Ứng dụng kĩ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán, phân loại ung thư vú và định hướng điều trị

Bài viết với mục tiêu nghiên cứu của đề tài này là: sử dụng thành tựu của công nghệ y sinh, thông qua các marker phân tử theo nguyên lý miễn dịch để chẩn đoán, phân loại ung thư biểu mô tuyến vú.

KỶ YẾU ỨNG DỤNG KĨ THUẬT HĨA MƠ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN, PHÂN LOẠI UNG THƯ VÚ VÀ ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ Trần Đức Hùng*, Nguyễn Quang Trung* , Nguyễn Thị Giang An**, Trần Thị Tuyển** Bệnh viện Ung Bướu Nghệ An Khoa Sinh – Đại học Vinh * ** TÓM TẮT Ung thư vú (UTV) loại ung thư thường gặp diễn biến phức tạp phụ nữ Sự đa dạng UTV gây khó khăn cho việc lựa chọn phác đồ điều trị cụ thể Mục tiêu nghiên cứu đề tài là: sử dụng thành tựu công nghệ y sinh, thông qua marker phân tử theo nguyên lý miễn dịch để chẩn đoán, phân loại ung thư biểu mơ tuyến vú Trên sở nhằm tiên lượng định hướng điều trị cho bệnh nhân Khảo sát 75 trường hợp ung thư biểu mô tuyến vú (UTBMTV) kết cho thấy: độ tuổi bị bệnh cao 50-59 (40%), vị trí khối u trái 53,3%, phải (46,7%), 40% bệnh nhân có tượng di sang hạch nách Khi phân loại mô học học cho thấy UTBMTV phân bố thể khác nhau, phổ biến thể ống xâm nhập (73,3%) Trong 55 trường hợp UTBM thể ống xâm nhập tỉ lệ độ mô học I, II 27,3% 72,7% Kết hóa mơ miễn dịch (HMMD) bệnh phẩm UTBMTV biểu ER+, PR+, HER -2+ với tỉ lệ 38,7%, 66,7%, 32% Phân nhóm UTV cho thấy: tỷ lệ nhóm 1A 12 %; 1B 12 %; 1C 1,3%; 2A 24,0%; 2B 18,7%; 2C 2,6%; ER/PR-,HER2+(8%); ER/PR-, HER2- (22,7%) SUMMARY Breast cancer is one of the most common and the most complicated cancers in women The variety of breast cancer has made it to be difficult for selecting a specific treatment regimen Objective of this study is to use achievements of the biomedical engineering through principles of immunological markers for diagnosis and classification of breast carcinoma, therefore, to predict and orient treating for patients Results of survey on 75 cases concerning breast carcinoma showed that the highest age of patients is from 50 to 59 year older (accounted for 40 %); tumor location was large on the left (53.3%), whereas on the right was 46.7%); 40% of total patients expressed to metastasize to theaxillary lymph nodes The histological classification denoted that the breast carcinoma appears in different places, in which the most common is in the penetrated ductal (causing the mammary ductal carcinoma, 55 cases, accounted for 73.3%) Of 55 cases of mammary ductal carcinoma, the rate I and II of histology were by 27.3% and 72.7%, respectively The results of immunohistochemistry on specimens of breast carcinoma with ER+, PR+, and HER-2+ expresses were by 38.7%, 66.7%, 32%, respectively Following grouping of breast carcinoma, subgroups 