Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 32-39 Sử dụng thị ADN (RAPD-PCR) nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng cơng tác bảo tồn phát triển Việt Nam Phạm Thanh Huyền1,*, Đinh Đoàn Long2 Viện Dược liệu, Bộ Y tế, 3B Quang Trung, Hoàn Kiếm, Hà Nội Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội Nhận ngày 10 tháng năm 2017 Chỉnh sửa ngày 20 tháng năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 14 tháng năm 2017 Tóm tắt: Nhằm muc đích bảo tồn chọn, tạo giống lồi thuốc Đảng sâm tương lai Việt Nam, tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá mức độ đa dạng di truyền số quần thể Đảng sâm phân bố tự nhiên trồng trọt số tỉnh miền núi Tây Bắc (Lào Cai, Hà Giang, Sơn La) Tây Nguyên (Lâm Đồng, Kon Tum) Tổng cộng 15 mẫu quần thể Đảng sâm, có mẫu từ Lào Cai, mẫu từ Hà Giang, mẫu từ Sơn La, mẫu từ Lâm Đồng mẫu từ Kon Tum thu thập để tách chiết ADN phân tích đa dạng di truyền thị RAPD-PCR sử dụng 12 mồi có trình tự 10 nucleotit ngẫu nhiên Kết phân tích phần mềm NTSYSpc 2.1 cho thấy tổng cộng 106 băng RAPD-PCR thu có 88 băng đa hình (83%) 18 băng đồng hình (17%) 15 mẫu quần thể chia làm nhóm lớn, tách biệt rõ rệt nhóm mẫu thu Tây Bắc nhóm mẫu thu Tây Nguyên Các mẫu thu thập vị trí địa lý gần có khác biệt di truyền nhỏ cho thấy nhiều khả chúng có nguồn gốc chung Sự khác biệt di truyền cao quần thể cách xa địa lý cho thấy nguồn gen cần bảo tồn độc lập phục vụ cho công tác chọn lọc tạo giống tương lai Từ khóa: Condonopsis javanica, RAPD-PCR, đa dạng di truyền, khoảng cách địa lý Đặt vấn đề * bảo tồn, chọn, tạo nhân giống phù hợp, đáp ứng yêu cầu trình phát triển công nghiệp chế biến dược liệu bền vững, 2004) Hiện việc sử dụng thị ADN (RAPD-PCR, RFLP-PCR, AFLP, SSR, ) ngày sử dụng rộng rãi nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học, xác định khoảng cách di truyền đặc trưng cá thể quần thể thực vật nhằm mục đích bảo tồn chọn giống Đảng sâm (Condonopsis javanica (Blume) Hook f.) thuốc quý lưu truyền từ lâu đời với tác dụng bổ tỳ, ích khí, sinh tân khát Đảng Sâm đươc sử dụng để bồ bổ sức khỏe, thể bị suy nhược, dùng Đối với loài thuốc, yêu cầu hàng đầu công nghiệp dược phẩm dựa dược liệu tự nhiên yêu cầu tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu ban đầu Việc lựa chọn nguồn gen có chất phục vụ cơng tác chọn tạo giống lồi thuốc có vai trị quan trọng Trong q trình đó, việc phân tích thị ADN cho phép đánh giá cách xác mức độ đa dạng di truyền loài thuốc nhằm định hướng _ * Tác giả liên hệ ĐT.: 84-4-39363377 Email: huyenptnimm@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4068 32 P.T Huyền, Đ.