Nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến trên gen cyp11b1 ở người bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -o0o - LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘT BIẾN TRÊN GEN CYP11B1 Ở NGƢỜI BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN BẨM SINH Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 Học viên: Nguyễn Thu Hiền Lớp: K15-Sinh học GVHD: TS Nguyễn Huy Hoàng Hà Nội, tháng 10 năm 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang DANH MỤC VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH ii DANH MỤC BẢNG iv MỞ ĐẦU - I TỔNG QUAN 1.1 Hormone tuyến thƣợng thận 1.1.1 Tuyến thượng thận - 1.1.2 Q 1.1.3 Điều hòa hoạt động steroid hydroxylase - 1.2 Cytochrome P450 1.2.1 Vai trò chức 1.2.2 Cấu trúc không gian cytochrome P450 10 1.3 Gen CYP11B1 - 11 1.3.1 Cấu trúc chức - 11 1.3.2 Cấu trúc không gian CYP11B1 12 1.4 Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh (TSTTBS) 14 1.4.1 Khái niệm 14 1.4.2 Tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu hụt 11β-hydroxylase 14 1.4.2.1.Cơ chế gây bệnh 14 1.4.2.2 Biểu lâm sàng 15 1.4.2.3 Cơ sở di truyền - 16 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.4.3 Tăng sản thượng thận bẩm sinh nguyên nhân khác 16 1.5 C 18 1.5.1 Chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh 18 1.5.2 Điều trị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh 19 1.6 Tình hình nghiên cứu 20 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Bệnh nhân 26 2.1.2 Hóa chất - 26 2.1.3 Thiết bị - 28 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu - 28 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số - 28 2.2.2 Điện di DNA gel agarose 28 2.2.3 Đo quang phổ DNA 29 2.2.4 Nhân gen kĩ thuật PCR 29 30 2.2.6 Giải trình tự gen tự động máy - 30 2.2.7 Tạo đột biến điểm trực tiếp (Site-directed mutagensis) - 31 2.2.8 Biểu tế bào COS-1 phân tích hoạt tính enzyme 31 2.2.9 Phân tích trình tự gen phần mềm tin học - 32 PHẦN III: KẾT QUẢ 33 3.1 Tách DNA tổng số 33 3.2 Xác định hàm lƣợng độ tinh DNA quang phổ kế - 34 3.3 Khuếch đại đoạn gen CYP11B1 - 35 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.4 Phân tích ảnh hƣởng đột biến gen CYP11B1 bệnh nhân - 38 3.4.1 Bệnh nhân 01 38 3.4.1.1 Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh 38 3.4.1.2 Phân tích trình tự phát đột biến 39 3.4.1.3 Biểu đột biến tế bào động vật 40 3.4.2 Bệnh nhân 02 42 3.4.2.1 Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh 42 3.4.2.2 Phân tích trình tự phát đột biến 43 3.4.2.3 Biểu đột biến tế bào động vật 44 3.4.3 Bệnh nhân 03 46 3.4.3.1 Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh 46 3.4.3.2 Phân tích trình tự phát đột biến 47 3.5 Phân tích cấu trúc 48 3.5.1 So sánh trình tự amino acid CYP11B1 - 48 3.5.2 Mơ hình cấu trúc 3D đột biến điểm CYP11B1 53 3.5.2.1 Mơ hình cấu trúc khơng gian CYP11B1 - 53 3.5.2.2 Đột biến R51K - 54 3.5.2.3 Đột biến E147D 55 3.5.2.4 Đột biến N152K - 56 IV THẢO LUẬN 58 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 4.1 Kết luận 66 4.2 Kiến nghị - 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) (Congenital Adrenal Hyperplasia – CAH) nhóm bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường đặc trưng thiếu hụt số enzyme cần thiết cho trình tổng hợp hormone vỏ thượng thận Trong đó, thiếu hụt 21-hydroxylase chiếm 90-95%, 11β-hydroxylase chiếm từ 58% trường hợp trẻ đẻ sống gặp trường hợp thiếu hụt 3β-hydroxysteroid dehydrogenase Bệnh TSTTBS bệnh di truyền với dấu hiệu suy thượng thận cấp dẫn đến tử vong thể muối hay trẻ có biểu nam tính hố trẻ gái, giả dậy sớm trẻ trai… gây ảnh hưởng nặng nề đến phát triển chiều cao, chức sinh dục, sinh sản tâm lý Hiện nay, phát triển khoa học kỹ thuật nói chung kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng góp phần quan trọng đưa đến nhiều thành cơng lĩnh vực nghiên cứu bệnh di truyền người Phân tích đột biến gen CYP21A2 mã hóa cho 21hydroxylase đột biến gen CYP11B1 mã hóa 11β-hydroxylase có vai trị quan trọng việc khẳng định chẩn đốn ngun nhân gây bệnh TSTTBS Sự kết hợp chẩn đoán phân tử, lâm sàng hóa sinh giúp cho bác sĩ người tư vấn di truyền có nhìn tồn diện, tổng qt tình trạng bệnh nhân, giúp định hướng cho việc định điều trị liệu pháp hormone thay suốt đời Trong năm gần đây, bệnh viện Việt Nam, số lượng