Kết cấu Luận văn này gồm 7 chương. Chương 1 – phần mở đầu, nêu lí do thực hiện luận án, các mục tiêu cần đạt được và các nội dung chính trong luận án; Chương 2 - giới thiệu về AD, các giả thuyết gây nên AD, nguồn gốc và cấu trúc của peptide Aβ, các nghiên cứu về ảnh hưởng của đột biến lên peptide Aβ và AD; Chương 3 - trình bày cơ sở lý thuyết và các phương pháp giải quyết vấn đề; Chương 4 - là kết quả nghiên cứu về hành xử tích tụ của ba chuỗi Aβ40, Aβ41 và Aβ42. Từ đó so sánh mức độ ảnh hưởng của hai axít amin I41 và A42 lên độc tính của peptide Aβ; Chương 5 - là các nghiên cứu về đột biến ba điểm VPV, VNL tại đầu C được khảo sát trên Aβ40 và Aβ42. Tính toán mô phỏng được thực hiện trên cả 2 cấu trúc có đầy đủ độ dài và trên các đoạn ngắn Aβ31-40, Aβ31-42; Chương 6 - khảo sát cấu trúc mô típ Glycine tại các vị trí G25, G29, G33, G37 thông qua đột biến G37V. Cấu trúc phân tử và hình thái tích tụ của đột biến G37V được khảo sát để cung cấp nguyên nhân thay đổi độc tố khi phá vỡ cấu trúc mô típ Glycine; Chương 7 - cung cấp chi tiết ảnh hưởng của thành phần β trong trạng thái monomer lên vận tốc tạo sợi của Aβ42. Mời các bạn cùng tham khảo!
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN THỊ MINH THƯ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘT BIẾN LÊN CẤU TRÚC VÀ ĐỘNG HỌC CỦA CHUỖI PEPTIDE AMYLOID BETA: HƯỚNG ĐẾN ỨC CHẾ BỆNH ALZHEIMER Chuyên ngành: VẬT LÝ KỸ THUẬT Y SINH Mã số chuyên ngành: 62520401 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 Cơng trình hoàn thành Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM Người hướng dẫn 1: GS TSKH Mai Xuân Lý Người hướng dẫn 2: TS Lý Anh Tú Phản biện độc lập 1: Phản biện độc lập 2: Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án họp vào lúc ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM - Thư viện Đại học Quốc gia Tp.HCM - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM CHƯƠNG 1.1 MỞ ĐẦU Lí thực luận án Theo kết khảo sát tổ chức nghiên cứu Quốc tế bệnh Alzheimer (AD), giới có khoảng 50 triệu người mắc chứng sa sút trí tuệ số lên đến 250 triệu người vào năm 2050 Các liệu pháp điều trị chữa dứt điểm bệnh bỏ ngỏ chưa rõ ngun nhân xác, có ba giải thuyết gây nên AD Cholinergic, protein tau amyloid beta Trong đó, minh chứng gen cho thấy tích tụ amyloid nguyên nhân AD Nghiên cứu khởi đầu đột biến gen sinh tiền tố APP đột biến Dutch (E22Q) cho nguyên nhân gây bệnh xuất huyết não có tính di truyền Từ phát này, nghiên cứu chuyên sâu cho thấy đột biến APP tạo nên mảng Aβ khơng hòa tan Các trường hợp mắc bệnh AD sớm chủ yếu di truyền chiếm 5% tổng số ca bệnh Nghiên cứu cấu trúc động học Aβ ảnh hưởng đột biến hướng đến giải pháp ngăn chặn trình hình thành mảng bám amyloid ngoại bào nhằm ức chế AD lí chúng tơi thực luận án 1.2 Mục tiêu luận án - Mặc dù khác biệt hai acid amin cuối I41, A42 lượng peptide Aβ40 cao nhiều lần Aβ42 tạo sợi nhanh có nhiều độc tố so với Aβ40 Việc khảo sát vai trò I41 A42 ảnh hưởng đến khác biệt