Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 – hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dƣơng Thị Giang PHÁT HIỆN NGƢỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21- HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dƣơng Thị Giang PHÁT HIỆN NGƢỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21- HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS BS Trần Huy Thịnh PGS.TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội - Năm 2015 LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội hết lòng tạo điều kiện để chúng tơi học tập tốt đạt đƣợc thành nhƣ ngày hôm Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS.BS Trần Huy Thịnh, Phó trƣởng Bộ mơn Hóa sinh, Trƣờng Đại học Y Hà Nội, ngƣời Thầy tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học khoa Học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội giúp đỡ bảo cho tơi q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein, Trƣờng Đại học Y Hà Nội, toàn thể nhân viên Trung tâm tạo điều kiện giúp đỡ cho q trình nghiên cứu để hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Khoa Xét Nghiệm, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, anh chị em Khoa giúp đỡ cho q trình học tập, nghiên cứu để hồn thành luận văn Và cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình ngƣời bạn ln bên động viên, giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2015 Dương Thị Giang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CYP Cytochrome P450 CYP21 Cytochrome P450 21(steroid 21- hydroxylase) DNA Deoxyribonucleic acid DOC Deoxycorticosterone E Exon I Intron Ig2 Đột biến điểm intron 2( 656A/C →G) HLA Human leukocyte antigen KCĐ Không cổ điển MM Mất muối MHC Major histocompatibility complex MLPA Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification NHĐT Nam hóa đơn PCR Polymerase Chain Reaction Stop codon Mã kết thúc TSTTBS Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh 3β- HDS 3β- hydroxysteroid dehydrogennase 17-OHP 17 – hydroxyprogesteron 21-OH 21- hydroxylase ∆8bp Mất 8bp exon MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21HYDROXYLASE 1.1 Một số nét khái quát bệnh TSTTBS 1.2 Vài nét tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS 1.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS Việt Nam .5 1.3 Tần suất mắc bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh 1.4 Cơ chế bệnh sinh bệnh TSTTBS 1.5 Lâm sàng bệnh TSTTBS CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS 10 2.1 Cơ sở phân tử bệnh TSTTBS .10 2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức gen CYP21 10 2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS .11 2.2 Đặc điểm di truyền bệnh TSTTBS .13 2.3 Biểu lâm sàng, cận lâm sàng ngƣời mang gen dị hợp tử .14 2.4 Phát ngƣời lành mang gen bệnh 15 CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS 16 3.1 Chẩn đoán lâm sàng cận lâm sàng 16 3.1.1 Chẩn đoán xác định 16 3.1.2 Chẩn đoán phân biệt .17 3.2 Các phƣơng pháp sinh học phân tử phát đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS 18 3.2.1 Kỹ thuật PCR .18 3.2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) .19 3.2.3 Kỹ thuật Souther blot 20 3.2.4 Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification) 20 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 24 2.2.1 Dụng