Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 248-255 Thời gian sốc nhiệt mức độ tổn thương xương ấu trùng cá medaka chuyển gen rankl: HSE: CFP dòng c1c8 làm mơ hình bệnh lỗng xương Trần Thị Thùy Trang, Phạm Văn Cường, Phạm Thị Thanh, Hà Thị Minh Tâm, Trần Đức Long, Tô Thanh Thúy* Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 16 tháng năm 2017 Chỉnh sửa ngày 20 tháng năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: Cá medaka (Oryzias latipes) chuyển gen rankl:HSE:CFP dùng làm mơ hình bệnh để tìm hoạt chất chống lỗng xương Ở mơ hình cá này, gen chuyển rankl mã hóa cho protein Rankl - yếu tố kích thích hình thành biệt hóa tế bào hủy xương, điều khiển promoter cảm ứng nhiệt nên ấu trùng cá bị sốc nhiệt 39oC, Rankl ngoại sinh biểu làm tế bào hủy xương hình thành hoạt động, phá hủy xương (nhất xương cung thần kinh đốt sống) tạo nên kiểu hình giống lỗng xương Với nghiên cứu sử dụng dịng cá cho việc sàng lọc hoạt chất chống loãng xương, mức độ tổn thương xương cá tiêu quan trọng để đánh giá tác dụng chất Mức độ tổn thương xương điều chỉnh thời gian sốc nhiệt, nhiên mối quan hệ hai yếu tố chưa làm rõ Để tìm điều chúng tơi chia ấu trùng cá rankl:HSE:CFP dòng c1c8 ngày tuổi thành nhóm sốc nhiệt 39°C với khoảng thời gian 30, 60, 75, 90 120 phút, sau đánh giá mức độ tổn thương xương cá 11 ngày tuổi dựa vào số khoáng hóa Im chúng Kết xác định mức độ tổn thương xương cá tương ứng với khoảng thời gian nghiên cứu 33, 62, 65, 79 93% khẳng định mối tương quan thuận chặt mức độ tổn thương xương tương quan nghịch chặt số khoáng hóa với thời gian sốc nhiệt Đây liệu quan trọng giúp xây dựng quy trình phù hợp cho nghiên cứu loãng xương sử dụng dịng cá Từ khóa: Medaka, lỗng xương, chuyển gen, RANKL, thời gian sốc nhiệt Mở đầu thuốc liệu pháp chữa trị bệnh, nhiều nghiên cứu tiến hành mơ hình động vật có vú [1-3] Gần đây, số nhóm nghiên cứu giới chứng minh cá medaka (Oryzias latipes) mơ hình tốt cho nghiên cứu xương có chế phân tử tế bào trình phát triển tái tạo xương tương đồng so với người Bệnh loãng xương gây hoạt động hủy Loãng xương bệnh xương phổ biến, đặc trưng suy giảm mật độ cấu trúc xương Để tìm hiểu chế bệnh, tìm _ Tác giả liên hệ ĐT.: 84-988738016 Email: tothanhthuy_sinh@vnu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4617 248 T.T.T Trang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 248-255 xương lấn át tạo xương, hay suy giảm hormon estrogen q trình già hóa; bệnh xương đá suy giảm số lượng chức tế bào hủy xương ghi nhận cá [4-6] Thêm vào đó, cá medaka có đặc điểm động vật mơ hình vượt trội so với động vật có vú: kích thước nhỏ, chi phí ni dưỡng thấp, thời gian trưởng thành sinh dục ngắn, thụ tinh ngồi, phơi nhỏ suốt giúp dễ quan sát tế bào xương in vivo [7] Đặc biệt, việc biến đổi hệ gen để tạo cá chuyển gen hay đột biến làm mơ hình bệnh nghiên cứu bệnh thực dễ dàng [5, 6, 8-13] Tơ Thanh Thúy cộng Đại học Quốc gia Singapore tạo dòng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP biểu đồng thời Rankl (Receptor activator of nuclear factor kappa-β ligand) ngoại sinh protein phát huỳnh quang CFP (Cyan Fluorescent Protein) điều khiển promoter cảm ứng nhiệt hoạt động hai chiều dùng làm mơ hình lỗng xương [6] Rankl yếu tố kích thích hình thành, biệt hóa hoạt động tế bào hủy xương Khi cá bị sốc nhiệt, Rankl ngoại sinh biểu hiện, kích thích hình thành hoạt động tế bào hủy xương làm cho mô xương bị phá hủy, tạo kiểu hình giống lỗng xương [6] Hoạt động tế bào hủy xương quan