động học tích tụ độc tố Aβ40 Aβ42 cần thiết - Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy đột biến ba điểm G33V-V36P-G38V (VPV) làm Aβ42 trở thành “siêu Aβ42” với gia tăng vận tốc tạo sợi độc tính đột biến VPV tác động lên Aβ40 làm peptide có lộ trình oligomer tương tự với Aβ42 Những khác biệt giải thích gia tăng cấu trúc β turn β hairpin Tuy vậy, nghiên cứu thực đoạn Aβ31-40, Aβ31-42 Để kiểm chứng, tiến hành mô đột biến Aβ40-VPV Aβ42-VPV với đầy đủ độ dài Đột biến VNL thực vị trí để củng cố thêm giả thuyết - Cấu trúc mơ típ Glycine G25G29G33G37 có vai trị quan trọng việc hình thành mảng gây độc cho nơ ron thần kinh Phá vỡ cấu trúc thông qua việc thay Glycine Valine acid amin 37 có ý nghĩa quan trọng việc khảo sát thay đổi hành vi tạo sợi độc tố Aβ42 - Cấu trúc β cho thành phần yếu sợi amyloid, điều chưa kiểm chứng với tập liệu đủ lớn Nếu kết luận tập liệu đủ lớn xây dựng đường chuẩn để khảo sát vận tốc tạo sợi dựa thành phần phiến β - tính tốn mơ 1.3 Các nội dung luận án Từ mục tiêu cụ thể, luận án có nội dung sau: Chương – phần mở đầu, nêu lí thực luận án, mục tiêu cần đạt nội dung luận án Chương giới thiệu AD, giả thuyết gây nên AD, nguồn gốc cấu trúc peptide Aβ, nghiên cứu ảnh hưởng đột biến lên peptide Aβ AD Chương trình bày sở lý thuyết phương pháp giải vấn đề Chương kết nghiên cứu hành xử tích tụ ba chuỗi Aβ40, Aβ41 Aβ42 Từ so sánh mức độ ảnh hưởng hai axít amin I41 A42 lên độc tính peptide Aβ Chương nghiên cứu đột biến ba điểm VPV, VNL đầu C khảo sát Aβ40 Aβ42 Tính tốn mơ thực cấu trúc có đầy đủ độ dài đoạn ngắn Aβ31-40, Aβ31-42 Chương khảo sát cấu trúc mơ típ Glycine vị trí G25, G29, G33, G37 thơng qua đột biến G37V Cấu trúc phân tử hình thái tích tụ đột biến G37V khảo sát để cung cấp nguyên nhân thay đổi độc tố phá vỡ cấu trúc mơ típ Glycine Chương cung cấp chi tiết ảnh hưởng thành phần β trạng thái monomer lên vận tốc tạo sợi Aβ42 Phần kết luận bao gồm kết chính, đóng góp khoa học hướng phát triển luận án CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ BỆNH ALZHEIMER VÀ PEPTIDE AMYLOID BETA 2.1 Cấu trúc protein Protein đại phân tử sinh học tạo thành từ axít amin (aa) thông qua liên kết peptide hai aa Trình tự aa chuỗi peptide mạch thẳng khơng phân nhánh cấu trúc bậc protein Cấu trúc bậc hai dạng cấu trúc cục phần chuỗi peptide Cấu trúc bậc hai gồm hai dạng chính: xoắn α, phiến β Cấu trúc bậc ba cấu trúc ba chiều thu gọn protein nhờ mà ổn định mơi trường tế bào Một số cấu trúc bậc ba protein kết hợp lại với tạo thành cấu trúc bậc bốn Protein có hai loại: protein có cấu trúc trật tự protein có cấu trúc trật tự 2.2 Bệnh Alzheimer giả thuyết gây bệnh Hình 2.3 Não người bình thường (A,B) não bệnh nhân Alzheimer (C,D) Hình 2.7 Lộ trình gây bệnh AD theo giả thuyết amyloid AD chứng bệnh suy giảm não nguyên nhân gây sa sút trí tuệ người AD cho có liên quan đến việc suy giảm nơ ron khớp nối thần kinh não Sự nơ ron làm teo não gây thối hóa vùng chức thùy thái dương thùy đỉnh, phần