Đ Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 32-39 loại thuốc bổ Ở Việt Nam, Đảng sâm tìm thấy phân bố rộng từ miền múi phía bắc tới tỉnh Nam trung Kon Tum, Lâm Đồng Tuy nhiên, khai thác mức nạn chặt phá rừng nên trữ lượng loài thuốc bị suy giảm Từ nhiều năm nay, Đảng sâm đưa vào Sách Đỏ Việt Nam, danh lục Đỏ thuốc Việt Nam đối tượng ưu tiên bảo tồn [1-3] Hiện nhu cầu sử dụng Đảng sâm Việt Nam lớn Vấn đề đặt làm để khai thác phát triển bền vững loài thuốc đáp ứng nhu cầu thị trường nước Để có sở cho công tác bảo tồn chọn lọc nguồn nguyên liệu làm giống để phát triển nguồn nguyên liệu làm thuốc việc đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen Đảng sâm thực cần thiết Vât liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Tổng cộng 15 mẫu thực vật thu thập số khu vực thuộc tỉnh Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Lâm Đồng, Kon Tum sử dụng nghiên cứu Dựa vào vị trí phân bố chúng mà mà chia mẫu Đảng sâm thành năm nhóm (N1 – N5) Mỗi mẫu kí hiệu bắt đầu chữ Cj (viết tắt Condonopsis javanica) theo sau số thứ tự từ đến 15 (xem Bảng 1) Các mẫu thực vật sau đưa phịng thí nghiệm làm nước cất cồn, phân tách lấy phần lá, thân Các phần mơ dập nát có biểu nhiễm bệnh bị cắt bỏ, sau mẫu nghiền nitơ lỏng chày cối khử trùng từ trước thành dạng bột mịn có kích thước hạt nhỏ 1mm Mẫu nghiền chia bảo quản ống Falcon 15 mL, bảo quản -800C để làm nguyên liệu tách chiết ADN tổng số Bảng Danh sách mẫu đảng sâm Việt Nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook f.) sử dụng nghiên cứu Nhóm mẫu (theo Tỉnh) N1 (Lào Cai) N2 (Hà Giang) N3 (Sơn La) Địa điểm (huyện/T xã) Sa Pả, Sapa Tả Phìn, Sapa Bản Khoang, Sapa Phó Bảng, Đồng Văn Xã Loong Hẹ, Thuận Châu Đa Sal, Lạc Dương N4 (Lâm Đồng) N5 (Kon Tum) Đa Sal, Lạc Dương 1 22.3311°, 103.8500° 22.4020°, 103.8262° 22.4265°, 103.8051° SHTB BT 9722 9711 9714 22.2322°, 105.1870° 9715 Cj4 21.1560°, 103.3227° 9719 Cj5 12.1735°, 108.6693° 9712 12.1735°, 108.6693° 9716 12.1742°, 108.6675° - Cj7 Cj8 12.1742°, 108.6675° - Cj9 14.2511°, 107.9878° 9708 Cj10 14.2511°, 107.9879° 9709 Cj11 14.1710°, 107.5842° 9748 Cj12 14.1710°, 107.5843° 9750 Cj13 14.4811°, 107.5760° 9706 Cj14 14.3725°, 108.1850° 9707 Cj15 Số lượng 2 Thôn 1, Xã Hịa Bình, Tp Kon Tum Huyện Hịa Bình Đăk Hà, Tu Mơ Rông Huyện Kon Plong 33 Tọa độ GPS Kí hiệu mẫu ADN Cj1 Cj2 Cj3 Cj6 P.T Huyền, Đ.Đ Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 32-39 34 Các mồi RAPD thuộc nhóm OPA OPC cung cấp từ hãng Fermentas (Lithuania) Bảng Danh sách mồi RAPD sử dụng nghiên cứu Mồi OPA1 Trình tự mồi 5’- CAGGCCCTTC -3’ Mồi OPA19 Trình tự mồi 5’- CAACGTCGGT -3’ OPA7 5’-GAAACGGGTC -3’ OPA20 5’- GTTGCGATCC -3’ OPA12 5’- TCGGCGATAG -3’ OPC1 5’-TTCGAGCCAG -3’ OPA13 5’- CAGCACCCAC -3’ OPC3 5’- GGGGGTCTTT -3’ OPA15 5’- TTCCGAACCC -3’ OPC12 5’- TGTCATCCCC -3’ OPA17 5’- GACCGCTTGT -3’ OPC20 5’- TTCCCCCCAG -3’ H Các thang chuẩn kích thước ADN: marker 1kb hãng Fermentas (Mỹ) Các hóa chất khác dùng tách chiết ADN phản ứng RAPD-PCR đảm bảo chất lượng độ tinh gồm đệm CTAB, chloroform, isoamyl