Phân lập tuyển chọn và sử dụng vi sinh vật ưa nhiệt trong phân hủy sinh khối bùn thải nhà máy tinh bột sắn fococev thừa thiên huế

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số 1S (2016) 31-37 Phân lập, tuyển chọn sử dụng vi sinh vật ưa nhiệt phân hủy sinh khối bùn thải nhà máy tinh bột sắn FOCOCEV Thừa Thiên Huế Ngô Thị Tường Châu1,*, Phạm Thị Ngọc Lan2, Phan Thị Thảo Ly2, Lê Văn Thiện1, Nguyễn Ngân Hà1 Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, 77 Nguyễn Huệ, Huế Nhận ngày 08 tháng năm 2016 Chỉnh sửa ngày 12 tháng năm 2016; chấp nhận đăng ngày 06 tháng năm 2016 Tóm tắt: Bằng việc sử dụng môi trường nuôi cấy làm giàu loại mơi trường phân lập thích hợp, phân lập 78 chủng vi khuẩn, 73 chủng xạ khuẩn 53 chủng nấm mốc ưa nhiệt từ bùn thải nhà máy tinh bột sắn FOCOCEV Thừa Thiên Huế Tiến hành đánh giá hoạt lực phân hủy chất hữu phương pháp khuếch tán enzyme, tuyển chọn chủng vi khuẩn V18, chủng xạ khuẩn X38 chủng nấm mốc N37 từ chủng phân lập Các chủng đặc tính đối kháng lẫn Dựa vào đặc điểm hình thái phân tích trình tự 16S rRNA (hoặc 28S rRNA) xác định chủng V18, X38 N37 thuộc loài Bacillus subtilis, Aspergillus fumigatus Streptomyces glaucescens So với đối chứng công thức thí nghiệm khác, cơng thức CT8 với việc sử dụng tất chủng tuyển chọn nâng cao đáng kể hiệu phân hủy sinh khối bùn thải nhà máy tinh bột sắn FOCOCEV Thừa Thiên Huế với độ giảm khối lượng, thể tích cellulose 19,73; 33,75 29,33% Vì tập hợp giống vi sinh vật ưa nhiệt xem xét sử dụng sản xuất phân bón hữu từ bùn thải nhà máy tinh bột sắn FOCOCEV Thừa Thiên Huế nói riêng bùn thải hữu nói chung Từ khóa: Vi sinh vật ưa nhiệt, bùn thải, ủ hiếu khí Đặt vấn đề* q trình sản xuất chủ yếu chất thành đống, tích tụ lâu ngày sinh mùi hôi thối, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Trong đó, bùn thải nguồn tài nguyên có giá trị tận dụng làm phân bón Bằng phương pháp ủ hiếu khí với tham gia tích cực hệ vi sinh vật ưa nhiệt, trình phân hủy bùn thải xảy nhanh chóng triệt để Đặc biệt, bên cạnh hàm lượng dinh dưỡng tăng đáng kể, sản phẩm phân bón khơng chứa vi sinh vật ký sinh trùng gây bệnh, hàm lượng kim loại nặng linh động thấp, đáp ứng yêu Sự đời nhà máy tinh bột sắn FOCOCEV Thừa Thiên Huế giải việc làm cho phận người dân, góp phần vào chuyển đổi cấu trồng vùng đất khơ hạn, từ thúc đẩy phát triển kinh tế xã hội tỉnh nhà Tuy nhiên, với việc nâng cấp công suất, chất thải nhà máy tăng lên đáng kể Phần bùn thải phát sinh _ * Tác giả liên hệ ĐT.: 84-917691012 Email: ngotuongchau@hus.edu.vn 31 32 N.T.T Châu nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số 1S (2016) 31-37 cầu sử dụng nông nghiệp mà không ảnh hưởng đến môi trường sức khỏe cộng đồng [1, 2] Mục tiêu nghiên cứu tạo nguồn giống vi sinh vật ưa nhiệt đánh giá khả ứng dụng phân hủy sinh khối bùn thải nhà máy tinh bột sắn FOCOCEV Thừa Thiên Huế, tạo điều kiện thuận lợi cho sản xuất phân bón hữu chất lượng cao Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt có khả phân hủy chất hữu cao phân lập tuyển chọn từ bùn thải nhà máy tinh bột sắn FOCOCEV Thừa Thiên Huế 2.2 Phương pháp nghiên cứu ● Phân lập vi sinh