thùy trán hồi đai Các kết ảnh não chụp phương pháp cộng hưởng từ (MRI) chụp positron cắt lớp (PET) cho thấy giảm kích cỡ não số vùng định có liên quan đến q trình suy giảm trí nhớ vừa sang giai đoạn mắc AD Hình 2.3 cho thấy não người bình thường (A, B) não người mắc AD (C, D) theo góc chụp khác Kể từ thời điểm phát AD đến nay, nguyên nhân gây AD chưa xác định cách cụ thể Tuy vậy, có ba giả thuyết thể ngun nhân giả thuyết cholinergic, giả thuyết protein tau giả thuyết amyloid Trong đó, giả thuyết amyloid nghiên cứu rộng rãi với lượng thông tin liệu lớn so với hai giả thuyết cịn lại Lộ trình gây AD theo giả thuyết amyloid thể hình 2.7 2.3 Cấu trúc Aβ Hai dạng chủ yếu Aβ Aβ40 Aβ42 Sự khác biệt Aβ40 Aβ42 Aβ42 có thêm aa cuối Vì Aβ trạng thái monomer tích tụ nhanh dung mơi nên khó xác định cấu trúc Dạng tích tụ Aβ có nhiều kính cỡ khác nhau, tùy vào kích thước tích tụ mà phân loại thành cấu trúc oligomer hay sợi Các sợi amyloid có chung cấu trúc phiến β đối song vùng lõi với phiến β nằm song song vng góc với trục sợi 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo sợi protein Yếu tố ảnh hưởng đến hành vi tạo sợi Aβ42 chia làm hai nhóm chính: ảnh hưởng từ bên cấu trúc protein ảnh hưởng môi trường Nhóm bao gồm tính chất vị trí aa chuỗi, vịng thơm, điện tích, độ kị nước, cấu trúc N* - cấu trúc monomer tách từ cấu trúc sợi Aβ độ bền học sợi Hình 2.11 Quá trình tạo sợi Aβ Aβ đơn phân tử (monomer) kết tụ thành đa phân tử (oligomer), sau oligomer phát triển thành tiền sợi, tiền sợi kết tụ với tạo thành sợi trưởng thành Các yếu tố môi trường nhiệt độ, nồng độ pH, nồng độ muối… Quá trình tạo sợi chia thành hai giai đoạn, monomer Aβ tích tụ để tạo thành cấu trúc oligomer, giai đoạn xảy chậm gọi giai đoạn mầm (hay giai đoạn ủ) (Hình 2.11) Sau đó, oligomer tăng kích cỡ để hình thành tiền sợi cuối sợi trưởng thành 2.5 Các phương pháp ức chế thông qua đột biến Một số đột biến ngăn chặn trình tiến triển AD, có số đột biến có tác dụng ngược lại Vùng acid amin 21-23 (vùng turn) chuỗi Aβ đóng vai trị quan trọng q trình tạo sợi Các đột biến Flemish (A21G), Dutch (E22Q), Italian (E22K), Arctic (E22G), Iowa (D23N), Osaka ( E22Δ) minh chứng cụ thể cho nhận xét Các đột biến đầu N (acid amin 1-8 Aβ40 1−16 Aβ42) English (H6R), Taiwanese (D7H ) Tottori (D7N ) làm tăng độc tính Aβ Đột biến D1Y làm chậm q trình tích tụ Aβ, đột biến A2F làm tăng độc tố tăng độ kị nước đầu N Đột biến hai điểm D1E-A2V ảnh hưởng đến trình tạo sợi Aβ40 Loại bỏ acid amin thay axít glutamic vị trí thứ axít pyroglutamate, chuỗi peptide Aβ(pE3-42) tích tụ nhiều nhanh, tăng độ bền sợi gây độc cho tế bào khác Đột biến A2V làm tăng trình tạo mảng Aβ40, pha trộn Aβ40 dạng tự nhiên đột biến A2V lại làm giảm độc tố Aβ40 Đột biến A2T đẩy lùi AD Các đột biến đuôi C ảnh hưởng nhiều đến cấu trúc động học Aβ Đột biến A30W M35C làm giảm phản ứng oxy hóa Đột biến G33V-V36P-G38V G33V-V36NG38L làm Aβ40 bị “Aβ42 hóa” Aβ42 thành “siêu-Aβ42” Nhiều nghiên cứu tập