuy nhiên vi? ??c biểu độc tố kháng sinh chuyển gen sản phẩm chúng hạn chế lớn an toàn sinh học, làm chậm tiến độ ứng dụng chuyển gen. .. (H) vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 mang AND plasmid vector – Padt1 chứa gen kháng sâu (CryIAc) thị chọn lọc thực vật hygromicin Ngược lại, hệ thống biến nạp (M) vi khuẩn Agrobacterium