acohol, EDTA, ethanol, agarose, thành phần PCR (MgCl2, đệm enzyme Taq DNA polymerase, dNTPs), thuốc nhộm ethidium bromide (EtBr), cung cấp bở hãng uy tín Sigma (Mỹ), Merk (Đức), Fluka (Thụy Sỹ) 2.2 Phương pháp nghiên cứu * Tách chiết ADN tổng số + Quy trình tách chiết ADN tổng số thực dựa nguyên tắc sử dụng dung môi hữu theo phương pháp Mini-CTAB Sanghai-Maroof cộng mơ tả năm 1984 [4], sau Edwards cộng cải tiến (năm 1991) [5] gồm bước sau: Cân 50 mg mẫu thực vật nghiền nitơ lỏng chuyển vào ống eppendorf 1,5 ml Bổ sung 900 µL dung dịch đệm nghiền (200 mM Tris HCl, pH 7,5; 25mM EDTA, pH 7,5; 250 mM NaCl; 2% CTAB 2% -mecaptoethanol) Ủ mẫu 65oC 90 phút Làm nguội nhiệt độ phịng, bổ sung 450 µL phenol/chlorofom/ isoamylalcohol (tỷ lệ thể tích: 25/24/1), ủ 10 phút Ly tâm 10.000 vòng/ phút 4ºC 10 phút; dùng pipet hút phần dịch sang ống eppendorf 1,5ml Bổ sung 600 µL isopropanol Ủ 4ºC qua đêm.Ly tâm 10.000 vòng /phút nhiệt độ phòng 10 phút; dùng pipetman loại bỏ dịch rửa tủa ADN hai lần ethanol lạnh (100%), kết hợp ly tâm.Để tủa khô tự nhiên (hoặc dùng máy cô ADN), hịa tan ADN kết tủa 100 µL đệm 1x TE (10 mM Tris-HCl, pH7.5, mM EDTA); bảo quản 4ºC ADN tổng số sau tách chiết kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 0.8% Thực điện di môi trường đệm 1x TBE, hiệu điện 90 V khoảng 45 phút Kích thước tương đối sản phẩm ADN tổng số xác định cách so sánh với thang ADN 1kb (Fermentas) Độ tinh ADN đồng thời kiểm tra định lượng phương pháp đo quang phổ hấp thụ (OD) bước sóng 260 nm 280 nm Dịch chiết pha loãng 100 lần (10 µl ADN tổng số + 990 µl dd H2O), tiến hành đo lần mẫu, kết lấy trung bình lần đo Mức độ tinh ADN (mức độ lẫn ARN protein) phản ánh qua tỷ số OD260/280 Các mẫu coi tinh có tỷ số nàyxấp xỉ 1,8 Nồng độ dung dịch gốc tính dựa hệ số 1,0 OD260 = 50 µg/µl dsADN * Kỹ thuật RAPD-PCR tiến hành qua hai bước: - Bước 1: ADN hệ gen nhân (khuếch đại) mồi ngẫu nhiên RAPD với thành phần phản ứng điều kiện (chu trình nhiệt phản ứng) PCR mô tả Bảng P.T Huyền, Đ.Đ Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 32-39 35 L Bảng Thành phần phản ứng PCR sử dụng cho Đảng sâm Việt Nam Thành phần phản ứng H2O (siêu sạch) ADN khn (50 ng/µL) Đệm Taq ADN pol (10x) dNTPs (2mM) Mồi RAPD (10 µM) Taq ADN pol (5u/ µL) Tổng thể tích PCR: 25 µL ; Thể tích (µL) 16,8 0,5 2,5 2,5 2,5 0,2 - Bước 2: Sản phẩm ADN sau PCR phân tích gel điện di agarose 1,0 - 1,5% chạy hiệu điện 60 - 80 V 45 phút phương pháp nhuộm với EtBr Kích thước tương đối băng khuếch đại so sánh với thang chuẩn kích thước ADN 1kb (Fermentas, 1kb DNA Ladder) * Phân tich di truyền RAPD - PCR Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR chuyển thành ma trận nhị phân phần mềm NTSYSpc 2.02h (Applied Biotstatistics, New York) theo nguyên tắc: có mặt băng ghi 1, vắng mặt ghi Từ ma trận nhị phân, hệ số tương quan DICE (SD), ma trận tương đồng theo cặp thiết lập Hệ số SD tính hai lần số băng chung hai mẫu chia cho tổng số băng thu hai mẫu (S = 2NAB / (NA + NB)) Hệ số thu 1,0 có nghĩa hai mẫu hồn tồn giống nhau, 0,0 có nghĩa hai mẫu khơng có điểm chung Cuối cùng, quan hệ di truyền mẫu xây dựng theo phương pháp UPGMA (Unweighted PairGroup Method with Arithmetical Averages) Kết nghiên cứu Sử dụng 12 mồi ngẫu nhiên (RAPD) để phân tích đa hình di truyền 15 mẫu đảng sâm Việt Nam thu tổng cộng 106 băng, trung bình 8,8 băng/mồi Trong đó, số băng đa hình 88, (chiếm 83 % tổng số băng) Số băng đồng hình 18 (chiếm 17%) Bảng Chu trình nhiệt PCR sử dụng cho Đảng sâm Việt Nam Bước phản ứng Biến tính bước đầu Biến tính Gắn mồi Kéo dài chuỗi Kéo dài bổ sung Bảo quản Nhiệt độ (˚C) 94 94 37 72 72 Thời gian (phút) 1 ∞ Số chu kỳ 35 3.1 Sự đa dạng di truyền mẫu quần thể Đảng sâm Việt Nam Bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, xác định hệ số tương đồng di truyền (bảng 5) 15 mẫu Đảng sâm Kết cho thấy, mẫu Đảng sâm thu khu vực Tây Bắc (Hà Giang, Lào Cai, Sơn La) mẫu thu Tây Nguyên (Lâm Đồng, Kon Tum) tách biệt thành nhóm (nhánh) rõ rệt Sự khác biệt di truyền lớn tìm thấy mẫu Cj5 (thu Thuận Châu, Sơn La) với mẫu Cj6 Cj7 (mọc tự nhiên Lạc Dương, Lâm Đồng) với hệ số khác biệt di truyền 0,38 Hai mẫu xác định có mức độ tương đồng di truyền lớn Cj8 Cj9 với hệ số tương đồng di truyền 0,95 Đây hai mẫu thu từ vườn trồng người dân Lạc Dương, Lâm Đồng; có lẽ chúng có nguồn gốc gần gũi kết người dân nhân giống tự phát Khi so sánh cặp mẫu phân bố địa giới hành (cùng Tỉnh), xu hướng đồng hình (tương đồng di truyền) cao rõ rệt so với cặp mẫu ngồi nhóm Sự đồng hình cao phạm vi quần thể phản ánh nhiều khả chúng có nguồn gốc chung xuất phát từ quần thể tự nhiên có kích thước tương đối nhỏ Điều cần lưu ý cho công tác bảo tồn, quần thể khai thác liên tục dễ dẫn đến hoàn toàn số vốn gen Khi so sánh mẫu thu khu vực phía Bắc (Cj1 - Cj5), có tương quan mức độ khác biệt di truyền với khoảng cách địa lý Trong đó, hai mẫu thu thị trấn Sa P.T Huyền, Đ.Đ Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 32-39 36 Pa Bản Khoang (Cj1 Cj3) có mức độ tương đồng di truyền 90% (SD = 0,9) Sự khác biệt di truyền mẫu có xu hướng tăng lên đối sách với mẫu Cj2 (thu Tả Phìn, Lào Cai; SD = 0,81 - 0,82) Cj4 (thu Phó Bảng, Hà Giang; SD = 0,83) Cj5 (thu Thuận Châu, Sơn La; SD = 0,71 - 0,74) Mức độ khác biệt di truyền chung dao động khoảng từ 10% (cặp mẫu Cj1 Cj3) đến 29% (cặp mẫu Cj5 thu Thuận Châu, Sơn La với Cj2 thu Tả Phìn, Lào Cai) Đối với 10 mẫu thu khu vực phía Nam, khác biệt di truyền dao động khoảng từ 5% (cặp mẫu Cj8 Cj9, mẫu trồng thu Lạc Dương, Lâm Đồng) đến 32% (cặp mẫu Cj11 thu Hịa Bình, Kon Tum Cj14 thu Tu Mơ Rông, Kon Tum) Kết bước đầu cho thấy, mức độ khác biệt di truyền cặp mẫu nhóm thu khu vực miền Bắc miền Nam tương