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C, ER/PR-, HER2 and ER/PR-, HER2- accounted for 12%, 12%, 1.3%, 24.0%, 18.7%, 2.6%, 8%, and 22.7%, respectively I ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vú ung thư thường gặp phụ nữ giới Việt Nam Ở Châu Âu, năm 2006 có khoảng 3,2 triệu người chẩn đoán ung thư 1,7 triệu người tử vong, ung thư vú chiếm 13,5% [4] Tại Việt Nam năm gần tỷ lệ ung thư vú có xu hướng tăng dần Theo Nguyễn Bá Đức, Hà Nội năm 1998 có 20,3/100.000 phụ nữ, vào năm 2001-2004 tăng lên 29,7/100.000 Theo Nguyễn Chấn Hùng, Thành phố Hồ Chí Minh, năm 1998 có 16/100.000, năm 2003 tỷ lệ 19,4/100.000 [4] 532 Trong chẩn đốn ung thư vú, mơ bệnh học thơng thường (nhuộm HE) xem tiêu chuẩn vàng việc chẩn đốn mơ học chủ yếu dựa vào hình thái cấu trúc mô học tế bào Trong đó, tế bào ung thư biểu hình thái giống lại có nguồn gốc khác Vì nhà giải phẫu bệnh gặp nhiều khó khăn việc xác định rõ nguồn gốc tế bào Sự đời phát triển kỹ thuật HMMD định để xác định rõ tính chất sinh học quần thể tế bào dòng chức khác Theo đó, HMMD giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ HỘI NGHỊ KHOA HỌC NGÀNH Y TẾ NGHỆ AN MỞ RỘNG - 2015 điều trị tiên lượng diễn biễn bệnh Bên cạnh HMMD cịn hỗ trợ cho việc điều trị đích, nhằm nâng cao hiệu điều trị tránh tổn thương cho tế bào lành Trong nước, HMMD triển khai nhiều sở y tế lớn Tại Bệnh viện Ung Bướu Nghệ An, HMMD bước đầu ứng dụng phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh-Tế bào nhằm mục đích chẩn đốn, phân loại định hướng điều trị cho bệnh lý ung thư, đặc biệt ung thư vú Vì chúng tơi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật HMMD chẩn đoán, phân loại ung thư vú định hướng điều trị” với mục tiêu: - Đánh giá biểu marker chính: ER (Estrogene receptor), PR (Progesterone receptor), Her2/neu (Human epidermal growth factor receptor 2) - Đánh giá mối tương quan biểu marker với với yếu tố lâm sàng - Phân nhóm phân tử ung thư vú dựa vào biểu marker định hướng điều trị II ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng, phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng Đối tượng nghiên cứu gồm 75 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến vú khám điều trị Bệnh viện Ung Bướu Nghệ An từ tháng 4/2013 đến tháng 6/2013 Số bệnh nhân xác định đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học thông thường phân loại UTV khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện Ung Bướu Nghệ An 2.2 Phương pháp nghiên cứu: phương pháp nghiên cứu mô tả 2.3.Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu có chủ định, thuận tiện, khơng chọn mẫu ngẫu nhiên Vật liệu nghiên cứu 2.1 Các kháng thể, dung dịch đệm rửa, bộc lộ kháng nguyên hệ thống phát hãng Dako Cytomation (Đan Mạch) * Các kháng thể sử dụng: Bảng Các loại kháng thể sử dụng Tên gốc DB053RTU-7anti ER (ER) DB053RTU-7anti PR (PR) DB053RTU-7anti C-erb-2 (Her-2/neu) Kháng thể đơn dòng Tỷ lệ pha lỗng Chứng dương tính Từ chuột kháng người 1: 40 Vú Từ chuột kháng người 1: 40 Vú Từ chuột kháng người 1: 50 Vú (ER: Estrogen receptor; PR: Progesteron receptor; Her2/neu: Human epidermal growth factor receptor 2) 2.3 Mô bệnh học thông thường: mẫu xử lý đúc paraffin cắt từ 3µ, cố định lên lam kính nhuộm HE (Sheehan D.C Hrapchak, 1980) * Dung dịch đệm rửa bộc lộ kháng nguyên 2.4 Phân loại mô học: dựa tiêu chuẩn phân loại WHO 2003 Phân độ mô học UTBMTV thể ống xâm nhập theo Scraff Blom Richardson, cải tiến Elston Ellis (1991) + Tris-Buffered Saline , pH 7.6 + Peroxidase Retrieval Solution, pH 9.0, Concentrated × 10 (S2367) * Hệ thống phát + EnVisionTM Detection Systems + Peroxidase/ DAB, Rabbit/Mouse (K5007) 2.2 Mẫu vật: Sử dụng mẫu tiêu mô bệnh học khối nến lưu trữ bệnh phẩm 75 bệnh nhân xác định UTBMTV kỹ thuật hóa mơ Bệnh viện Ung Bướu Nghệ An 2.5 Hố mơ miễn dịch: tiêu cắt 3µ ủ qua đêm Sau đó, tiến hành tẩy paraffin xylen, cồn (70o, 90o,100o) Bộc lộ kháng nguyên với pH = nhiệt độ 90-95oC 15 phút; khử peroxydase nội sinh H2O2 3% 10 phút Ủ kháng thể (ER, PR, HER-2) 60 phút, rửa TBS Ủ kháng thể 30 phút, sau nhỏ dung dịch DAB, rửa TBS Cuối nhuộm hematoxylin 533 KỶ YẾU Đánh giá kết nhuộm HMMD * Đối với ER, PR: sử dụng kháng thể đơn dòng từ chuột Đánh giá kết theo thang điểm Allred, dựa vào tỷ lệ cường độ bắt màu cúa tế bào u sau: Mức độ 0 Điểm 1/100 Tỷ lệ bắt màu (PS) 1/10 1/3 2/3 Cường độ bắt màu (IS) Không Yếu Vừa Mạnh Tổng điểm = PS + IS; Dương tính: tổng điểm >0 * Cách đánh giá thụ thể Her2: sử dụng kháng thể thỏ đa dòng kháng người Đánh giá theo tiêu chuẩn Dako, dựa khả bắt màu màng tế bào u Mẫu dương tính mẫu có cường độ bắt màu 2(+) 3(+) Phân tích số liệu thống kê: số liệu phân tích phần mềm SPSS 16 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tuổi mắc bệnh Bảng 1: Đặc điểm mối liên quan tuổi UTBMTV với marker phân tử Nhóm tuổi 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 Số bệnh nhân 11 (14,5%) 19 (25,3%) 30 (40%) (12%) (1,3%) ER(+) SL 12 (6,6%) (n=29) PR(+) Tỷ lệ 17,2 24,1 41,4 6,9 6,9 3,4 SL 14 20 (n=50) HER2(+) Tỷ lệ 14,0 28,0 40,0 10,0 6,0 2,0 SL 9 2 (n=24) Tỷ lệ 8,3 37,5 37,5 8,3 8,3 0,0 r 0,02 0,05 -0,08 p 0,989 0,658 0,473 Kích thước vị trí khối u Bảng 2: Đặc điểm khối u mối liên quan với marker phân tử Đặc điểm Kích thước khối u (n=75) Vị trí u (n=75) Di hạch (n=75) n ER (+) PR (+) HER2 (+) SL Tỷ lệ SL Tỷ lệ SL Tỷ lệ T < 2cm 2cm < T < 3cm 3cm < T < 4cm 4cm < T < 5cm T > 5cm Không rõ TT Phải Trái 14 19 26 10 35 40 18,67 25,33 34,67 13,33 1,33 6,67 46,7 53,3 12 17 21,4 32,1 25,0 14,3 0,0 7,1 41,4 58,6 14 17 25 25 19,1 29,8 36,2 8,5 2,1 4,3 50 50 12 0 14 10 18,2 13,6 54,5 13,6 0,0 0,0 58,3 41,7 Không di 31 37,9 11 44 22 29,3 29,2 < hạch 11 24,1 16 10,7 12,5 > hạch 25 31,0 30 15 20 12 50,0 Không rõ TT 6,9 10 6,7 8,3 p 