bệnh nhân, đặc biệt bệnh nhi, có tượng TSTTBS ngày xuất nhiều Hiện nay, số bệnh viện sở nghiên cứu nước bắt đầu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát đột biến gen gây bệnh TSTTBS Tuy nhiên, nghiên cứu chủ yếu phát đột biến gen CYP21A2 cách lọc đột biến thường gặp kỹ thuật MLPA Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Xuất phát từ lý đây, luận văn “NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘT BIẾN TRÊN GEN CYP11B1 Ở NGƢỜI BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN BẨM SINH” tiến hành với nội dung: - Xác định đột biến gen CYP11B1 bệnh nhân gia đình bệnh nhân có tượng tăng sản thượng thận bẩm sinh - Xác định mức độ ảnh hưởng đột biến lên hoạt tính enzyme 11β hydroxylase Từ đó, đánh giá mối tương quan kiểu hình kiểu gen đột biến gen CYP11B1 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ I TỔNG QUAN 1.1 Hormone tuyến thƣợng thận 1.1.1 Tuyến thƣợng thận Tuyến thượng thận gồm hai tuyến nhỏ hình tam giác nằm cực hai thận Ở trẻ em, cân nặng trung bình tuyến gram, gồm hai phần: phần vỏ phần tủy, khác bào thai học, sinh hố học chức Phần vỏ có ba vùng: vùng cầu (vùng glomerulosa), vùng bó (vùng fasciculata) vùng lưới (vùng reticularis) (Hình 1.1) Hình 1.1: Vị trí cấu tạo tuyến thƣợng thận [9] Vỏ tuyến thượng thận sản xuất phức hệ nhiều steroid hormone bao gồm glucocorticoid, mineralocorticoid, androgen (hormone sinh dục nam giới) estrogen (hormone sinh dục nữ giới) Tuyến bao bọc xung quanh lõi thượng thận bao gồm nhiều vùng sản xuất steroid khác (Hình 11) Do tổng hợp từ cholesterol, hormone vỏ thượng thận có chất steroid gọi corticosteroid hay corticoid (xuất phát từ chữ cortex nghĩa vỏ) Mặc dù có nguồn gốc chất, thay đổi cấu trúc hoá học gồm thay đổi gốc hoá học vị trí liên kết carbon tạo nên nhóm corticoid có tác dụng sinh học Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ khác Người ta chiết xuất 50 dẫn xuất corticoid chia làm ba nhóm: Hormon chuyển hố muối (mineralocorticoid), tổng hợp vùng cầu Hormon chuyển hoá đường (glucocorticoid), tổng hợp vùng bó Hormon sinh dục nam (androgen), tổng hợp vùng lưới Cortisol thành phần glucocorticoids, tham gia vào q trình chuyển hóa lượng đáp ứng stress thể ợp steroid hormone tuyến thƣợng thận Steroid hormone, có hormone vỏ thượng thận, tổng hợp nhờ tham gia trực tiếp chuỗi enzyme Phản ứng hydroxyl hố giữ vai trị quan trọng tổng hợp cholesterol từ acetate q trình chuyển hố cholesterol thành steroid hormone muối mật Vì vậy, enzyme tham gia tổng hợp hormone vỏ thượng thận enzyme xúc tác q trình hydorxyl hố, gọi chung hydroxylase Trừ enzyme 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD), enzyme tổng hợp corticoid thuộc họ protein cytochrom P-450, viết tắt CYP bao gồm: CYP11A1 (chuỗi cholesterol bị phân cắt làm nhiều mảnh nhỏ, gọi cytochrome P450 P450scc), CYP17 (17α-hydroxylase/ 17,20-lyase or P450c17), CYP21A2 (21-hydroxylase cytochrome P450 P450c21), CYP11B1 (11βhydroxylase P45011β), CYP11B2 (aldosterone synthase P450aldo), CYP19 (aromatase P450aom) [36] (Hình 1.2) Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.2 vỏ [10, 13] , gọi steroid 27-carbon Các mơ tế bào steroidogenic tổng hợp cholesterol phương pháp de novo từ muối acetate, muối axetat làm biến đổi este nội bào cholesterol, nhận lipoprotein từ huyết Trong trình tổng hợp steroid hormone tuyến thượng thận, cholesterol chuyển đổi thành steroid hormone hoàn chỉnh nhờ xúc tác trung gian enzyme cytochrome P450 ty thể lưới nội chất Quá trình tổng hợp bắt đầu xảy ty thể, tiếp tục lưới nội chất, hồn tất ty thể Do đó, dạng tiền chất steroid hormone nằm ty thể ngăn tế bào chất quan trọng trình tổng hợp hormone tuyến thượng thận Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Quá trình tổng hợp steroid hormone bị giới hạn vận chuyển cholesterol từ vào màng ti thể vùng hoạt động CYP11A1 (chuỗi 20, 22hydroxylase cholesterol) Trong trình tổng hợp steroid hormone, cholesterol tập trung lại đưa đến trung tâm hoạt động CYP11A1, nơi trực tiếp liên kết với vùng bên màng ty thể Các protein có nhiệm vụ thực vận chuyển có tên protein điều hịa steroidgenic [66] Các pregnenolone sau từ ty thể đến lưới nội chất để tiếp tục q trình chuyển hóa Mặt khác, pregnenolone cịn chuyển đổi trực tiếp thành progesterone nhờ 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3βHSD) , pregnen 