vật ưa nhiệt: Mẫu bùn thải thu theo phương pháp tổ hợp, sau ủ 30oC-2 ngày 50oC-3 ngày sử dùng làm mẫu gây cấy Các môi trường sử dụng q trình phân lập bao gồm: (i) Mơi trường nuôi cấy làm giàu (10% bùn thải khô, 1% giấy lọc, 0,5% cao nấm men, 0,1% pepton 0,1% K2HPO4 lít nước cất, pH 7,5) [3]; (ii) Môi trường thạch dinh dưỡng (NA), thạch tinh bột casein (SCA) thạch khoai tây dextrin (PDA) cho mục đích phân lập vi khuẩn, xạ khuẩn nấm mốc [4] Nuôi cấy làm giàu cách thêm 10 g mẫu gây cấy vào lít mơi trường, ni máy lắc 150 vịng/phút, 50oC, 10 ngày Sau đó, ria cấy dịch ni cấy làm giàu với độ pha lỗng thích hợp lên đĩa chứa môi trường phân lập Ủ 50oC 3, 10 ngày tương ứng với mục đích phân lập vi khuẩn, nấm xạ khuẩn Các khuẩn lạc riêng rẽ mọc tốt đĩa tiếp tục khiết cấy chuyền giữ giống ● Tuyển chọn vi sinh vật ưa nhiệt: Các chủng vi sinh vật có khả phân hủy chất hữu cao tuyển chọn phương pháp khuếch tán enzyme Theo đó, đĩa thạch chứa mơi trường thích hợp bổ sung riêng biệt 1% tinh bột, 1% carboxymethyl cellulose (CMC) 1% casein sử dụng để đánh giá khả phân hủy tinh bột, cellulose protein cách tương ứng Dịch nuôi cấy chủng vi sinh vật nhỏ vào lỗ bề mặt đĩa thạch Ủ 5-60C để dịch enzyme khuếch tán vào bề mặt thạch, ủ 50oC 2-3 ngày để dịch enzyme phân giải chất Nhuộm đĩa thạch có bổ sung tinh bột CMC thuốc nhuộm Lugol casein thuốc nhuộm Fraziae Đo kích thước vịng phân giải chất [5] Chọn chủng có hoạt lực cao cho nhóm vi sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn, nấm xạ khuẩn) ● Kiểm tra tính đối kháng chủng vi sinh vật ưa nhiệt: Sử dụng phương pháp cấy vng góc mơi trường thạch đĩa, ủ đĩa 50oC ngày [6] ● Định danh chủng vi sinh vật ưa nhiệt: Dựa vào đặc điểm hình thái phân tích trình tự gen 16S rRNA (đối với vi khuẩn xạ khuẩn) 28S rRNA (đối với nấm mốc) Các trình tự so sánh với liệu tương ứng sẵn ngân hàng liệu NCBI phần mềm BLAST [7] ● Nhân sinh khối vi sinh vật ưa nhiệt: Được thực nuôi cấy lắc môi trường dinh dưỡng 150 vòng/phút, 50oC, ngày Ly tâm thu sinh khối tạo dịch cấy có mật độ 107 tế bào/ml Riêng với xạ khuẩn nấm mốc, nuôi cấy môi trường sử dụng nguồn chất phối trộn cám gạo: vỏ lạc theo tỉ lệ 1:1 tỉ lệ nước: chất 8:10, ủ 50oC, ngày Thu sinh khối tạo dịch cấy với mật độ 107 bào tử/ml ● Đánh giá khả phân giải sinh khối bùn thải: Bùn thải nhà máy FOCOCEV Thừa Thiên Huế trộn phân phối vào chậu với khối lượng kg/chậu Bố trí cơng thức sau: (1) đối chứng (bùn thải không bổ sung vi sinh vật); (2) bùn thải + vi khuẩn; (3) bùn thải + xạ khuẩn; (4) bùn thải + nấm mốc; (5) bùn thải + vi khuẩn + xạ khuẩn; (6) bùn thải + vi khuẩn + nấm mốc; (7) bùn thải + xạ khuẩn + nấm mốc; (8) bùn thải + vi khuẩn + xạ khuẩn + nấm mốc Mật độ lượng giống cấy (mật độ 107 tế bào bào tử/ml N.T.T Châu nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 32, Số 1S (2016) 31-37 33 lượng giống 5%) Độ ẩm khối ủ 55-60%, ủ 50oC, 45 ngày Khối lượng thể tích khối ủ xác định phương pháp cân đo đạc Cellulose định lượng nguyên tắc hòa tan acid kiềm [8] ● Phương pháp xử lý số liệu: Thí nghiệm lặp lại lần Số liệu tính giá trị trung bình xử lí Microsoft Excel 2010 Ducan’s test theo chương