trung thực đột biến để phá vỡ cấu trúc mơ típ Glycine vị trí 29, 33, 37 38 để khảo sát vai trò cấu trúc đuôi C Các đột biến G29L, G33L, G37L làm giảm độc tính Aβ Đột biến G37V làm giảm độc Aβ42 thông qua thay đổi hình thái sợi CHƯƠNG CƠ SỞ LÝ THUYẾT VÀ PHƯƠNG PHÁP Các tương tác protein 3.1 Việc hình thành nên cấu trúc ba chiều protein kết cân tương tác aa với với dung môi Các tương tác protein bao gồm hai loại tương liên kết cộng hóa trị liên kết khơng có cộng hóa trị, bao gồm tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương tác van der Waals, tương tác hydrophobic (kị nước) Cơ sở lý thuyết mô động lực học phân tử 3.2 Xem hệ protein tập hợp nguyên tử với tọa độ ban đầu có sẵn, để tính tốn đại lượng hệ cần phải có ba phần chính: Thế tương tác hạt; giải phương trình chuyển động (giải thuật Verlet; Verlet vận tốc; leap-frog); công thức để tính đại lượng hệ lực, lượng (phương trình Langevin) Chi tiết phần trình bày cụ thể sau: 3.2.1 Thế tương tác Thế tương tác học phân tử viết dạng tổng hàm số dựa lực tương tác xuất protein, hàm số cần tham số để tính tương tác nguyên tử mô động lực học phân tử Đối với trường lực khác nhau, hàm có dạng cụ thể khác nhau, dạng chung hàm có dạng sau: 𝑈(𝑟) = 𝑈𝑠𝑡𝑟𝑒𝑡𝑐ℎ + 𝑈𝑏𝑒𝑛𝑑 + 𝑈𝑑𝑖ℎ𝑒𝑑𝑟𝑎𝑙 + 𝑈𝑒𝑙𝑒𝑐𝑡𝑟𝑜𝑠𝑡𝑎𝑡𝑖𝑐 + 𝑈𝑣𝑑𝑊 (3.1) Trong Ustretch, Ubend Udihedrals lượng có liên kết cộng hóa trị ; Uelectrostatic UvdW lương khơng có liên kết cộng hóa trị 3.2.2 Phương trình Langevin Trong phương pháp động lực học phân tử, chuyển động hệ nguyên tử giả sử tuân theo học cổ điển mà sở quan trọng định luật II Newton Chúng ta dùng học cổ điển ngun tử xem hạt thống không sâu vào thay đổi cấu trúc bên chúng Nếu xem hệ sinh học tập hợp phân tử, mô động lực học phân tử (MD) sử dụng lý thuyết học cổ điển để mô tả chuyển động hạt tính tốn tương tác hạt (ngun tử) nhằm mô tả quỹ đạo hệ sinh học giúp hiểu cấu trúc chế hoạt động hệ vi mơ Tuy nhiên ngồi việc tn theo phương trình tất định, hệ cịn chịu tác động yếu tố ngẫu nhiên chuyển động nhiệt hỗn loạn gây người ta sử dụng phương trình Langevin Như vậy, phương trình Langevin có nguồn gốc phương trình Newton cộng với lực ngẫu nhiên để mô tả nhiệt độ lực ngẫu nhiên tuân theo phân bố Gauss Lời giải toán chuyển động chiều hạt vi mơ nhiệt độ cố định tn theo phương trình Langevin mở rộng với ba thành phần chính: Lực tương tác, lực ma sát lực ngẫu nhiên: 𝑚𝑥̈ (𝑡) = 𝐹(𝑡) − 𝜁𝑥̇ (𝑡) + 𝛤(𝑡), (3.2) Trong đó: m: khối lượng nguyên tử 𝐹: lực tác dụng lên nguyên tử gây tương tác 𝐹=− 𝜕𝑈(𝑥) 𝜕(𝑥) , U(x) tính theo công thức (3.1) ζ: Hệ số ma sát dung mơi lên hạt Γ: lực ngẫu nhiên có phân bố Gauss với trung bình khơng, gọi 𝛿(𝑡 ′ ) hàm delta Dirac hàm tương quan theo thời gian Γ thỏa mãn định luận biến thiên – tiêu tán [181], 〈𝛤(𝑡)𝛤(𝑡 + 𝑡′)〉 = 2𝜁𝑘𝐵 𝑇𝛿(𝑡 ′ ) Theo định lý Stokes [182], 𝜁 = 6πηr với η độ nhớt dung môi r bán kính hạt hình cầu Tuy nhiên, mơ phỏng, lực ngẫu nhiên khó khống chế nhiệt độ cách xác nên phần mềm Gromacs khống chế nhiệt thơng qua bể nhiệt kiểm sốt