cụ trang thiết bị 24 2.2.2 Hoá chất 24 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 26 2.4 Đạo đức nghiên cứu 26 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.5.1 Thiết kế nghiên cứu 27 2.5.2 Tiến hành xét nghiệm .27 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 3.1 Kết tách chiết DNA 33 3.2 Kết phát đột biến gen bệnh nhân phát ngƣời lành mang gen bệnh 35 KẾT LUẬN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tần số mắc bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH giới Bảng 1.2: Các đột biến gen CYP21 thƣờng gặp gây TSTTBS cổ điển 12 Bảng 3.1 Các thành viên gia đình bệnh nhân 35 Bảng 3.2 Kiểu đột biến gen bệnh nhân thành viên gia đình 36 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ tổng hợp hormon vỏ thƣợng thận thiếu hụt enzym Hình 1.2: Nhiễm sắc thể số vị trí gen CYP21 10 Hình 1.3: Cấu trúc phân tủ gen CYP21 11 Hình 1.4 Quy luật di truyền gen lặn NST thƣờng 13 Hình 1.5 Phả hệ gia đình có bị bệnh di truyền lặn NST thƣờng (Autosome Recessive) Thế hệ I, II, khơng có ngƣời bị bệnh, hệ III có ngƣời bị bệnh 14 Hình 1.6 Giá trị 17-OHP sau nghiệm pháp kích thích ACTH thể bệnh ngƣời mang gen dị hợp tử 15 Hình 1.7 Các bƣớc kỹ thuật PCR 19 Hình 1.8 Các giai đoạn kỹ thuật MLPA 21 Hình 1.9 Sơ đồ vị trí số probe Kit MLPA P050B2 23 Hình 1.10 Hình ảnh minh họa kết MLPA 23 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 27 Hình 2.2 Sơ đồ vị trí số probe Kit MLPA P050B2 30 Hình 3.1 Kết kiểm tra chất lƣợng DNA tách từ mẫu bệnh phẩm 33 Hình 3.2 Kết điện di kiểm tra DNA tổng số 34 Hình 3.3 Phả hệ gia đình số 01 38 Hình 3.4 Kết MLPA gia đình mã số 01 39 Hình 3.5 Phả hệ gia đình số 02 40 Hình 3.6 Kết MLPA gia đình mã số 02 41 Hình 3.7 Phả hệ gia đình số 03 42 Hình 3.8 Kết MLPA gia đình mã số 03 43 Hình 3.9 Phả hệ gia đình số 04 44 Hình 3.10 Kết MLPA gia đình mã số 04 45 Hình 3.11 Phả hệ gia đình số 05 46 Hình 3.12 Kết MLPA gia đình mã số 05 48 Hình 3.13 Phả hệ gia đình số 06 49 Hình 3.14 Kết MLPA gia đình mã số 06 50 MỞ ĐẦU Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh - TSTTBS (congenital adrenal hyperplasia CAH) bệnh gây giảm hoàn toàn năm enzym tham gia vào trình tổng hợp corticosteroid, dẫn đến rối loạn trình tổng hợp hormon vỏ thƣợng thận; đó, thể thiếu 21- hydroxylase (21-OH) hay gặp chiếm tỷ lệ 90 - 95%, thể thiếu 11β-hydroxylase chiếm - 9%, lại thể bệnh gặp thiếu hụt 3-hydroxy steroid dehydrogenase (3β-HSD), 17α-hydroxylase 20, 22- desmolase [1] Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase bệnh di truyền đơn gen lặn, nhiễm sắc thể thƣờng đột biến gen CYP21A2 gây nên Đối với thể nặng, bệnh không đƣợc chẩn đốn sớm điều trị thích hợp dẫn đến suy thƣợng thận cấp bệnh nhân tử vong Các thể bệnh khác dẫn đến nam hóa trẻ gái, giả dậy sớm trẻ trai; bệnh ảnh hƣởng nặng nề đến phát triển thể chất, chức sinh sản, tâm lý ngƣời bệnh gia đình [6] Sự phát triển ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR, giải trình tự gen (Sequencing), MLPA (Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification)… phát đƣợc hầu hết đột biến gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh, đột biến điểm chiếm tỷ lệ từ 70 - 75%, dạng đột biến đoạn, thêm đoạn, lặp đoạn đảo đoạn chiếm từ 25 - 30% trƣờng hợp [25] Nhiều nghiên cứu tìm thấy mối tƣơng quan kiểu gen kiểu hình bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh cách xác định đột biến đặc trƣng thể bệnh Các đột biến gen CYP21A2 trầm trọng nhƣ: đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn gen lớn hay đột biến vô nghĩa (nonsense mutation) làm hồn tồn hoạt tính enzym 21- hydroxylase gây thể bệnh nặng hay gặp thể muối Đột biến sai nghĩa nhƣ I172N làm giảm hoạt tính enzym 21hydroxylase cịn - 2% so với bình thƣờng gặp thể nam hoá đơn hay P30L, V281L, P453S làm giảm hoạt tính enzym 21- hydroxylase cịn 20 - 50% so với bình thƣờng gặp thể bệnh khơng điển hình Xác định xác dạng đột biến gen CYP21A2 đóng vai trị quan trọng giúp chẩn đốn sớm có biện pháp can thiệp điều trị kịp thời nhằm giảm tác động việc thiếu hụt enzym 21 - hydroxylase bệnh nhân Bên cạnh việc xác định ngƣời lành mang gen cung cấp thông tin hữu ích cho tƣ vấn di truyền chẩn đoán trƣớc sinh giúp giảm tỷ lệ sinh đứa trẻ bị bệnh, đồng thời giúp sàng lọc sơ sinh để quản lý chăm sóc tốt trẻ có nguy cao bị bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh cộng đồng Các đột biến đoạn, lặp đoạn đảo đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 25 - 30%, dạng đột biến gây thể bệnh nặng nên cần phải có biện pháp chẩn đốn xác kịp thời Tuy nhiên, dạng đột biến khó xác định kỹ thuật PCR thơng thƣờng Gần đây, kỹ thuật MLPA phƣơng pháp với thời gian tiến hành ngắn, đơn giản độ nhạy cao phát xác dạng đột biến gen CYP21A2 Việc ứng dụng kỹ thuật MLPA chƣa đƣợc khai thác nhiều Việt Nam, đặc biệt việc xác định ngƣời lành mang gen gây bệnh di truyền Chính nhằm mục đích giúp quản lý tốt ngƣời mang gen cung cấp thơng tin hữu ích cho tƣ vấn di truyền chẩn đốn trƣớc sinh, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: Phát người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase kỹ thuật MLPA với mục tiêu: Phát ngƣời mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 - OH Hình 3.12 Kết MLPA gia đình mã số 05 Hình ảnh (hình 3.12) phân tích gen kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy ngƣời bình thƣờng xuất đủ đỉnh bệnh nhân đỉnh từ exon đến exon 1/2 ngƣời bình thƣờng, phân tích kết ngƣời bố thấy đỉnh exon đến exon 1/2 so với ngƣời bình thƣờng, cịn ngƣời mẹ có đỉnh exon 1/2 ngƣời bình thƣờng, từ kết bệnh nhân bố mẹ bệnh nhân chứng tỏ bệnh nhân mang đột biến dị hợp tử kết hợp xóa đoạn từ exon đến exon đột biến điểm I172 (probe exon thiết kế để phát đột biến I172N), ngƣời bố mang gen dị hợp tử xóa đoạn từ exon đến exon 3, ngƣời mẹ mang gen dị hợp tử I172N Phân tích thêm hình ảnh MLPA em trai em gái bệnh nhân thấy em trai bệnh nhân hồn tồn bình thƣờng, cịn em gái bệnh nhân mang đột biến tƣơng tự bệnh nhân 48 Kết phát đột biến gen phát người lành mang gen bệnh gia đình MS06: Hình 3.13 Phả hệ gia đình số 06 Ở hệ thứ có gái 18 tháng, mang đột biến dị hợp xóa đoạn exon đến exon với kiểu hình muối Bố 30 tuổi mẹ 28 tuổi Anh trai tuổi khơng có biểu bệnh Trong phả hệ không bị bệnh giống bệnh nhân 49 Kiểu gen gia đình số 06 Người bình thường C4B C4A Ex3 Ex4 E10P Ex8 Ex1 Ex6 E1P I2P Y SALSA MLPA KIT P050-B2 CAH, MRC-Holland Hình 3.14 Kết MLPA gia đình mã số 06 Hình ảnh phân tích gen kỹ thuật MLPA gen CYP21A2 cho thấy 50 ngƣời bình thƣờng xuất đủ đỉnh bệnh nhân đỉnh từ exon đến exon 1/2 ngƣời bình thƣờng, bệnh nhân có đột biến dị hợp xóa đoạn từ exon đến exon Phân tích kết ngƣời bố thấy đỉnh exon đến