đương (dao động khoảng từ 5% đến 30%) Sự khác biệt tăng lên rõ rệt so sánh hai cặp mẫu thu hai miền, với mức độ khác biệt di truyền cặp mẫu dao động từ 22% (mẫu Cj3 thu Bản Khoang, Lào Cai Cj8 thu Lạc Dương, Lâm Đồng) tới 38% (mẫu Cj5 thu Thuận Châu, Sơn La với Cj6/Cj7 thu Lạc Dương, Lâm Đồng) 3.2 Xây dựng quan hệ di truyền Mỗi mẫu nghiên cứu đại diện cho quần thể khu vực chúng phân bố, quan hệ di truyền 15 mẫu quần thể phân tích nhờ thị RAPD-PCR nghiên cứu (hình 1) phản ánh chúng tách thành cụm (nhánh) tương quan rõ rệt tương ứng với phân bố địa lý Mặc dù xét tổng thể mẫu thu thập từ miền, đa dạng di truyền lồi Đảng sâm nước ta tìm thấy, song phạm vi vùng phân bố, hệ số đa dạng (khác biệt) di truyền mẫu giảm rõ rệt Yếu tố địa lý có tương quan đến khác biệt di truyền Theo đó, xu hướng phổ biến mẫu có vị trí phân bố địa lí hình gần, mức tương đồng di truyền có xu hướng cao ngược lại Bảng Hệ số tương đồng di truyền 15 mẫu Đảng sâm thu thập nghiên cứu Tên mẫu Cj1 Cj2 Cj3 Cj4 Cj5 Cj6 Cj7 Cj8 Cj9 Cj10 Cj11 Cj12 Cj13 Cj14 Cj15 Cj1 1,00 Cj2 0,82 1,00 Cj3 0,90 0,81 1,00 Cj4 0,83 0,82 0,80 1,00 Cj5 0,74 0,71 0,78 0,71 1,00 Cj6 0,68 0,65 0,70 0,76 0,62 1,00 Cj7 0,69 0,67 0,67 0,77 0,62 0,90 1,00 Cj8 0,73 0,68 0,78 0,73 0,65 0,76 0,75 1,00 Cj9 0,73 0,66 0,76 0,75 0,66 0,78 0,75 0,95 1,00 Cj10 0,69 0,68 0,70 0,75 0,66 0,80 0,76 0,74 0,73 1,00 Cj11 0,67 0,67 0,66 0,70 0,66 0,78 0,81 0,72 0,71 0,91 1,00 Cj12 0,68 0,66 0,72 0,70 0,66 0,84 0,82 0,78 0,77 0,74 0,75 1,00 Cj13 0,71 0,65 0,73 0,69 0,65 0,86 0,83 0,78 0,77 0,75 0,77 0,92 1,00 Nam 3.3 Bước xác chỉ0,80 thị đặc nguồn gen đảng 0,69 0,64 định 0,71 0,71 số 0,66 0,76trưng 0,79 0,78 0,76 0,74 0,84 sâm 0,90Việt 0,84Nam 1,00 Cj15 đầu Cj14 0,74 0,72 Hình 0,78 0,67 0,64quan 0,76 hệ 0,72di0,78 0,78giữa 0,69150,68 Cây truyền mẫu0,77 đảng0,78 sâm1,00 Việt P.T Huyền, Đ.Đ Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 32-39 Từ kết thu được, bước đầu xác định số thị đặc trưng phân biệt hai nhóm đảng sâm Việt Nam thu Tây Bắc Tây Nguyên (bảng 6) Các hình 2, minh họa số băng đồng hình đa hình phân biệt 37 quần thể Đây sở cho việc sử dụng thị ADN, có RAPD-PCR việc định hướng bảo tồn phát triển nguồn gen Đảng sâm nói riêng dược liệu nói chung Bảng Một số thị RAPD-PCR đồng hình đa hình nguồn gen đảng sâm Việt Nam Nhóm mẫu Chỉ thị đặc trưng (đa hình) Chỉ thị chung (đồng hình) Miền Bắc Miền Nam (Lào Cai, Sơn La, Hà Giang) (Lâm Đồng, Kon Tum) OPA11100bp, OPA7600bp, OPA13200bp, OPA19600bp, OPA19700bp OPA191000bp, OPA201000bp, OPC3850bp OPC1300bp, OPC12750bp, OPA1600bp, OPA19850bp, OPA171100bp, OPA17550bp, OPA3525bp, OPA15400bp, OPA15700bp, OPA152200bp, OPC1400bp, OPC1700bp, OPC3650bp, OPC12500bp, OPC12600bp, OPC20500bp, OPC201400bp k M Cj1 Cj2 Cj3 Cj4 Cj5 Cj6 Cj7 Cj8 M Cj9 Cj10 Cj11 Cj12 Cj13 Cj14 Cj15 1100bp 600bp 300bp OPA1 Hình Chỉ thị RAPD-PCR 