534 Tỷ lệ 0,869 0,412 0,049 HỘI NGHỊ KHOA HỌC NGÀNH Y TẾ NGHỆ AN MỞ RỘNG - 2015 Kết mô bệnh học Bảng 3: Phân loại phân độ mô bệnh học Tổng Đặc điểm Phân loại mô bệnh học (n=75) n ER (+) HER2 (+) Tỷ lệ SL Tỷ lệ SL Tỷ lệ SL Tỷ lệ Thể ống xâm nhập 55 73,3 22 75,9 39 78,0 17 70,8 Thể ống nhỏ 11 14,7 17,2 10,3 8,3 Thể nội ống 2,6 0,0 50,0 8,3 Thể trứng cá 1,3 3,4 50,0 4,2 Thể tiểu thùy xâm nhập 1,3 0 0 0 Thể tiểu thùy 1,3 0 0 0 Thể tủy 1,3 0 2,0 0,0 Thể nhày 1,3 3,4 2,0 4,2 Thể vi nhú xâm nhập 1,3 0 2,0 4,2 Tuyến nhú 1,3 0 2,0 0 p Độ mô học ( 55 TH thể ống xâm nhập) PR (+) 0,659 0,300 0,653 Biệt hóa rõ (Độ I) 15 27,3 6,7 12,0 4,0 Biệt hóa vừa (Độ II) 40 72,7 17 22,7 30 40,0 14 18,7 Biệt hóa (Độ III) 0 0 0 0 r 0,083 0,147 0,145 p 0,545 0,284 0,292 Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch Bảng 4: Tỷ lệ biểu marker phân tử ER (+) Đặc điểm Dương tính Dương tính 1(+) Dương tính 2(+) Dương tính 3(+) Tổng p Âm tính SL 17 29 Tỷ lệ 22,7 9,3 6,7 38,7 46 61,3 PR (+) SL 20 12 18 50 25 HER2 (+) Tỷ lệ 26,7 16 24 66,7 33,3 SL 18 17 42 33 Tỷ lệ 24,0 9,3 22,7 56,0 44 Bảng 5: Phân nhóm ung thư biểu mơ tuyến vú Các marker (1A):ER+/PR+,HER2+ Nhóm ER/PR (1B): ER-/PR+,HER2+ (+) HER-2(+) (1C): ER+/PR-,HER2+ (2A): ER+/PR+,HER2Nhóm ER/ (2B): ER-/PR+,HER2PR(+), HER2 (-) (2C): ER+/PR-,HER2Nhóm ER/PR (-), HER2 (+) Nhóm ER /PR(-), HER2 (-) SL 9 18 14 17 Tỷ lệ 12,0 12,0 0,0 24,0 18,7 2,7 8,0 22,7 Tổng số r 24 % r (Her2, ER) = -0,016 45,3 % 8% 22,7 r (PR, ER) = 0,445 ** r (PR, HER2)= 0,121 p 0,889 0,000 0,300 535 KỶ YẾU IV BÀN LUẬN Theo kết nghiên cứu Onitilo AA cs năm 2009, vào biểu đồng thời marker ER, PR HER2 chia UTBMTV làm nhóm chính: nhóm 1: ER/PR(+)HER2(+) phù hợp với kiểu hình ống B (Luminal B); nhóm 2: ER/PR(+) HER2(-) phù hợp với kiểu hình ống A (Luminal A); nhóm 3: ER/PR(-)HER2(+) gọi kiểu hình HER2 nhóm 4: ER/PR(-)HER2(-) gọi ba âm tính phù hợp với kiểu hình giống đáy (basal-like) Trong cơng trình nghiên cứu này, phân loại UTBMTV làm phân Với phân chia tạo thành phân nhóm đáp ứng với biểu nội tiết khuếch đại gen Her 2/neu Nghiên cứu ý nghĩa biểu thụ thể estrogen (ER) progesteron (PR) Allred cs (1998) cho thụ thể có vai trị định đáp ứng 70% liệu pháp nội tiết Chính vậy, cắt bỏ nguồn sản xuất estrongen bệnh nhân có đáp ứng lâm sàng giống điều trị thuốc kháng nội tiết HER2 thụ thể glycoprotein màng tế bào tổng hợp từ proto–oncogen Her-2/neu, nằm vị trí 21 nhiễm sắc thể 17 Sự biểu mức thụ thể UTBMTV tiên lượng xấu, đặc biệt nhóm bệnh nhân có di hạch nách Ngày với phát triển công nghệ sinh học, người ta chế tạo kháng thể đơn dòng Herceptin (trastuzumab) Sự kết hợp trastuzumab hóa chất có khả kéo dài sống cho bệnh nhân UTBMTV Kết nghiên cứu 75 bệnh nhân cho thấy, nhóm PR dương tính 66,7%, ER dương tính 38,7%, Her-2+ 32,0% (bảng 4) Trong đó, estrogene progesterone có mối tương quan thuận vừa với với 0