exon 1/2 so với ngƣời bình thƣờng, chứng tỏ bố bệnh nhân ngƣời mang gen bệnh, cịn hình ảnh MLPA ngƣời mẹ bệnh nhân cho thấy tất đỉnh gen CYP21A2 bình thƣờng, chứng tỏ mẹ khơng có đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 51 KẾT LUẬN Ở nhóm bệnh nhân có đột biến, phát 2/6 bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1- exon 1- bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn kết hợp với đột biến I172N dị hợp tử Các bệnh nhân lại mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1- dị hợp tử xóa đoạn exon 1- Ở nhóm bố mẹ thành viên gia đình bệnh nhân (em trai, em gái), phát 4/6 ngƣời bố mang gen 5/6 ngƣời mẹ mang gen, em gái bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1- kết hợp với đột biến dị hợp tử I172N 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thúy Giang (2008), Nghiên cứu phát triển thể chất số yếu tố ảnh hưởng trẻ TSTTBS điều trị Bệnh viện Nhi trung ương, Luận văn Thạc sĩ Y học, Trƣờng đại học Y Hà Nội Triệu Quốc Khánh (2004), Nghiên cứu nhận thức bố mẹ bệnh nhân bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, Luận văn Thạc sĩ Y học, Trƣờng đại học Y Hà Nội Võ Thị Kim Huệ (2000), Góp phần nghiên cứu chẩn đoán điều trị bệnh TSTTBS thiếu enzyme 21- hydroxylase trẻ em, Luận án Tiến sĩ khoa học Y học, Trƣờng Đại học Y Hà Nội Trần Kiêm Hảo (2007), Xác định số đột biến CYP21 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzym 21- hydroxylase phát người lành mang gen bệnh, Luận án Tiến sỹ y học, Trƣờng Đại học Y Hà Nội Nguyễn Thị Phƣơng Mai, Lý Thanh Hà, Nguyễn Mai Hƣơng cộng (2008), “Xét nghiệm di truyền chẩn đoán trƣớc sinh bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh”, Tạp chí nghiên cứu y học, 57(4), tr 259 - 264 Thái Thiên Nam (2001), Phát đột biến gen CYP21 tăng sản thượng thận bẩm sinh so thiếu enzym 21-hydroxylase trẻ em, Luận văn Thạc sỹ y khoa, Trƣờng Đại học Y Hà Nội Thái Thiên Nam, Nguyễn Thị Phƣợng, Võ Thƣơng Lan (2002), “Phát đột biến gen CYP21 tăng sản thƣợng thận bẩm sinh thiếu enzyme 21-hydroxylase trẻ em gia đình trẻ bị bệnh viện Nhi”, Nhi khoa; tập 10, số đặc biệt chào mừng 100 năm Trƣờng Đại học Y Hà Nội Nguyễn Thu Nhạn (1994), “Dậy sớm”, Cẩm nang điều trị Nhi khoa Nhà xuất Y học, tr 245 - 246 53 Nguyễn Thu Nhạn, Cao Quốc Việt, Nguyễn Nguyệt Nga, Nguyễn Thị Phƣợng, Nguyễn Thị Hồn, Trần Thị Hịa (1991), “Bệnh rối loạn nội tiếtchuyển hóa di truyền viện bảo vệ sức khỏe trẻ em”, Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học 10 năm (1981 – 1990), tr 66 - 75 10 Nguyễn Thị Phƣợng (1996), “Đặc điểm di truyền hội chứng sinh dục thƣợng thận”, Di truyền học ứng dụng, tr - 11 Nguyễn Thanh Thúy (2010), “Sử dụng kỹ thuật PCR lồng phát AND thai từ huyết mẹ ứng dụng chẩn đốn trƣớc sinh”, Tạp chí thông tin Y – Dược Số đặc biệt chào mừng ngày gặp mặt liên viện hàng năm giảng dạy nghiên cứu miễn dịch học lần thứ 20, tr 41 - 45 12 Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 13 Tạ Thành Văn (2010), PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất Y học, tr 28 - 32 Tiếng Anh 14 Aysha H Khan, Muniba Aban, Jamal Raza (2011), “Ethnic disparity in 21 – hydroxylase gene mutations identified in Pakistani congenital adrenal hyperplasia patients”, BMC Endocrine Disorders, Biomed central, pp.1 - 13 15 Angel O K Chan, But M W (2011), “Molecular analysis of congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency in Hong Kong Chinese patients”, Steroids, 76, pp 1057 - 1062 16 Amor M, Parker K.L, Globerman H, New M.I, White P.C (1998), “Mutation in the CYP21B gene (I12172→Asn) cause steroid 21- hydroxylase deficiency”, Proc Natl Acad Sci USA, 85, pp 1600 - 1604 17 Book C G D (2000), “Antenatal Treatment of a Mother Bearing a Fetus with Congenital Adrenal Hyperplasia”, Archive Disease Children Fetal Neonatal Ed, 82, pp 176 - 181 54 18 Dorr HG, Sippell WG (1993), “Prenatal dexamethasone treatment in pregnancies at rick for congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency: effect on midgestational amniotic fluid steroid levels”, J Clin Endocrinol Metab 76(1), pp 117 - 120 19 Fernanda B Coeli., Fernanda C Soardi, (2010), “Novel deletion alleles carrying CYP21A1P/A2 chimeric genes in Brazilian patients with 21hydroxylase deficiency”, BMC medical Genetics 20 Fibkielstain P.G, Chen W, Mehta P.S (2010), "Comprehensive genetic analysis of 182 unrelated families with congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency" J Clin Endocrinol Metab, 96 (1), pp 161 - 172 21 Forest G Maguelone (2004), “Recent advances in the diagnosis and management of congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency”, Human Reproduction, Vol 10, No6, pp 469 - 485 22 Gelehrter T.D, Collin F.S (1990), Principles of Medical Genetics, William and Wilkins, pp 299 - 312 23 Ghizzoni Lucia, Marco Cappa (2011), “Relationship of CYP21A2 genotype and serum 17 – hydroxyprogesterone and cortisol levels in a large cohort of Italian children with premature pubarche”, European Journal of Endocrinology, 165, pp 307 - 314 24 Higashi Y, Yoshioka H, Yamane M, Gotoh O, Fuji – K.Y (1986), “Complete Nucleotide Sequence of Two Steroid 21- Hydroxylase Genes Tandemly Arranged in Human Chromosome: A pseudogene and A Genuine Gene”, Proc Natl Acad Sci USA, 83, pp 2841 - 2845 25 Juan Tian, Guohua Yang (2011), “Molecular diagnosis of two families with classic congenital adrenal hyperplasia”, Gene No, pp 368 - 89 26 Keegan C E, Killeen A A (2001), “An Overview of Molecular Diagnosis of Steroid 21 – Hydroxylase Deficiency”, Journal of Molecular Diagnostics, 3(2), pp 49 - 53 55 27 Koppens P.F.J (2002), “Molecular genetics and epidemiology of steroid 21hydroxylase deficiency origin of disease- causing mutations”, Optima grafische communicate, Rotterdam, The Netherland 28 Larsen et al (2003), Congenital Adrenal Hyperplasia, Williams textbook of Endocrinology10th ed, pp 458 - 513 29 Levine L.S (2000), “Congenital Adrenal Hyperplasia”, Pediatrics in Review, 21 (5), pp 159 - 169 30 Marie I New (1998), “Diagnosis and management of congenital adrenal hyperplasiase”, Annul Rev Med, 49, pp 311 - 328 31 New M.I, Carlson A, Obeid J, Marshall I, Cabrera M.S (2001), “Prenatal Diagnosis for Congenital Adrenal Hyperplasia in 532 Pregnancies”, The journal of clinical Endocrinology & Metabolism, 86 (12), pp 5651 - 5657 32 Nike M M L Stikkelbroeck (2003), “CYP21 Gene Mutation Analysis in 198 Patients with 21 – hydroxylase Deficiency in the Netherlands: Six Novel Mutations and a Specific Cluster of Four Mutations”, Jounal Clin Endocrinol Metab, 88, pp 3852 - 3859 33 Nils Krone, Felix G (2005), “Functional Characterization of Two Novel Point