sát sau sốc nhiệt cá chuyển gen kép rankl:HSE:CFP/ctsk:mCherry lai cá rankl:HSE:CFP với cá chuyển gen ctsk:mCherry biểu huỳnh quang màu đỏ mCherry tế bào hủy xương [6], mật độ huỳnh quang mCherry phản ánh mức độ tổn thương xương cá Cá rankl: HSE: CFP tiếp nhận từ Đại học quốc gia Singapore, ni, trì ổn định lai tách thành số dòng (subline) đồng di truyền với gen chuyển (trong có dịng c1c8 [14] dùng cho nghiên cứu này) phịng thí nghiệm chúng tơi Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN cho nghiên cứu loãng xương sàng lọc chất chống lỗng xương Do vậy, quy trình để tạo kiểu hình lỗng xương dựa mức độ tổn thương xương tạo dịng cá 249 khơng thể thiếu tiến hành nghiên cứu Các mức độ biểu Rankl ngoại sinh dẫn đến mức độ tổn thương xương khác tạo việc thay đổi thời gian sốc nhiệt Việc tìm mối tương quan thời gian sốc nhiệt mức độ tổn thương xương dòng cá (ở nghiên cứu dòng c1c8) quan trọng cho việc thiết lập quy trình sử dụng dịng cá làm mơ hình nghiên cứu bệnh loãng xương Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng Nghiên cứu thực cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP dòng c1c8 [6, 14], cá chuyển gen ctsk:mCherry cá chủng dại nhận từ Đại học quốc gia Singapore [6] 2.2 Phương pháp trì chăm sóc cá medaka Cá ni, trì dựa vào quy trình tiêu chuẩn phịng thí nghiệm giới [7] phương pháp thiết lập dựa điều kiện phịng thí nghiệm Việt Nam [14-16] 2.3 Phương pháp sốc nhiệt tạo kiểu hình lỗng xương Kiểu hình lỗng xương cá tạo dựa sở phương pháp qui trình mô tả Tô Thanh Thúy cộng [6] Ấu trùng cá rankl:HSE:CFP ngày tuổi chia thành nhóm: nhóm đối chứng khơng sốc nhiệt nhóm sốc nhiệt khoảng thời gian: 30, 60, 75, 90 120 phút; mức độ loãng xương phân tích lúc ấu trùng 11 ngày tuổi 2.4 Phương pháp nhuộm xương cá Ấu trùng cá 11 ngày tuổi, ngày sau sốc nhiệt nhuộm thuốc nhuộm Alizarin red (Sigma A5533) công bố [6] 250 T.T.T Trang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 249-255 2.5 Kỹ thuật chụp xử lý hình ảnh Chụp huỳnh quang ấu trùng cá sống: ấu trùng sốc nhiệt xử lý công bố trước [6], chụp máy chụp ảnh Optika lắp với kính hiển vi Zeiss Stemi 2000-C kết hợp với kit huỳnh quang (Lumos Technology Co Ltd.) Ấu trùng cá nhuộm xử lý qui trình miêu tả trước [6, 14, 15], chụp ảnh máy Optika với kính hiển vi Axioplanz Zeiss VMI0070 Hình ảnh phân tích nhờ phần mềm Image J 2.6 Phương pháp đánh giá mức độ khống hóa tổn thương xương cá Mức độ khống hóa ấu trùng cá xác định dựa sở phương pháp Watson cộng công bố năm 2017 [17] thay đổi cho phù hợp với nghiên cứu cách định lượng tương đối gián tiếp thơng qua số khống hóa xương Im Im tính tổng độ dài xương cung thần kinh mặt bên trái 15 đốt sống ấu trùng cá đo phần mềm Image J (Hình 1) Hình Minh họa cách đo chiều dài cung xương thần kinh ấu trùng cá phần mềm Image J Hình ảnh nhuộm xương alizarin red 15 đốt sống ấu trùng cá đối chứng với xương cung thần kinh (na) nguyên vẹn (chỉ đầu mũi tên đen) (A) cá bị sốc nhiệt có cung xương thần kinh bị tổn thương (đầu mũi tên trắng) (B) A’, B’: Hình minh họa việc đo chiều dài cung xương thần kinh đốt sống đánh dấu ô A, B tương ứng Dấu cung thần kinh bị phá hủy hồn tồn Chỉ số khống hóa nhóm cá thí nghiệm đại diện giá trị Im trung bình nhóm Giá trị Im tương quan ngược với mức độ tổn thương xương cá Mức độ tổn thương xương Id (%) tính cơng thức: I -I Id m nhóm đối chứng m nhóm sốc nhiệt I m nhóm đối chứng 100% Có thể hiểu mức độ tổn thương xương cá số phần trăm xương cá sốc nhiệt (đại diện số Im) bị