17α-hydropregnenolone nhờ 17α-hydroxylase (CYP17) để sản xuất 17α-hydroxypregnenolone Sau đó, 17α-hydroxypregnenolone 3βHSD biến đổi thành 17α-hydroxyprogesterone steroid C19, dehydroepiandrosterone nhờ xúc tác 17,20 lyase từ CYP17 Bên cạnh đó, dehydroeiandrosterone (DHEA) 3βHSD biến đổi thành androstenedione tham gia vào cấu tạo tiền chất hormone giới tính P - - - 21 để sản xuất 11-deoxycorticosterone 11- deoxycortisol Những sản phẩm CYP21A2 sau đưa trở lại vào ty thể, nơi bước cuối trình tổng hợp steroid hormone lớp vỏ tuyến thận diễn Hai đồng phân CYP11B 11β-hydroxylase/aldosterone synthase (CYP11B2) 11β-hydroxylase (CYP11B1), làm xúc tác cho q trình chuyển hóa deoxycorticosterone 11-deoxycortisol lần l , vùng cầu, sản xuất mineralocorticoid aldosterone bền vững từ deoxycorticosteone nhờ xúc tác CYP11B2 Một khác biệt enzyme vùng cầu vùng bó vắng mặt CYP17 vùng cầu cầu có xu hướng biểu CYP11B2 Tại vùng lưới, androstenedione chuyển đổi thành testosterone esterone/estradiol nhờ 17β-ketosteroid reductase (17βHSD) 19-hydroxylase Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ bệnh nhân có hàm lượng 17OHP tăng Đây biểu điển hình bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh Tuy nhiên, biểu thường không phân biệt rõ ràng hai nguyên nhân gây bệnh suy giảm 21 hydroxylase 11β hydroxylase TSTTBS chủ yếu nguyên nhân thiếu hụt 21-hydroxylase (chiếm 90%) đó, thể khơng cổ điển có tần suất cao so với thể cổ điển Trong thể này, nồng độ enzyme 21-OH giảm nhẹ Bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng giả dậy sớm trẻ gái, hội chứng rậm lông, buồng trứng đa nang giảm khả thụ tinh, khơng có triệu chứng gây dấu hiệu dư thừa nội tiết tố androgen thời thơ ấu tuổi dậy [39] Thiếu 11β-hydroxylase khơng cổ điển gây triệu chứng lâm sàng tương tự thấy tình trạng thiếu 21hydroxylase khơng cổ điển khác chất trung gian dư thừa có tượng tăng huyết áp nhẹ [39] Trong nghiên cứu, hoạt tính enzyme 11β hydroxylase 5% coi nghiêm trọng liên quan đến TSTTBS thể cổ điển 11OHD [51] Đột biến gen CYP11B1 nguyên nhân gây nên thiếu hụt hoạt động 11-hydroxylase Đột biến gen CYP11B1 448 dẫn đến thay axit amin Arg thành His vị trí 448 chuỗi protein [62] Cho đến có 60 đột biến gen CYP11B1 thống kê Human Gen Mutation Database [7] (Hình 1.7) Một vài đột biến điểm tìm thấy bệnh nhân mắc bệnh CAH gây rối loạn chức 11β-hydroxylase biểu đột biến nuôi cấy tế bào (bảng 1.1) Từ đầu năm 2013 đến nay, có đột biến công bố xác định ảnh hưởng đột biến đến hoạt tính enzyme [7, 18, 67] Để phân tích mức độ ảnh hưởng đột biến, phương pháp dùng khác phổ biến tạo đột biến điểm trực tiếp biểu tế bào động vật Có nhiều dịng tế bào động vật sử dụng COS-1, COS -7, JEG-3, HCT116 Sự biểu đồng thời với vector biểu chứng minh có ích việc tăng hoạt tính CYP11B1 CYP11B2 hệ biểu tế bào động vật Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Sự biểu CYP11B1 wild-type đột biến tế bào động vật xác định lại phân tích Western blot Đây kỹ thuật lai protein với protein (giữa kháng nguyên kháng thể), protein kháng nguyên phát qua phản ứng tạo màu phát huỳnh quang Hiện nay, nhiều đột biến gen CYP11B1 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh phân tích hoạt tính phương pháp Đột biến A368D làm giảm 1,17% hoạt tính 11-deoxycortisol [41], đột biến p.R43Q làm hoạt tính 11-hydroxylase giảm từ 30-50% [25], đột biến L22P giảm 1,6% hoat tính enzyme [20]… Các đột biến xảy bệnh nhân suy giảm 11β-hydroxylase thường dạng thay amino acid (missense mutation) Các đột biến dẫn đến thay đổi chức enzyme Nghiên cứu chức đột biến kiểm tra tế bào động vật Curnow cộng phát đột biến T318M, R374Q, R384Q V441G exon 5, 6, 8, đột biến làm thay đổi hoạt tính enzyme CYP11B1 [30] Sau đó, đột biến p.V129V, p.A331V, p.E371G p.R448C phát Geley cộng đột biến làm hồn tồn hoạt tính enzyme 11β-hydroxylase[52] Những đột biến p.P42S, p.N133H p.T319M gây suy giảm phần hoạt tính 11β-hydroxylase [39] Những nghiên cứu gần Krone tìm đột biến p.W116C, p.L129P, p.DeltaF438, p.P94L p.A368D bệnh nhân thiếu hụt phần 11β-hydroxylase[42] - Bên cạnh đó, suy giảm hoạt tính enzyme phân tích nhờ phương pháp tạo đột biến trực tiếp gen mơ hình hóa phân tử mang đến nhìn đầy giá trị mối quan hệ cấu trúc chức cytochrome P450 Các đột biến xuất toàn exon thường