mutations in the CYP21Gene causing simple virilizing forms of congenital Adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency”, The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism, 90(1), pp 445 - 454 34 Paola Concolino (2009), “Multiplex ligation – dependent probe amplification (MLPA) assay for the detection of CYP21A2 gene deletions/ duplications in Congenital Adrenal Hyperplasia: First technical report”, Clinical Chimica Acta, 402, Elsevier B.V, pp.164 - 170 35 Paulino.L.C (1999), “Mutation distribution and CYP21/C4 locus variability in Brazilian families with the classical form of 21 – Hydroxylase Deficiency”, Journal Acta Pediatric, 88, pp 275 - 283 36 Speiser P W (2005), “The Genetics of Steroid 21 – Hydroxylase Deficiency”, The Endocrinologist, 15 (1), pp 37 - 41 56 37 Speiser P.W (2000), “Congenital Adrenal Hyperplasia due to 21hydroxylase deficiency”, Endocrine Reviews, 21(3), pp 245 - 291 38 Theodoropoulou M, Barta C, Szoke M, Staub M, Ja’nos S, (2001), “Prenatal Diagnosis of Steroid 21- Hydroxylase Deficiency by Allene – Specific Amplification”, Fetal Diagnosis and Therapy, 16, pp 237 - 240 39 Vu C.D, Bui P.T, Kate Armstrong (2010), Growing numbers of children with CAH in Vietnam, Abstract submitted for 6th Congress of APPES 40 Zuzana Vrzalova (2011), “Chimeric CYP21A1P/CYP21A2 genes identified in Czech patients with congenital adrenal hyperplasia”, European Journal of Medical Genetics, No 54 pp 112 - 117 41 White P.C., Grossberger D, Onufer B.J, Chaplin D.D, Dupont B, (1985), “Two genes Encoding Steroid 21- Hydroxylase Are Located Near The Genes Encoding the Fourth Component of Complement in Man”, Proc Natl Acad Sci USA, 82 pp 1089 - 1093 57 PHỤ LỤC Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH Triệu chứng suy thƣợng thận cấp thiếu hụt Cortisol Aldosteron - Trẻ nôn nhiều, nôn tự nhiên không liên quan đến bữa bú, kèm theo ỉa chảy - Do nôn nhiều trẻ bị nƣớc, da nhăn nheo, sụt cân, mặt hốc hác, mắt trũng, môi khô - Xạm da, đặc biệt phận sinh dục - Trẻ tình trạng sốc: Da vân tím, mạch nhanh nhỏ khó bắt, huyết áp tụt, loạn nhịp tim Trong trƣờng hợp trẻ bị chẩn đoán nhầm với tiêu chảy cấp nƣớc, viêm ruột hoại tử bệnh nhiễm trùng khác - Rối loạn điện giải nặng: Na+ giảm, Cl- giảm, K+ tăng cao 5,2 mEq Không xử lý kịp trẻ tử vong trụy mạch ngừng tim Triệu chứng nam hóa tăng Testosteron - Ở trẻ trai: dƣơng vật to, dài so với tuổi, vùng bìu thâm, tinh hoàn bé tƣơng đƣơng với tuổi - Ở trẻ gái: bị nam hóa, âm vật phì đại nhƣ dƣơng vật, nên có trẻ sinh tƣởng nhầm trai Hai mơi lớn dính vào nhau, nhìn trơng giống bìu, khơng có tinh hồn Trong trƣờng hợp trẻ bị khai sinh nhầm trai * Thể nam hóa đơn Biểu lâm sàng chủ yếu cƣờng Testosteron gây nam hóa - Trẻ trai: Dậy sớm giả, dƣơng vật to, dài so với tuổi thể tích tinh hồn bé tƣơng đƣơng với tuổi bệnh nhân, không tƣơng xứng với dƣơng vật Mọc lơng sinh dục sớm - Trẻ gái: Âm vật phì đại trơng nhƣ dƣơng vật Âm vật phì đại đƣợc chia theo typs Prader Hai mơi lớn dính nhau, trơng giống bìu Khơng có tinh hồn khám lâm sàng kiểm tra siêu âm Phải làm xét nghiệm nhiễm sắc thể xác định giới tính xác nữ với Karyotyp 46.XX - Tốc độ lớn nhanh, bắp phát triển trông trẻ lực lƣỡng Tuổi xƣơng sớm so với tuổi thực nhƣng xƣơng đóng sớm nên đến tuổi dậy trẻ thấp so với trẻ lứa tuổi khác - Giọng ồm, mọc