thermostat khác Do Gromacs người ta sử dụng phương trình Newton kiểm sốt thermostat khác nói người ta dùng phương trình Langevin mở rộng 3.2.3 Giải phương trình chuyển động Tọa độ vận tốc nguyên tử hệ theo thời gian tính theo giải thuật Verlet, Verlet vận tốc leap-frog Ý tưởng chung ba thuật toán gán tọa độ vận tốc ban đầu cho hạt tổng lực tác dụng lên hạt đạo hàm tương tác Trong phần mềm GROMACS, giải thuật leap-frog mặc định sử dụng để tính tích phân chương trình chuyển động Giải thuật Verlet vận tốc cho phép tính đồng thời vị trí vận tốc nguyên tử lựa chọn tùy vào người dùng muốn tăng độ xác 3.3 Thiết lập cân hệ protein Tọa độ ban đầu protein lấy từ ngân hàng liệu protein Protein nhúng vào hộp chứa đầy nước kích thước hộp phải đủ lớn để phù hợp với kích thước protein Các ion bổ sung vào hộp để trung hịa điện tích đạt nồng độ phù hợp với điều kiện thực nghiệm Sau hệ trải qua q trình cực tiểu hóa lượng để loại bỏ liên kết xấu Tùy theo mục đích tốn mà hệ mô cân nhiệt độ, cân áp suất Ngoài ràng buộc holonomic ban đầu cần thiết để loại bỏ dao động lượng tử Trong luận án này, sử dụng giải thuật LINCS để ràng buộc tất liên kết ban đầu 3.4 Điều kiện biên dung môi hệ mô Để giảm hiệu ứng cạnh hệ hữu hạn, mô động lực học phân tử cho protein thường sử dụng điều kiện biên tuần hoàn Nguyên tắc biên tuần hoàn nguyên tử chuyển động khỏi hộp biên ảnh vào hộp biên đối diện Điều đảm bảo tổng số ngun tử hệ ln bảo tồn Mặt khác nước yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến độ xác tốn Để tính tương tác protein với nước phân tử nước với thường tốn thời gian tài ngun nên nhiều mơ hình nước khơng tường minh áp dụng để tiết kiệm thời gian chi phí tính tốn 10 CHƯƠNG ĐỘT BIẾN G37V LÀM GIẢM ĐỘC TỐ CỦA Aβ42 THÔNG QUA THAY ĐỔI HÌNH THÁI SỢI TỪ DẠNG LƯỚI SANG DẠNG ELLIPSE: NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM VÀ MƠ PHỎNG Phương pháp mơ thực nghiệm giới thiệu phần 3.6 3.7 Q trình cân hệ mơ phân tích tương tự phần 4.2.1 6.1 Thí nghiệm sống sót tế bào Aβ42 G37V Hình 6.1 so sánh tỉ lệ sống sót tế bào Aβ42 G37V nhiều nồng độ khác sau 72 Tỉ lệ sống sót tế bào gần 100% tất nồng độ G37V giảm tăng nồng độ Aβ42 Tại 20 μM, tỉ lệ sống sót tế bào thấp 50% tiếp xúc với Aβ42 100% tiếp xúc với G37V 6.2 Phổ CD Aβ42 G37V Trong ngày 01, tỉ lệ α G37V cao Aβ42, thành phần β G37V thấp Aβ42 Trong ngày 03, Aβ42 G37V có tỉ lệ β cao (~40%) giảm coil (~30%) Hình 6.2 cho thấy Aβ42 G37V trạng thái sợi sau 03 ngày Kết phù hợp với hồ sơ tạo sợi hai peptide (Hình 6.3) Tuy nhiên, so với Aβ42, chuyển đổi cấu trúc G37V liên quan đến giảm tỉ lệ α cấu trúc giảm từ 13% ngày 01 xuống cịn 6% ngày 03, cấu trúc α Aβ42 không thay đổi nhiều 6.3 Động học tích tụ Aβ42 G37V Hình 6.3 thể q trình tích tụ hai peptide sử dụng thí nghiệm huỳnh quang Th-T Hồ sơ tích tụ cho thấy trình tạo sợi Aβ42 G37V trình phụ thuộc mầm (nucleation-dependent) điển hình Kết cho thấy Aβ42 G37V có xu hướng tạo sợi trưởng thành cấu trúc oligomer nhỏ khơng có khác biệt