15 mẫu đảng sâm Việt Nam với mồi OPA1 Mũi tên kích thước băng 600bp (chỉ thị OPA1600bp) băng đồng hình cho tất mẫu, băng lại băng đa hình Cj1 - Cj15: kí hiệu mẫu Đảng sâm; M: marker ADN 1kb (Fermentas) M Cj1 Cj2 Cj3 Cj4 Cj5 Cj6 Cj7 Cj8 Cj9 Cj10 Cj11 Cj12 Cj13 Cj14 Cj15 1100bp 550bp OPA17 Hình Chỉ thị RAPD-PCR 15 mẫu đảng sâm Việt Nam với mồi OPA17 Mũi tên kích thước băng 1100bp 550bp (các thị OPA171100bp OPA17550bp) băng đồng hình cho tất mẫu, băng cịn lại băng đa hình Cj1 - Cj15: kí hiệu mẫu Đảng sâm; M: marker ADN 1kb (Fermentas) 38 P.T Huyền, Đ.Đ Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 32-39 OPC3 OPA15 Hình Chỉ thị RAPD-PCR số mẫu đảng sâm Việt Nam với mồi OPC3 (hình trái) OPA15 (hình phải) Hình ảnh phản ánh hiệu (tỉ lệ) tạo băng đồng hình đa hình khác mồi RAPD Cj1 - Cj15: kí hiệu mẫu đảng sâm Việt Nam; M: marker ADN 1kb (Fermentas) Kết luận Đã thiết lập thành phần điều kiện phản ứng PCR phù hợp cho phân tích thị RAPD-PCR cho phân tích di truyền lồi đảng sâm Việt Nam Theo đó, 25µL thể tích phản ứng gồm 25 ng ADN khn (mẫu thực vật), 1,75mM MgCl2, 0,2mM dNTPs, 1µM mồi RAPD đơn vị (u) enzym Taq DNA polymerase; với 35 chu trình nhiệt độ bắt cặp mồi 37oC Kỹ thuật RAPD-PCR dùng để đánh giá mức đa dạng di truyền 15 mẫu quần thể đảng sâm thu thập Việt Nam Sự tương đồng di truyền tìm thấy tương đồng với khoảng cách địa lý Các mẫu thu khu vực Tây Bắc (Hà Giang, Lào Cai, Sơn La) có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,71 đến 0,90 Các mẫu thu khu vực Tây nguyên (Lâm Đồng, Kon Tum) mức tương đồng di truyền khoảng 0,68 - 0,95 Sự khác biệt di truyền rõ tìm thấy cặp mẫu thu thập từ vùng, điển hình mẫu thu Thuận Châu (Sơn La) với mẫu thu Lạc Dương (Lâm Đồng) với hệ số khác biệt di truyền xác định 0,32 Cây quan hệ di truyền phân tách 15 mẫu thành nhánh rõ rệt phân bố miền Bắc miền Nam Một số thị RAPD - PCR đồng hình cho tất mẫu lồi đảng sâm Việt Nam, số khác có tính đặc trưng giúp phân biệt nhóm nguồn gen Chẳng hạn, thị OPA1600bp, OPA19850bp, OPA171100bp, v.v có tính đồng hình tất mẫu Đảng sâm Trong OPA11100bp đặc trưng cho nhóm mẫu thu Tây Bắc, hay OPA191000bp tìm thấy nhóm mẫu thu Tây Nguyên Kiến nghị Cần tiếp tục mở rơng nghiên cứu vốn gen Đảng sâm nói riêng loài dược liệu Việt Nam nói chung kỹ thuật phân tích ADN, gen hệ gen, có kỹ thuật RAPD-PCR, phục vụ định hướng cho công tác bảo tồn, chọn, tạo giống tiêu chuẩn hóa nguồn dược liệu làm thuốc Lời cảm ơn Bài báo kết thực nhiệm vụ quĩ gen cấp Nhà nước “Khai thác phát triển nguồn gen Hà thủ ô đỏ Đảng sâm Việt Nam làm nguyên liệu sản xuất thuốc” giai đoạn 2011 - 2015 Tài liệu tham khảo [1] Nguyễn Tiến Bân nhiều người khác (2007) Sách đỏ Việt Nam (phần II - Thực vật), NXB Khoa học tự nhiên công nghệ, tr 152 - 153 303-304 P.T Huyền, Đ.