trình SPSS 16 V78), 73 chủng xạ khuẩn (X1-X73) 53 chủng nấm mốc (N1-N53) môi trường NA, PDA SCA Từ tuyển chọn chủng vi khuẩn V18, chủng xạ khuẩn X38 chủng nấm mốc N37 có hoạt tính phân hủy chất hữu cao Kết trình bày bảng hình 1, 3 Kết nghiên cứu thảo luận Tính đối kháng chủng vi sinh vật ưa nhiệt kiểm tra phương pháp cấy vng góc Kết cho thấy chúng khơng thể đặc tính đối kháng lẫn (Hình 4) 3.1 Phân lập tuyển chọn vi sinh vật ưa nhiệt Dựa vào khác biệt hình thái khuẩn lạc, phân lập 78 chủng vi khuẩn (V1- 3.2 Tính đối kháng chủng vi sinh vật ưa nhiệt tuyển chọn Bảng Đường kính vịng phân giải chất hữu chủng vi sinh vật ưa nhiệt Kí hiệu chủng V18 N37 X38 Đường kính vịng phân giải (mm) Tinh bột Casein CMC 22,50 25,52 20,05 17,55 20,05 23,17 16,55 19,65 20,25 Hình Vịng phân giải tinh bột chủng vi sinh vật ưa nhiệt Hình Vịng phân giải casein chủng vi sinh vật ưa nhiệt 34 N.T.T Châu nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số 1S (2016) 31-37 Hình Vịng phân giải CMC chủng vi sinh vật ưa nhiệt đục, lan rộng bề mặt thạch, mép nhăn dày Tế bào có hình que ngắn nhỏ tế bào đứng riêng lẽ tạo thành chuỗi ngắn, Gram dương (Hình 5) Kết phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy tương đồng 100% với trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng Bacillus subtilis IAM 12118 (mã số truy cập NR 112116.1) Bacillus subtilis NCDO 1769 (mã số truy cập NR 118972.1) Hình Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn V18 Hình Tính đối kháng tập hợp chủng V18, X38 N37 3.3 Kết định danh chủng vi sinh vật ưa nhiệt Chủng vi khuẩn V18 môi trường NA xuất khuẩn lạc dạng khơ, có màu trắng Chủng xạ khuẩn X38 mơi trường SCA xuất khuẩn lạc có màu trắng, dạng trịn đường kính mm, cứng chắc, xù xì Khuẩn ty khí sinh phát triển tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm, sau ngày khuẩn lạc chuyển màu từ trắng qua màu xám Rìa khuẩn lạc có màu sáng Hệ khuẩn ty phân nhánh mạnh, vách ngăn Cuống sinh bào tử dạng xoắn lị xo (từ 2-5 vòng xoắn) xếp theo kiểu đối xứng đơn khuẩn ty khí sinh (Hình 5) Kết phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng X38 tương đồng 99% với trình tự đoạn gen 16S rRNA N.T.T Châu nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 32, Số 1S (2016) 31-37 35 chủng xạ khuẩn thuộc lồi Streptomyces glaucescens có mã số truy cập CP009438.1 Chủng nấm mốc N37 môi trường PDA xuất khuẩn lạc có màu xanh rêu đậm, bờ trịn, mịn, mọc ăn sâu vào mơi trường Sợi nấm có vách ngăn ngang, tế bào chân phân hóa rõ, cuống sinh bào tử dài, không phân nhánh phình to đỉnh, phía lớp tế bào hình chai tạo thành bơng Bào tử đính có hình cầu, mọc thành chuỗi (Hình 6) Kết phân tích trình tự đoạn gen 28S rRNA cho thấy tương đồng 100% với trình tự đoạn gen 28S rRNA chủng nấm mốc thuộc lồi Aspergillus fumigatus có mã số truy cập KM491894.1 3.4 Khả phân hủy sinh khối bùn thải vi sinh vật ưa nhiệt Mẫu bùn thải nhà máy chế biến tinh bột sắn FOCOCEV Thừa Thiên Huế có pH tương đối thấp (pH 5,72), độ ẩm thấp (32,5%), tỉ lệ C:N cao (50:1) mật độ vi sinh vật tổng số tương đối cao (vi khuẩn 92,4.106 CFU/g, nấm 85,6.106 CFU/g, xạ khuẩn 56,4.106 