gặp exon 2, 6, exon Điều amino acid quan trọng vùng amino acid mã hóa quan trọng enzyme [30, 33] Đến phát đột biến Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ exon p.R43Q[25], p.R33GfsX18 [30], p.P42S [39], p.Q19X[44] Các đột biến nằm đầu N phần đầu protein CYP11B1, nên gây nên ảnh hưởng định đến biểu mức độ biểu enzyme 11β-hydroxylase như: Đột biến p.R43Q làm giảm hoạt tính 11OH từ 30-50% [25], đột biến p.P42S làm giảm 15% hoạt tính enzyme [39] Trong luận văn này, chúng tơi báo cáo đột biến hoàn toàn p.R51K vùng exon nơi xảy đột biến Ở bệnh nhân mang đột biến p.R51K này, biểu bệnh TSTTBS điển hình Bệnh nhân có kiểu gen 46 XX, kiểu hình nữ, phận sinh dục không rõ ràng, gây tượng mơ hồ giới tính lúc sinh, lớn trước tuổi Ngồi ra, xét nghiệm hóa sinh cho thấy hàm lượng hai loại steroid hormone đại diện cho hormone nam giới testostrone 17-OHP tăng cao Những biểu bệnh phù hợp với kết xác định mức độ ảnh hưởng đột biến tế bào động vật Đột biến p.R51K làm giảm gần 70% hoạt tính 11βhydroxylase Acid amin vị trí 147 acid amin khác quan trọng CYP11B1 CYP11B2 Nghiên cứu Angela Fisher cộng năm 2000, đánh giá tầm quan trọng acid amin vị trí chức aldosterone synthase 11betahydroxylase Bằng cách thay acid amin aspartate D147 protein CYP11B2 thành E147 CYP11B1 Kết cho thấy, CYP11B2-D147E gây gia tăng đáng kể sản xuất corticosterone gia tăng nhỏ sản xuất aldosterone từ 11-deoxycorticosterone (DOC) khơng có ảnh hưởng việc chuyển đổi 11deoxycortisol để cortisol Tuy nhiên cấu trúc đảo ngược (CYP11B1-E147D), thay dư lượng 11β-hydroxylase với aldosterone synthase tương đương, giảm việc chuyển đổi DOC thành corticosterone, không ảnh hưởng đến việc chuyển đổi 11-deoxycortisol để cortisol [12] Nghiên cứu đánh giá mức độ biểu enzyme tế bào động vật lại cho kết hoàn toàn khác Đột biến p.E147D làm giảm tới 50% hoạt tính enzyme 11OH Sự khác hệ biểu nghiên cứu khác pb-Adx pCD-Adx Theo nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Nguyễn Huy Hoàng cộng năm 2008, biểu gen CYP11B2 tế bào HCT với chất B, 18 OHB, Aldo với vector biểu phAdx pbAdx thu kết khác Mức độ biểu vector pbAdx cao hẳn so với vector phAdx biểu đồng thời với pbAdx chứng minh có ích việc tăng hoạt tính CYP11B1 CYP11B2 hệ biểu tế bào động vật COS-1 [20] Ngoài ra, pbAdx vector hiểu tế bào động vật sử dụng phổ biến năm gần Vì thế, hệ vector có nhiều ưu điểm hơn, tiên tiến hơn, xác so với pCD Adx Kết phù hợp với nghiên cứu Mathias Hampf cộng năm 2001 nghiên cứu hai đột biến p.E147D p.N152K Trong nghiên cứu đó, đột biến tìm thấy bệnh nhân nam người Việt Nam Đột biến hình thành trao đổi chéo gen CYP11B1 CYP11B2 Một alen hình thành trao đổi chéo không tương đồng, tạo gen bao gồm promoter exon đến exon CYP11B2 intron đến exon CYP11B1 Alen thứ hai bao gồm đột biến intron dẫn đến sai khác trình phiên mã mARN [15] Ở trường hợp này, promoter CYP11B1 kích hoạt zona reticularis bị thay promoter CYP11B2 lại biểu chủ yếu zona glomerulosa, thiếu biểu 17-hydroxylase – enzyme tham gia vào bước đầu trình tổng hợp cortisol Vì thế, lượng tổng hợp cortisol bị suy giảm Tuy nhiên, nghiên cứu chưa đánh giá cụ thể mức độ ảnh hưởng đột biến p.E147D p.N152K đến mức độ biểu enzyme 11β-hydroxylase Hai đột biến nằm exon 3, nơi xảy nhiều đột biến Tính đến có 10 đột biến phát exon Trong đó, có đột biến nghiêm trọng, làm giảm 30 – 50% hoạt tính enzyme 11OH đột biến p.F319L, p.P159L, p.T196A Các đột biến nằm vùng xoắn C helix (p.F319L), D helix (p.P159L) E helix (p.T196A) protein CYP11B1 [51] Đột biến p.E147D nằm vùng C’helix, làm liên kết hydro: liên kết hydro Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Aspartic Arginine vị trí acid amin thứ 454, liên kết hydro Aspartic Arginine vị trí acid amin 143 (Hình 3.15) Đột biến p.N152K không nằm vùng cấu trúc quan trọng lại làm thay đổi tính chất acid amin Mặt khác, đột biến tìm thấy bệnh nhân, thế, mức độ ảnh hưởng đột biến đến biểu bệnh sinh lớn Ngoài dạng đột biến thay amino acid có đột biến khác phát đột biến không mang nghĩa đột biến chuyển khung đọc amino acid, đột biến làm giảm hoạt tính enzyme [43] Ví dụ: đột biến vô nghĩa p.W247X phát dân tộc Áo đột biến vô nghĩa tìm thấy [33] Một bệnh nhân người Mỹ gốc Phi phát mang đột biến dị hợp tử codon thay 318+1G  356X exon [44] Đến có gần 10 đột biến trượt gen CYP11B1 công bố [51] Thể đột biến vô nghĩa (nonsense mutation), xuất rải rác từ exon đến exon [51] Việc dừng phiên mã sớm dẫn đến tượng protein bị cắt ngắn, gây nhiều ảnh hưởng đến chức protein Đã có nhiều đột biến nonsense cơng bố, làm giảm hoạt tính enzyme 11β-hydroxylase, đặc biệt, đột biến p.W116X xảy exon làm hồn tồn hoạt tính enzyme [46] Một số đột biến nonsense phát bệnh nhân TSTTBS đột biến gen CYP11B1, chưa chứng minh mức độ protein [51] Trong khóa luận này, đột biến nonsense p.Y395X phát bệnh nhân nam, người Việt Nam, chẩn đoán bị bệnh TSTTBS thiếu hụt 11β - hydroxylase Đột biến xảy exon 7, làm xuất kết thúc dịch mã sớm, làm đứt mối liên kết với nhân Heme [30], có khả ảnh hưởng nhiều đến mức độ biểu protein CYP11B1 Điều giải thích mức độ biểu lâm sàng bệnh nhân Bệnh nhân có biểu tăng huyết áp, biểu thiếu hụt enzyme 21 hydroxylase thiếu hụt 11β Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ hydroxylase thiếu hụt deoxycorticosterone – hormone giữ muối Tuy nhiên, bệnh nhân bị thiếu enzyme 21 hydroxylase kèm tượng thiếu hụt cortisol aldosterone tượng muối điển hình bao gồm giảm Na+ K+ tăng Đối với bệnh nhân này, xét nghiệm hóa sinh cho kết K+ giảm, khơng có tượng tăng Na+ nên chẩn đoán bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thiếu hụt 11β hydroxylase Thêm vào đó, hiệu chuyển hóa 11 – deoxycortisol 11 deoxycorticosterone bị giảm Hàm lượng cortisone giảm nguyên nhân làm tăng ACTH, dư thừa tiền chất trung gian aldrogens Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã thu thập, tách chiết DNA máu khuếch đại thành công gen CYP11B1 bệnh nhân bị chẩn đoán TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase - đột biến p.R51K, p.E147D, p.N152K p.Y395X phát phân tích trình tự gen CYP11B1 bệnh nhân Trong đó, p.R51K p.Y395X hai đột biến hồn tồn mới, nhóm nghiên cứu công bố năm 2012 - Đã xác định mức độ biểu hoạt tính enzyme 11β-hydroxylase đột biến p.R51K, p.E147D, p.N152K gây nên Cả đột biến có ảnh hưởng đáng kể tới mức độ biểu enyme Trong đó, đột biến p.R51K làm giảm hoạt tính 11-OH xuống cịn khoảng 29% so với đối chứng Đột biến p.E147D giảm 48%, p.N152K giảm 36% so với thể hoang dại - Phân tích cấu trúc 3D đột biến p.R51K, p.E147D, p.N152K cho thấy, đột biến làm ảnh hưởng đến liên kết hydro với acid amin bên cạnh Các kết nghiên cứu cho thấy mức độ tương quan định kiểu gen biểu kiểu hình người bệnh giúp bác sỹ đưa lời khuyên di truyền hướng điều trị 4.2 Kiến nghị Mở rộng nghiên cứu tồn quốc để thấy tranh tổng thể bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh đột biến gen CYP11B1 gây nên Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Viêt: Bùi Phương Thảo, Nguyễn Thị Hồn, Vũ Chí Dũng, Trạng Lữ Văn (2003), "Đặc điểm thể lâm sàng bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh 10 năm 1992-2001 Bệnh viện Nhi Trung ương", Tạp chí Y học Thực hành, 462, pp 130-133 Nguyễn Huy Hoàng, Bernhardt Rita (2012), "Đánh giá biểu CYP11Bs dòng tế bào HCT116", Tạp chí sinh học, 34(3s), pp 326-330 Nguyễn Thị Hồn, Dũng Vũ Chí (2003), "U vỏ thượng thận nam hóa bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21-hydroxylase", Tạp chí Y học Thực hành, 462, pp 155-159 Nguyễn Thu Nhạn, Cao Quốc Việt, Nguyễn Xuân Thụ, Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thanh Liêm, Bùi Mạnh Tuấn, Dũng Vũ Chí (2000), "U vỏ thượng thận trẻ em: Báo cáo 13 trường hợp năm (7/1992 – 7/2000) Viện Nhi khoa", Nhi khoa, Kỷ yếu Cơng trình nghiên cứu khoa học năm 2000, Hội nghị Nhi khoa Toàn quốc lần thứ 17 6-8/11/2000, pp 294-302 Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng, Thảo Bùi Phương (2005), "Đặc điểm lâm sàng xét nghiệm bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh trẻ gái.", Tạp chí Nghiên cứu Y học, 35(2), pp 99-104 Vũ Chí Dũng, Warne G.L (2004), "Tăng sản thượng thận bẩm sinh: cập nhật sinh học phân tử, chẩn đốn điều trị trước sinh", Tạp chí Y học Thực hành, 495, pp 245252 Tài liệu tiếng Anh Abbaszadegan M.R., Hassani S., Vakili R., Saberi M.R., Baradaran-Heravi A., A'rabi A., Hashemipour M., Razzaghi-Azar M., Moaven O., Baratian A., Ahadian M., Keify F., Meurice N (2013), "Two novel mutations in CYP11B1 and modeling the Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ consequent alterations of the translated protein in classic congenital adrenal hyperplasia