trứng cá, mọc lông sinh dục sớm so với tuổi Triệu chứng xét nghiệm - Xét nghiệm máu - Cortisol máu giảm - Aldosteron giảm - Testosteron tăng cao >1 nmol/l - Progesteron, 17- OH prgesteron tăng cao > 6.0 nmol/l - Điện giải đồ rối loạn: Na+ < 130 mEq/l, Cl- giảm, K+ tăng cao > mEq/l - Định lƣợng enzym 21- hydroxylase thiếu hụt có giá trị chẩn đốn đặc hiệu nhƣng chƣa làm đƣợc - Xét nghiệm giải trình tự gen MLPA để tìm đột biến gen CYP21A2 PHỤ LỤC Điều trị bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh Nguyên tắc điều trị Tăng sản thƣợng thận thận bẩm sinh bệnh điều trị đƣợc liệu pháp thay hormon thiếu hụt suốt đời, giúp ức chế hormon Testosteron, nhƣng tùy theo thể lâm sàng khác nhau, dùng thuốc khác Bệnh cần phát sớm, điều trị sớm tránh đƣợc tử vong cho trẻ đƣa trẻ sống bình thƣờng Điều trị cụ thể suy thượng thận cấp + Thay hormon thiếu hụt: *Cortisol: thƣờng dùng Hydrocortison 30- 50 mg/m2 Prednisonlon 15- 30 mg tiêm tĩnh mạch chậm, chia hai lần ngày * DOCA DCA mg/ống tiêm bắp sâu hàng ngày Khi trẻ hết nôn, hết nƣớc, ăn uống bình thƣờng thơi khơng tiêm Chuyển sang uống Hydrocortison viên 10mg với liều 15- 25 mg/m2 da Uống Florinef viên 0,1 mg với liều 0,005- 0,15 mg/ 24 + Truyền dịch: muối 0/00, đƣờng 5% theo tỷ lệ 1:1, sau có kết điện giải đồ bù theo điện giải đồ, đến Na+ tăng, K+ giảm bình thƣờng, trẻ khơng nơn, hết nƣớc thơi + Nếu K+ tăng cao, phải xử trí cấp cứu tiêm Gluconate Canxi 0,5g theo đƣờng truyền tĩnh mạch + Chống nhiễm toan chuyển hóa Bicarbonate 14% theo kết khí máu Điều trị trì suốt đời - Hydrocortison 10 - 25 mg/ m2/ ngày, dạng viên 10 mg uống lúc no Nếu khơng có Hydrocortison dùng Prednisolon mg/24 viên uống lúc no - Florinef viên 0,1 mg; 0,05 - 0,15 mg/ngày cho thể muối Uống thêm nƣớc muối đƣờng hàng ngày với lƣợng Na+ - mmol/l/ngày Nếu có yếu tố sang chấn nhƣ nhiễm khuẩn, chấn thƣơng, tăng liều Prednisolon Hydrocortison - lần trƣớc đƣa trẻ đến bệnh viện Phẫu thuật tạo hình cho trẻ gái Nếu bệnh nhân gái sau điều trị nội khoa ổn định cần phải mổ phẫu thuật chỉnh hình cắt bỏ âm vật phì đại, tạo hình niệu đạo Trƣớc mổ hai thì, mổ Phẫu thuật từ tháng tuổi giúp cải thiện tình trạng tâm lý cho bệnh nhân gia đình cải thiện đƣợc chức sinh dục, sinh sản cho bệnh nhân sau PHỤ LỤC QUY ƢỚC CÁC KÝ HIỆU SỬ DỤNG TRONG SƠ ĐỒ PHẢ HỆ THEO QUI ĐỊNH CỦA HỘI DI TRUYỀN NGƢỜI QUỐC TẾ Nam, nữ không bị bệnh Ngƣời mang gen dị hợp tử di truyền liên kết giới tính Ngƣời mang gen dị hợp tử bệnh di truyền lặn NST thƣờng Bệnh nhân Mối quan hệ vợ chồng Kết hôn cận huyết Số thứ tự Anh, chị, em ruột Khơng rõ giới tính Vơ sinh Sinh đôi khác trứng Đối tƣợng nghiên cứu Chết Sinh đôi trứng 11,19,21,23,27,30,33,34,39,41,43,45,47,48,50 1-10,12-18,20,22,24-26,28,29,31,32,35-38,40,42,44,46,49,51- ... mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase kỹ thuật MLPA với mục tiêu: Phát ngƣời mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu. .. TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dƣơng Thị Giang PHÁT HIỆN NGƢỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21- HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114... 22- desmolase [1] Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh thiếu enzym 21- hydroxylase bệnh di truyền đơn gen lặn, nhiễm sắc thể thƣờng đột biến gen CYP21A2 gây nên Đối với thể nặng, bệnh khơng đƣợc chẩn