CFU/g) Ngồi mẫu cịn chứa số kim loại nặng có hàm lượng mức cho phép vi sinh vật kí sinh trùng gây bệnh (E coli 31.102 MPN/g, Cryptosporidium parvum 18.102 tế bào/g, Giardia duodenalis 25.101 tế bào/g) Việc bổ sung chủng vi sinh vật ưa nhiệt vào khối ủ có ảnh hưởng đến phân hủy sinh khối bùn thải cho hiệu xử lý tốt so với công thức đối chứng (Bảng 2, 3) Đặc biệt cơng thức có phối hợp ba chủng vi sinh vật tuyển chọn nâng cao cách đáng kể hiệu phân hủy sinh khối bùn thải, với độ giảm khối lượng, chiều cao khối ủ hàm lượng cellulose 19,73; 33,75 29,33% Qua cho thấy tiềm ứng dụng tập hợp giống vi sinh vật ưa nhiệt sản xuất phân bón hữu từ bùn thải nhà máy sản xuất tinh bột sắn FOCOCEV Hình Hình thái khuẩn lạc, hệ sợi khuẩn ty cuống sinh bào tử chủng xạ khuẩn X38 Hình Đặc điểm hình thái khuẩn lạc bào tử chủng nấm mốc N37 36 N.T.T Châu nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số 1S (2016) 31-37 Bảng Độ giảm chiều cao khối lượng khối ủ sau 45 ngày Chiều cao khối ủ (cm) Cơng thức Trước thí nghiệm Sau thí nghiệm Khối lượng khối ủ (kg) Độ giảm (%) Trước thí nghiệm Sau thí nghiệm Độ giảm (%) Đối chứng 8,0 7,3a ± 0,0 8,8 1,52 1,40a ± 0,02 7,89 b V18 8,0 6,3 ± 0,2 21,3 1,50 1,33b ± 0,03 11,33 X38 8,0 6,1c ± 0,3 23,8 1,50 1,28c ± 0,02 14,67 c N37 8,0 6,2 ± 0,2 22,5 1,50 1,30b ± 0,02 13,33 V18 + X38 8,0 5,6e ± 0,3 30,0 1,52 1,26cd ± 0,03 17,10 c V18 + N37 8,0 6,2 ± 0,2 24, 1,52 1,27c ± 0,02 16,45 X38 + N37 8,0 5,8d ± 0,3 32,5 1,50 1,24 ± 0,02 17,33 V18 + X38 + N37 8,0 5,3f ± 0,3 33,8 1,52 1,22 ± 0,02 19,73 Ghi chú: Sự khác chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Bảng Độ giảm hàm lượng cellulose khối ủ sau 45 ngày STT Công thức Đối chứng Chủng V18 Chủng X38 Chủng N37 Chủng V18 + X38 Chủng V18 + N37 Chủng X38 + N37 Chủng V18 + X38 + N37 Lượng cellulose gam mẫu (g) 0,78a 0,75b 0,77ab 0,78a 0,77ab 0,72c 0,75b 0,75b Độ giảm (g) 0,02 0,10 0,15 0,09 0,18 0,11 0,16 0,22 Tỷ lệ giảm (%) 2,56 13,33 19,48 11,53 23,37 15,28 21,33 29,33 Ghi chú: Sự khác chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Kết luận Đã tạo tập hợp giống vi sinh vật ưa nhiệt gồm chủng vi khuẩn V18, xạ khuẩn X38 nấm mốc N37 có tiềm ứng dụng sản xuất phân bón hữu từ bùn thải Trong chủng V18 có khả phân giải tinh bột casein cao với đường kính vịng phân giải tương ứng đạt 22,5 mm 25,52 mm; chủng X38 có khả phân giải CMC cao với đường kính vịng phân giải đạt 20,25 mm Các chủng V18, N37 X38 thuộc loài Bacillus subtilis, Aspergillus fumigatus Streptomyces glaucescens Việc bổ sung tập hợp giống vào khối ủ nâng cao đáng kể hiệu phân hủy sinh khối bùn thải nhà máy tinh bột sắn FOCOCEV Thừa Thiên Huế với độ giảm khối lượng, thể tích cellulose tương ứng 19,73; 33,75 29,33% Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số: 106NN.04-2014.53 Tài liệu tham khảo [1] Willson G.B., Dalmat D., Sewage sludge composting in the U.S.A, BioCycle, 24(5) (1983) 20 N.T.T Châu nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 32, Số 1S (2016) 31-37 [2] [3] [4] [5] Krzysztof Z., Paweł B., Intensification of sewage sludge composting Biotechnol Food Sci., 75(1) (2011) 15 Yusaku F., Shigeru