patients.", Endocrine, 44(1), pp 212-9 Amin H.K., Hoeppner W., Shaarawy M., Barakat M (2002), "Congental adrenal Hyperplasia", Hum Gent, 110, pp 295 Asif A.R (2004), "Role of transport systems in cortisol release from human adrenal cells", The University of Gottingen, pp 10 Belkina N.V., Lisurek M., Ivanov A.S., Bernhardt R (2001), "Modelling of threedimensional structures of cytochromes P450 11B1 and 11B2.", J Inorg Biochem, 87(4), pp 197-207 11 Danielson P.B (2007), "The cytochrome P450 superfamily: biochemistry, evolution and drug metabolism in humans", Curr Drug Metab., 3(6), pp 561-97 12 Fisher A., Fraser R., Mc Connell J., Davies E (2000), "Amino acid residue 147 of human aldosterone synthase and 11beta-hydroxylase plays a key role in 11betahydroxylation.", J Clin Endocrinol Metab, 85(3), pp 1261-6 13 Frank Z., Stanczy K (2009), "Production, Clearance, and Measurement of Steroid Hormones", The Global Library of Women’s Medicine, 5(1), pp 14 Guengerich F.P (2008), "Cytochrome p450 and chemical toxicology", Chem Res Toxicol., 21(1), pp 70-83 15 Hampf M., Dao N.T., Hoan N.T., Bernhardt R (2001), "Unequal Crossing-Over between Aldosterone Synthase and 11β-Hydroxylase Gens Causes Congenital Adrenal Hyperplasia", J Clin Endocrinol Metab, 86(9), pp 4445-52 16 Hanukoglu I (1996), "Electron Transfer Proteins of Cytochrome P450 Systems", Advances in Molecular and Cell Biology, 14, pp 29-56 17 http://ghr.nlm.nih.gov/gen 18 Menabò S., Polat S., Baldazzi L., Kulle A.E., Holterhus P.M., Grötzinger J., Fanelli F., Balsamo A., Riepe F.G (2013), "Congenital adrenal hyperplasia due to 11-betahydroxylase deficiency: functional consequences of four CYP11B1 mutations.", Eur J Hum Gent., Epub ahead of print, pp Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 19 Merke D.P., Bornstein S.R (2005), "Congenital adrenal hyperplasia", The Lancet, 365(9477), pp 2125 - 2136 20 Nguyen H.H., Hannemann F., Hartmann M.F., Wudy S.A., Bernhardt R (2008), "Aldosterone synthase deficiency caused by a homozygous L451F mutation in the CYP11B2 gen", Mol Gent Metab, 93.(4), pp 458-67 21 Reisch N., Högler W., Parajes S., Rose I.T., Dhir V., Götzinger J., Arlt W., Krone N (2013), "A diagnosis not to be missed: Non-classic steroid 11β-hydroxylase deficiency presenting with premature adrenarche and hirsutism", J Clin Endocrinol Metab, Epub ahead of print, pp 22 Sigel A., Sigel H., Sigel R.K.O (2007), "The Ubiquitous Roles of Cytochrome P450 Proteins: Metal Ions in Life Sciences", New York: Wiley, pp 678 23 Speiser P.W., M.D., White P.C (2003), "Congenital Adrenal Hyperplasia", N Engl J Med, 349, pp 776-788 24 Wilson J.A., Foster D.W (1992), "Williams Textbook of Endocrinology", The Adrenal Cortex, 8, pp 489-619 25 Barr M., MacKenzie S.M., Wilkinson D.M., Holloway C.D., Friel E.C., Miller S., MacDonald T., Fraser R., Connell J.M., Davies E (2006), "Functional effects of gentic variants in the 11beta-hydroxylase (CYP11B1) gen", Clin Endocrinol (Oxf), 65(6), pp 816-25 26 Bernhardt R (2006), "Cytochromes P450 as versatile biocatalysts", J Biotechnol, 124(1), pp 128-45 27 Bernhardt R (1996), "Cytochrome P450: structure, function, and genration of reactive oxygen species", Rev Physiol Biochem Pharmacol, 127, pp 137-221 28 Bureik M., Lisurek M., Bernhardt R (2002), "The human steroid hydroxylases CYP1B1 and CYP11B2", Biol Chem, 383(10), pp 1537-51 29 Cupp V.J.R., Poulos T L (1995), "Structure of cytochrome P450eryF involved in erythromycin biosynthesis", Nat Struct Biol, 2(2), pp 144-53 30 Curnow K.M., Slutsker L., Vitek J., Cole T., Speiser P.W., New M.I., White P.C., Pascoe L (1993), "Mutations in the CYP11B1 gen causing congenital adrenal Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ hyperplasia and hypertension cluster in exons 6, 7, and 8", Proc Natl Acad Sci U S A, 90(10), pp 4552-6 31 Curnow K.M., Tusie-Luna M.T., Pascoe L., Natarajan R., Gu J.L., Nadler J.L., White P.C (1991), "The product of the CYP11B2 gen is required for aldosterone biosynthesis in the human adrenal cortex", Mol Endocrinol, 5(10), pp 1513-22 32 Denner K., Rainey W.E., Pezzi V., Bird I.M., Bernhardt R., Mathis J.M (1996), "Differential regulation of 11 beta-hydroxylase and aldosterone synthase in human adrenocortical H295R cells", Mol Cell Endocrinol, 