Đ Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 32-39 [2] Nguyễn Tập (2006) Danh lục Đỏ thuốc Việt Nam Tạp chí Dược liệu, tập 11, số 3, tr 97 - 105 [3] Đỗ Huy Bích cộng (2003) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (Tập + 2), NXB Khoa học Kỹ thuật [4] Sanghai-Maroof MA, KM Soliman, RA Jorgensen, RW Allard, Ribosomal DNA, 39 Spacer-length polymorphisms in barly Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics Proc Natl Acad Sci USA., 81: 8014-8018 [5] Edwards K, Johnstone, Thompson C (1991) A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis Nucleic Acids Res; 19(6): 1349 Analysis of Genetic Diversity on Medicinal Plants of Codonopsis javanica (Blume) Hook f using RAPD-PCR Technique Towards Conservation and Plant Breeding in Vietnam Pham Thanh Huyen1, Dinh Doan Long2 National Institute of Medicinal Materials, Ministry of Health, 3B Quang Trung, Hanoi, Vietnam VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Abstract: This study was subjected to assess the genetic diversity of Condonopsis javanica (Blume) Hook f germplasm in Vietnam for the purposes of conservation and its breeding for planting expansion Samples of 15 natural and cultivated accessions were collected throughout the country with two major areas of distribution in Northwest Highlands (Lao Cai, Ha Giang, Son La) and Western Highlands (Lam Dong, Kon Tum) DNA of 15 accessions were isolated and amplified by 12 arbitrary primers A total of 106 RAPD-PCR loci were detected, among which 88 loci (83%) were polymorphic, whereas the other 18 (17%) were homogeneous for all the collected accessions The cluster analysis showed that 15 accessions were divided into obviously distinct groups One consisted of accessions collected in Northwest highlands, while the other consisted of 10 remaining accessions collected in West highlands Thus, RAPD-PCR results indicated that there was abundant genetic diversity amongst natural and cultivated population of C javanica in Vietnam and their genetic relationship appeared to be related to their geographic distance Thus, germplasms at geographic distance should be subjected to the conservation and breeding programs of this medicinal plant species Keywords: Condonopsis javanica, RAPD-PCR, genetic diversity, geographic distance ... RAPD- PCR việc định hướng bảo tồn phát triển nguồn gen Đảng sâm nói riêng dược liệu nói chung Bảng Một số thị RAPD- PCR đồng hình đa hình nguồn gen đảng sâm Việt Nam Nhóm mẫu Chỉ thị đặc trưng (đa. .. tiếp tục mở rông nghiên cứu vốn gen Đảng sâm nói riêng lồi dược liệu Việt Nam nói chung kỹ thuật phân tích ADN, gen hệ gen, có kỹ thuật RAPD- PCR, phục vụ định hướng cho công tác bảo tồn, chọn,... nhiều năm nay, Đảng sâm đưa vào Sách Đỏ Việt Nam, danh lục Đỏ thuốc Việt Nam đối tượng ưu tiên bảo tồn [1-3] Hiện nhu cầu sử dụng Đảng sâm Việt Nam lớn Vấn đề đặt làm để khai thác phát triển bền vững