Nghiên cứu tác dụng tan huyết khối invitro củ saponin tách chiết từ cây tam thất panax notoginseng

Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lân II Hà Nội - 2015 NGHIÊN CỬU TÁC DỤNG TAN HUYẾT KHỐI INVITRO CỦA SAPONIN TÁCH CHIẾT TỪ CÂY TAM THÁT {Panax Notoginseng) Vũ Phưomg Thảo ^ Nguyễn Thị Thúy Mậu \ Nguyễn Thanh Hằng * Giáo viên hướng dẫn: Vũ Thị Thơm Nguyễn Thanh Hải ^ * Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội TÓM TẤT Theo y học cổ truyền, tam thất biết đến vị thuốc có nhiều tác dụng q: bình ổn huyết áp, chống tắc nghẽn mạch vành, chống kết tụ tiểu cầu, làm tan huyết khối ngăn ngừa xơ vữa mạch Tam thất có chứa nhiều nhóm chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt nhóm chất saponin như: notoginsenoside Ri, F tl, Fe, Fc ; ginsenoside Rgi, Re, Rbi, Rd Để góp phần phát triển thuốc từ dược liệu tam thất, tiến hành nghiên cứu tác đụng saponin, chiết xuất từ panax notoginseng, việc ngăn ngừa hình thành cục máu đông khả làm tan huyết khối in viứo Các nghiên cứu thực ừên mẫu máu người tình nguyện khỏe mạnh sử dụng phân tích huyết học tổng số, phân tích đơng máu quan sát thay đổi cục máu đông theo thời gian Thí nghiệm tiến hành ừên mẫu đối chứng mẫu với nồng độ saponin khác 10, 100, 1000, 10000 |ig/ml khoảng thời gian 90 phút 37°c Kết thí nghiệm cho thấy mẫu có nồng độ saponin cao (lOmg/ml) gây kéo dài thời gian đông máu gây giảm số lượng hồng cầu Trong đó, mẫu có nồng độ saponin thấp (10-1000 |ig/ml) khơng có khác biệt rõ rệt so với mẫu đối chứng Một điều thú vị nghiên cứu là: cho dù mẫu có nồng độ Saponin thấp hay cao có tác dụng làm tan cục máu đơng có xu hướng làm chậm q trình đơng máu in vitro Như vậy, nghiên cứu bước đầu cho thấy saponin toàn phần, chiết suất từ panax notoginseng, có tiềm làm tan cục máu đơng in vitro, qua giúp phịng ngừa biến chứng tim mạch tai biển mạch máu não bệnh nhân nguy cao xơ vữa động mạch hay tiểu đường Từ khóa: Tam thất, panax notosinseng, saponin, tan cục máu đông ANTI-THROMBOSIS OF TOTAL SAPONIN EXTRACTED FROM PANAX NOTOGỈNSENG SUMMARY Panax notoginseng (PN) is well knovvn used in Vietnamese traditional medicine for heart and circulation diseases such as stabilization o f blood pressure, anti-platelete aggregation, anti-thrombosis and prevention of artherosclerosis It contains a lot of bioactive 52 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội-2015 compounds incluđing saponins as notoginsenoside Ri, F tl, Fe, Fc ; ginsenoside Rgi, Re, Rbi, Rd With ftưther aim to develop drug, we investigated the anti-thrombosis effect of total saponin extracted from PN in viứo The study enrolled healthy volunteer for taking blood samples, then these samples were analyzed blood formular, coagulation and blood clot lysis Different saponin concentrations of 0, 10, 100, 1000, 10000 ng/ml were used with 90 minute incubation time at 37°c The results showed tìiat saponin at all concentrations tent to having anti-tìưombosis effect with increasing o f blood clot lysis dose dependently in vitro However, high concenữation o f saponin (10000 ^g/ml) could cause side eíĩects such as prolongation o f coagulation time (PT: 1,37 and APTT: 2,63 times higher in comparision wiứi conữol group); erythrocyte lysis and white blood cell damage In conclusion, at appropriate concenfrations (10-1000 fxg/ml), saponin showed beneíícial effects on blood clot lysis in vitro to prevent heart and coronary diseases, especially in diabetes or artherosclerosis patients with high risk o f heart and circulation complications Key words: panax notosinseng, saponin, blood clot lysis, anti-coagulation ĐẶT VẤN ĐỀ Huyết khối nguyên nhân nhiều bệnh tim mạch nhồi máu tim, đột quỵ hay tái hẹp mạch vành Huyết khối tượng có mối liên hệ chặt chẽ tới q trình đơng máu tổn thương tế bào nội mơ thành mạch máu [2] Bên cạnh đó, huyết khối cịn đóng vai trị quan trọng q trình bệnh sinh bệnh xơ vữa mạch, bệnh tim mạch biến chứng tim mạch bệnh tiểu đường, gây mối nguy hại to lớn cho sức khỏe người bệnh toàn giới, c tính hàng năm có tìr 2-4/1000 bệnh nhân cần liệu pháp chống đông máu tan huyết khối điều trị tắc nghẽn mạch máu [1,2] Hiện nay, thị trưcmg có nhiều loại thuốc có tác dụng