121(1), pp 87-91 33 Geley S., Kapelari K., Johrer K., Peter M., Glatzl J., Vierhapper H., Schwarz S., Helmberg A., Sippell W.G., White P.C., Kofler R (1996), "CYP11B1 mutations causing congenital adrenal hyperplasia due to 11 beta-hydroxylase deficiency", J Clin Endocrinol Metab, 81(8), pp 2896-901 34 Gotoh O (1992), "Substrate recognition sites in cytochrome P450 family (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences", J Biol Chem, 267(1), pp 83-90 35 Hague W.M., Honour J.W (1983), "Malignant hypertension in congenital adrenal hyperplasia due to 11 beta-hydroxylase deficiency", Clin Endocrinol (Oxf), 18(5), pp 505-10 36 Hakki T., Bernhardt R (2006), "CYP17- and CYP11B-dependent steroid hydroxylases as drug development targets", Pharmacol Ther, 111(1), pp 27-52 37 Hannemann F., Bichet A., Ewen K.M., Bernhardt R (2007), "Cytochrome P450 systems biological variations of electron transport chains", Biochim Biophys Acta, 1770(3), pp 330-44 38 Hasemann C.A., Ravichandran K.G., Peterson J.A., Deisenhofer J (1994), "Crystal structure and refinement of cytochrome P450terp at 2.3 A resolution", J Mol Biol, 236(4), pp 1169-85 39 Joehrer K., Geley S., Strasser-Wozak E.M., Azziz R., Wollmann H.A., Schmitt K., Kofler R., White P.C (1997), "CYP11B1 mutations causing non-classic adrenal Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ hyperplasia due to 11 beta-hydroxylase deficiency", Hum Mol Gent, 6(11), pp 182934 40 Kroboth P.D., Salek F.S., Pittenger A.L., Fabian T.J., Frye R.F (1999), "DHEA and DHEA-S: a review", J Clin Pharmacol, 39(4), pp 327-48 41 Krone N., Grischuk Y., Muller M., Volk R.E., Grotzinger J., Holterhus P.M., Sippell W.G., Riepe F.G (2006), "Analyzing the functional and structural consequences of two point mutations (P94L and A368D) in the CYP11B1 gen causing congenital adrenal hyperplasia resulting from 11-hydroxylase deficiency", J Clin Endocrinol Metab, 91(7), pp 2682-8 42 Krone N., Grotzinger J., Holterhus P.M., Sippell W.G., Schwarz H.P., Riepe F.G (2009), "Congenital adrenal hyperplasia due to 11-hydroxylase deficiency insights from two novel CYP11B1 mutations (p.M92X, p.R453Q)", Horm Res, 72(5), pp 2816 43 Krone N., Riepe F.G., Gotze D., Korsch E., Rister M., Commentz J., Partsch C.J., Grotzinger J., Peter M., Sippell W.G (2005), "Congenital adrenal hyperplasia due to 11-hydroxylase deficiency: functional characterization of two novel point mutations and a three-base pair deletion in the CYP11B1 gen", J Clin Endocrinol Metab, 90(6), pp 3724-30 44 Merke D.P., Tajima T., Chhabra A., Barnes K., Mancilla E., Baron J., Cutler G.B (1998), "Novel CYP11B1 mutations in congenital adrenal hyperplasia due to steroid 11 beta-hydroxylase deficiency", J Clin Endocrinol Metab, 83(1), pp 270-3 45 Mestres J (2005), "Structure conservation in cytochromes P450", Proteins, 58(3), pp 596-609 46 Naiki Y., Kawamoto T., Mitsuuchi Y., Miyahara K., Toda K., Orii T., Imura H., Shizuta Y (1993), "A nonsense mutation (TGG [Trp116] >TAG [Stop]) in CYP11B1 causes steroid 11 beta-hydroxylase deficiency", J Clin Endocrinol Metab, 77(6), pp 1677-82 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 Nakahara K., Shoun H., Adachi S., Iizuka T., Shiro Y (1994), "Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of nitric oxide reductase cytochrome P450nor from Fusarium oxysporum", J Mol Biol, 239(1), pp 158-9 48 Nebert D.W., Nelson D.R (1991), "P450 gen nomenclature based on evolution", Methods Enzymol, 206, pp 3-11 49 Nelson D.R (2009), "The cytochrome p450 homepage", Hum Genomics, 4(1), pp 5965 50 Ogishima T., Shibata H., Shimada H., Mitani F., Suzuki H., Saruta T., Ishimura Y (1991), "Aldosterone synthase cytochrome P-450 expressed in the adrenals of patients with primary aldosteronism", J Biol Chem, 266(17), pp 10731-4 51 Parajes S., Loidi L., Reisch N., Dhir V., Rose I.T., Hampel R., Quinkler M., Conway G.S., Castro-Feijoo L., Araujo-Vilar D., Pombo M., Dominguez F., Williams L.E., Cole T.R., Kirk J.M., Kaminsky E., Rumsby G., Arlt W., Krone N (2010), "Functional consequences of seven novel mutations in the CYP11B1 gen: four mutations associated with nonclassic and three mutations causing classic 11{beta}-hydroxylase deficiency", J Clin Endocrinol Metab, 95(2), pp 779-88 52 Peter M., Dubuis