so với cá đối chứng 2.7 Phương pháp phân tích thống kê Kiểm định ANOVA-một nhân tố T-test sử dụng để so sánh giá trị Im trung bình nhóm ấu trùng cá sốc nhiệt nhóm đối chứng ANOVA T-test tính dựa vào phần mềm Graphad đồ thị biểu diễn tương quan vẽ sử dụng Excel 2010 Kết thảo luận 3.1 Các kiểu hình tổn thương xương cá gây thời gian sốc nhiệt Như trình bày phần trên, để tạo mức độ tổn thương xương khác cá rankl: HSE: CFP, chia ấu trùng cá ngày tuổi thành nhóm khơng sốc nhiệt nhóm sốc nhiệt thời gian 30, 60, 75, 90 T.T.T Trang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 248-255 120 phút Sau ngày, ấu trùng cá 11 ngày tuổi nhuộm xương Alizarin red Phần xương khống hóa bắt màu tím đỏ Đại 251 diện kiểu hình tổn thương xương nhóm cá nghiên cứu thể Hình Hình Hình ảnh nhuộm xương 15 đốt sống nhóm cá đối chứng nhóm cá bị sốc nhiệt khoảng thời gian nghiên cứu A: Ấu trùng cá không sốc nhiệt có cấu trúc xương đốt sống gồm thân đốt sống (sao màu trắng) cung thần kinh nguyên vẹn (mũi tên màu đen); B-F: ấu trùng cá sốc nhiệt 30, 60, 75, 90 120 phút; mũi tên đen: xương cung thần kinh nguyên vẹn; đầu mũi tên đen: cung thần kinh bị phá hủy phần, độ đậm/nhạt màu thể mức độ xương; đầu mũi tên trắng: xương cung thần kinh bị phá hủy hồn tồn Hình cho thấy ấu trùng cá đối chứng có xương cịn ngun vẹn với đốt sống bao gồm thân đốt sống (dấu Hình 2A) xương cung thần kinh nguyên vẹn (mũi tên đen Hình 2A) cá nhóm bị sốc nhiệt có xương cung thần kinh bị phá hủy mức độ khác (chỉ đầu mũi tên đen, xám trắng Hình 2B-F) Ấu trùng cá bị sốc nhiệt 30 phút có xương cung thần kinh bị phá hủy nhất, phần nhỏ (Hình 2B); cá bị sốc nhiệt 60 75 phút có xương cung thần kinh bị phá hủy nặng (Hình 2C,D) so với nhóm sốc nhiệt 30 phút, thể phần xương lại ngắn hơn; ấu trùng cá sốc nhiệt 90 phút có cung thần kinh bị phá hủy gần hoàn toàn, lại dấu vết cung xương vài đốt sống (Hình 2E); ấu trùng cá sốc nhiệt 120 phút có kiểu hình tổn thương xương nặng với toàn cung thần kinh bị hoàn toàn (Hình 2F) Chúng tơi nhận thấy kết thống với kết thực trước kiểm tra kiểu hình lỗng xương cá thuộc dịng c1c8 sau lai tách từ cá rankl:HSE:CFP ban đầu [14] đồng kiểu hình tổn thương xương cá thể điều kiện nhiệt độ thời gian sốc nhiệt 120 phút [14] Tổng quát lại kết phần cho thấy xu hướng tương quan thuận mức độ tổn thương xương ấu trùng cá với thời gian sốc nhiệt 3.2 Tương quan nghịch số khống hóa ấu trùng cá thời gian sốc nhiệt Để xác định mối tương quan thời gian sốc nhiệt mức độ tổn thương xương ấu trùng cá, đo tính số khống hóa Im ấu trùng tính số khống hóa Im trung bình ấu trùng nhóm cá thí nghiệm (n>30) Vì số khống hóa đại diện tổng chiều dài 15 cung xương thần kinh nên cá có cung thần kinh bị tổn thương nhẹ có số Im cao ngược lại Các kết thu trình bày Hình 252 T.T.T Trang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2S (2017) 249-255 Hình Chỉ số khống hóa Im trung bình nhóm ấu trùng cá bị sốc nhiệt thời gian nghiên cứu (A) đường cong tương quan Im thời gian sốc nhiệt (B) n: số ấu trùng cá nhóm cá thí nghiệm Nhìn chung chúng tơi thấy số khống hóa Im có xu hướng giảm tăng thời gian sốc nhiệt (Hình 3A) Nhóm cá khơng bị sốc nhiệt có xương hồn tồn ngun vẹn, khơng bị tổn thương có giá trị Im trung bình cao Giữa nhóm cá bị sốc nhiệt, nhóm bị sốc nhiệt 30 phút có giá trị Im trung bình cao nhóm sốc nhiệt 120 phút có giá trị Im trung bình thấp (Hình 3A) Kiểm định thống kê T-test khẳng định giá trị Im khác có ý nghĩa thống kê so với so với Im nhóm đối chứng (p