chống huyết khối dùng để ngăn ngừa điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu, nhiên, bệnh nhân phải chịu rủi ro nguy chảy máu tác dụng phụ khơng mong muốn [10] Vì vậy, việc tìm thuốc chống huyết khối hiệu với giảm thiểu tác dụng phụ điều cần thiết Theo y học cổ truyền, tam thất (panax notogìnseng) biết đến vị thuốc có nhiều tác dụng q tăng lực, giúp bình ổn huyết áp, chống co thắt mạch vành, chống kết tụ tiểu cầu, làm tan huyết khối ngăn ngừa xơ vữa mạch [1] Tam thất có chứa nhiều nhóm chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt nhóm chất saponin như: notoginsenoside Ri, F tl, Fe, Fc ; ginsenoside Rgi, Re, Rbi, Rd [12] Một số nghiên cứu Saponin tách chiết từ thuốc y học cổ truyền Naodesheng Trung Quốc [2], từ Campomanesia xanthocarpa Brazil [7] hay từ rau chân vịt Hàn Quốc [6] chứng minh tác dụng ức 53 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 chế kết tập tiểu cầu chống huyết khối Saponin Để góp phần phát triển thuốc tị dược liệu tam thất Việt Nam, tiến hành nghiên cứu tác dụng saponin, chiết xuất từ panax notoginseng, với nồng độ khác việc ngăn ngừa hình thành cục máu đông khả làm tan huyết khối in vitro ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c u Đổi tượng Mầu máu người tình nguyện khỏe mạnh (500 ụl/nhóm) thu thập vào ống máu chứa chất chống đông không chứa chất chống đơng tìiy thuộc vào mục đích thí nghiệm Saponin tồn phần (dạng dung dịch) dung mơi hòa tan saponin cung cấp từ đề tài KHCN-TB.05C/13-18 Nồng độ saponin sử dụng thí nghiệm 0, 10, 100, 1000, 10000 fig/ml Thí nghiệm tan cục máu đơng 3-4 ml máu tồn phần thu nhận vào ống không chứa chất chống đông chia nhóm thí nghiệm Máu ống nghiệm để đông tự nhiên 37°c Sau đó, phần dịch loại bỏ khỏi ống máu, chi để lại cục máu đơng Tiến hành cân phân tích khối lượng cục máu đông ống 100 ụl saponin với nồng độ khác cho vào ống nghiệm, dung mơi hịa tan saponin sử dụng làm nhóm chứng ủ 37°c Sau 90 phút, loại bỏ dịch tiến hành cân phân tích phần cục máu đơng cịn lại Tác dụng làm tan huyết khối saponin định lượng tỷ lệ khối lượng cục máu đơng trước sau cho saponin Thí nghiệm chống hình thành cục máu đơng 3-4 ml máu tồn phần thu nhận vào ống không chứa chất chống đơng chia nhóm thí nghiệm với thể tích 500 ^1/nhóm 100 Saponin nồng độ cho vào mồi ống nghiệm Máu ông nghiệm để đông tự nhiên 37°c 90 phút Tiến hành cân phân tích khối lượng máu đơng ống Sau đó, phần dịch loại bỏ khỏi ống máu, để lại cục máu đơng Tiến hành cân phân tích cục máu đơng hình thành Tác dụng làm chống hình thành cục máu đông saponin định lượng tỷ lệ khối lượng cục máu đơng hình thành tổng khối lượng máu thí nghiệm Thí nghiệm đơng máu: đo PT APTT ml huyết tương thu nhận từ 4-6 ml máu toàn phần chứa ống có chất chống đơng citrate 3.8% phương pháp ly tâm với tốc độ 4500 rpm 10 phút 300 |xl huyết 54 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lăn II Hà Nội - 2015 tương chia ống nghiệm bổ sung vào ống 60 fil saponin với nồng độ khác 90 phút 37°c Sau tiến hành đo PT APTT Đo PT: 50 Jil hỗn hợp ủ phút ữong cuvet có khuấy từ 37°c trước bổ sung 100 |nl hóa chất PT (Analyticon, USA) Thời gian PT xác định khoảng thịri gian tị cho hóa chất PT vào hỗn hợp huyết tương tới hình thành cục đơng đo máy coagulation analyzer (Analyticon, USA) Đo APTT: 50 hỗn hợp ủ phút cuvet có khuấy tị 37°c trước bổ sung 50 |xl hóa chất APPT (Analyticon, USA) Sau phút, 50 |J.1 CaCb nồng độ 25mM thêm vào Thời gian APTT xác định khoảng thời gian từ cho CaCh vào hỗn hợp huyết tương hóa chất APTT tới hình thành cục đơng đo máy coagulation analyzer (Analyticon, USA) Thí nghiệm phân tích huyết học Máu tồn phần thu nhận vào óng chứa chất chống đơng EDTA (2ml/ống), sau chia nhóm thí nghiệm Sau đó, 100 ịxl saponin với nồng độ cho vào ống, lắc tay, ủ thời gian từ 90 phút Các số huyết học hồng cầu, cơng thức bạch cầu, tiểu cầu phân tích máy huyết học 18 thông số (Sysmex, Nhật Bản) X ỉỷ số liệu phân tích thống kê Các liệu thu thập xử lý thống kê phần mềm SPSS 7.0 đồ thị vẽ phần mềm Sigma Plot 11.0 Đối với so sánh nhiều giá tt-ị trung bình, phân tích phương sai ANOVA áp dụng với phép thử post hoc LDS/Tukey’s KÉT QUẢ NGHIÊN cứu Tác dụng làm tan huyết khối Saponin B A