K., Isolation and identification of thermophilic bacteria from sewage sludge compost J Ferment Bioeng., 72 (1991) 334 Balasundaran M., Development of microbial inoculants for aerobic composting KFRI Research Report No 324, 2008 Ponnuswamy V., Samuel G.P.V., A simple method for the detection of protease activity on agar plates using bromocresolgreen dye J Biochem Tech., 4(3) (2013) 628-630 [6] [7] [8] 37 Johnson L.F., Curl E.A., Bond J.H., Fribourg H.A., Methods of studying soil microflora and plant disease relationships Burges Publishing Co., Minneapolis, Minnesota, 1959 Altschul S.F., Madden T.F., Schaffer A.A., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J., Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein database search programs Nucleic Acids Res 25 (1997) 3389-3402 Viện Thổ nhưỡng Nơng hóa, Sổ tay phân tích Đất-Nước-Phân bón-Cây trồng, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội, 1983 Isolation, Selection and Utilization of Thermophilic Microorganisms in Degrading Sludge from Thua Thien Hue FOCOCEV Tapioca Starch Processing Factory Ngo Thi Tuong Chau1, Pham Thi Ngoc Lan2, Phan Thi Thao Ly2, Le Van Thien1, Nguyen Ngan Ha1 Faculty of Environmental Sciences, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi Faculty of Biology, Hue University of Sciences, 77 Nguyen Hue, Hue Abstract: By using an enrichment culture medium and suitable isolation media, there were 78 bacterial, 73 actinomyces and 53 fungal strains isolated from sludge of Thua Thien Hue FOCOCEV tapioca starch processing factory Based on the degradation activities of organic compounds that were determined by the well diffusion method, strains namely V18, X38 and N37 were selected They did not show mutual antagonism The strains V18, N37 and X38 were identified as members of the species Bacillus subtilis, Aspergillus fumigatus, and Streptomyces glaucescens, respectively based on their morphology characteristics and 16S rRNA (or 28S rRNA) gene sequences analysis Compared to the control and other experimental formulations, the formulation in which FOCOCEV sludge was inoculated jointly with three thermophilic microbial strains, could enhance remarkably the sludge digestion with the decrease of dry weight, pile height, and cellulose content were 19.73, 33.75 and 29.33%, respectively Therefore, this consortium may be considered for the utilization in composting of FOCOCEV sludge particularly and other organic sludges generally Keywords: Thermophilic microorganisms, sludge, aerobic composting  ... nhiệt có khả phân hủy chất hữu cao phân lập tuyển chọn từ bùn thải nhà máy tinh bột sắn FOCOCEV Thừa Thiên Huế 2.2 Phương pháp nghiên cứu ● Phân lập vi sinh vật ưa nhiệt: Mẫu bùn thải thu theo... khối bùn thải vi sinh vật ưa nhiệt Mẫu bùn thải nhà máy chế biến tinh bột sắn FOCOCEV Thừa Thiên Huế có pH tương đối thấp (pH 5,72), độ ẩm thấp (32,5%), tỉ lệ C:N cao (50:1) mật độ vi sinh vật. .. Bùn thải nhà máy FOCOCEV Thừa Thiên Huế trộn phân phối vào chậu với khối lượng kg/chậu Bố trí cơng thức sau: (1) đối chứng (bùn thải không bổ sung vi sinh vật) ; (2) bùn thải + vi khuẩn; (3) bùn