J.M., Sippell W.G (1999), "Disorders of the aldosterone synthase and steroid 11beta-hydroxylase deficiencies", Horm Res, 51(5), pp 211-22 53 Peterson J.A, Graham S.E (1998), "A close family resemblance: the importance of structure in understanding cytochromes P450", Structure, 6(9), pp 1079-85 54 Poulos T.L., Howard A.J (1987), "Crystal structures of metyrapone- and phenylimidazole-inhibited complexes of cytochrome P-450cam", Biochemistry, 26(25), pp 8165-74 55 Ravichandran K.G., Boddupalli S.S., Hasermann C.A., Peterson J.A., Deisenhofer J (1993), "Crystal structure of hemoprotein domain of P450BM-3, a prototype for microsomal P450's", Science, 261(5122), pp 731-6 56 Rosler A., Leiberman E., Cohen T (1992), "High frequency of congenital adrenal hyperplasia (classic 11 beta-hydroxylase deficiency) among Jews from Morocco", Am J Med Gent, 42(6), pp 827-34 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 57 Roumen L., Sanders M.P., Pieterse K., Hilbers P.A., Plate R., Custers E., de Gooyer M., Smits J.F., Beugels I., Emmen J., Ottenheijm H.C., Leysen D., Hermans J (2007), "Construction of 3D models of the CYP11B family as a tool to predict ligand binding characteristics", J Comput Aided Mol Des, 21(8), pp 455-71 58 Stocco D.M., Clark B.J (1996), "Role of the steroidogenic acute regulatory protein (StAR) in steroidogensis", Biochem Pharmacol, 51(3), pp 197-205 59 Ulmschneider S., Muller-Vieira U., Mitrenga M., Hartmann R.W., OberwinklerMarchais S., Klein C.D., Bureik M., Bernhardt R., Antes I., Lengauer T (2005), "Synthesis and evaluation of imidazolylmethylenetetrahydronaphthalenes and imidazolylmethyleneindanes: potent inhibitors of aldosterone synthase", J Med Chem, 48(6), pp 1796-805 60 Waterman M.R., Bischof L.J (1997), "Cytochromes P450 12: diversity of ACTH (cAMP)-dependent transcription of bovine steroid hydroxylase gens", FASEB J, 11(6), pp 419-27 61 Wester M.R, Johnson E.F, Marques-Soares C, Dijols S, Dansette P M, Mansuy D, Stout C.D (2003), "Structure of mammalian cytochrome P450 2C5 complexed with diclofenac at 2.1 A resolution: evidence for an induced fit model of substrate binding", Biochemistry, 42(31), pp 9335-45 62 White P.C, Dupont J., New M.I., Leiberman E., Hochberg Z., Rosler A (1991), "A mutation in CYP11B1 (Arg-448 His) associated with steroid 11 beta-hydroxylase deficiency in Jews of Moroccan origin", J Clin Invest, 87(5), pp 1664-7 63 White P.C, Mornet E, Dupont J, Vitek A (1989), "Characterization of two gens encoding human steroid 11 beta-hydroxylase (P-450(11) beta)", J Biol Chem, 264(35), pp 20961-7 64 Yang L X., Toda K., Miyahara K., Nomoto S., Kinoshita E., Baba T., Yoshimoto M., Araki K., Kurashige T., Hashimoto K (1995), "Classic steroid 11 beta-hydroxylase deficiency caused by a C >G transversion in exon of CYP11B1", Biochem Biophys Res Commun, 216(2), pp 723-8 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 65 Zachmann M., Tassinari D., Prader A (1983), "Clinical and biochemical variability of congenital adrenal hyperplasia due to 11 beta-hydroxylase deficiency A study of 25 patients", J Clin Endocrinol Metab, 56(2), pp 222-9 66 Zenkert S., Schubert B., Fassnacht M., Beuschlein F., Allolio B., Reincke M (2000), "Steroidogenic acute regulatory protein mRNA expression in adrenal tumours", Eur J Endocrinol, 142(3), pp 294-9 67 Zhang M., Liu Y., Sun S., Zhang H., Wang W., Ning G., Li X (2013), "A prevalent and three novel mutations in CYP11B1 gen identified in Chinese patients with 11-beta hydroxylase deficiency", J Steroid Biochem Mol Biol, 133, pp 25-9 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... “NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘT BIẾN TRÊN GEN CYP11B1 Ở NGƢỜI BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN BẨM SINH? ?? tiến hành với nội dung: - Xác định đột biến gen CYP11B1 bệnh nhân gia đình bệnh nhân có tượng tăng. .. trình tự gen 3.4.2.3 Biểu đột biến tế bào động vật Vấn đề đặt liệu đột biến có ảnh hưởng đến biểu lâm sàng hóa sinh người bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh? Để trả lời câu hỏi này, đột biến p.R51K... 1.4.3 Tăng sản thượng thận bẩm sinh nguyên nhân khác 16 1.5 C 18 1.5.1 Chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh 18 1.5.2 Điều trị bệnh tăng sản thượng thận