rõ rệt vận tốc tạo sợi Aβ42 G37V Những kết việc thay đổi Gly Val acid amin 37 không ảnh hưởng đến trình tạo sợi vận tốc tạo sợi 22 Hình 6.1 So sánh mức độ sống sót tế bào sau trộn lẫn với Aβ42 G37V kết phân tích sau 72 h Hình 6.3 Q trình tạo sợi Aβ42 G37V sử dụng thí nghiệm huỳnh quang Th-T 6.4 Hình 6.2 Phổ CD Aβ42 (A) Aβ42(G37V) (B) ngày 01 ngày 03 Hình thái tích tụ Aβ42 G37V phân tích qua ảnh TEM Hình 6.4 thể kết khảo sát hình thái tích tụ ảnh TEM sau 0, 24 72 Cả Aβ42 G37V tích tụ thành cấu trúc trật tự sau 24 72 giờ, hình thái tích tụ hồn tồn khác biệt Trong Aβ42 có hình thái tích tụ dạng lưới G37V tạo hạt đơn có hình dạng ê-lip Cấu trúc sợi Aβ42 trở nên đậm đặc dài sau 72h giờ, cấu trúc sợi G37V khơng thay đổi hình dạng hay kích thước, mà tăng số lượng hạt êlip Cấu trúc hạt ê-lip G37V có kích thước tương đối đồng với đường kính 50 nm, đường kính sợi Aβ42 khoảng 5-9 nm Kích thước sợi G37V lớn nhiều so với kích thước oligomer Aβ42 (5-25 nm) tương tự kích thước tiền sợi Aβ42 (40 nm) 23 6.5 Mô REMD Từ kết thực nghiệm đạt được, mơ REMD tiến hành để tìm hiểu khác biệt đặc tính cấu trúc dẫn đến khác biệt hình thái tích tụ Aβ42 G37V Kết mô động học phân tử cho Aβ42 G37V thực điều kiện với thời gian thực 1000ns, 210ns đầu dùng để cân hệ Hình 6.4 Hình thái tích tụ Aβ42 G37V sau 0, 24 72h 6.5.1 Cấu trúc bậc hai Aβ42 đột biến G37V Bảng 6.1 thể thành phần Bảng 6.1 Thành phần cấu trúc bậc hai Aβ42 G37V cấu trúc bậc hai peptide Content (%) β WT G37V Kết cho thấy hai chuỗi 21.95 ± 1.91 21.10 ± 3.36 peptide có nhiều cấu trúc β Tỉ α-helix 1.25 ± 0.30 2.69 ± 0.78 lệ phần trăm α β tương Turn 60.01 ± 7.72 60.89 ± 4.28 đương với kết thực nghiệm Coils 15.95 ± 3.23 15.32 ± 2.88 β-turn at 36-37 42.9 ± 1.5 β-hairpin 14.0 ± 1.8 91.55 ± 4.95 34.5 ± 4.75 ngày 01 Mặt khác, tính tốn, cấu trúc turn chiếm tỉ lệ cao cấu trúc coil cho hai chuỗi peptide, phân tích thực nghiệm cấu trúc coil có tỉ lệ cao turn 24 Sự khác biệt mơ thực nghiệm trạng thái monomer tạo sợi, Aβ tạo nhiều cấu trúc khác Tuy nhiên, kết mô thực nghiệm cho thấy đột biến G37V không làm ảnh hưởng đến thành phần cấu trúc bậc hai Aβ42 6.5.2 Bề mặt lượng tự Aβ42 đột biến G37V Hình 6.1 Năng lượng tự bề mặt Aβ42 Aβ42(G37V) hàm hai thành phần V1 V2 Các cấu hình biểu diễn ghi nhận phương pháp clustering Thang đo lượng có đơn vị kBT Bề mặt phẳng lượng tự (FES) cấu trúc phổ biến Aβ42 G37V thể hình 6.6 Ngoại trừ cấu hình S5, cấu hình cịn lại đếu có cấu trúc phiến β, cấu hình S3 S4 có ba phiến β Trong tất cấu hình Aβ, có S1 chiếm 7% tỉ lệ α, cấu hình cịn lại khơng có cấu trúc α Thành phần coil thay đổi từ 5-25% turn nằm khoảng 55-75% Trong xu hướng với Aβ42, đột biến G37V có cấu trúc β tất cấu hình phổ biến Đối với Aβ42, tổng cộng cấu hình phổ biến có chứa cấu trúc β 79.1% G37V 100% Kết phân tích FES có xu hướng với kết phân tích cấu trúc bậc hai 6.5.3 Phân tích cấu trúc C Quan sát phân bố thành phần β acid amin Aβ42 cho thấy cấu trúc β có tỉ lệ cao vùng kị nước trung tâm (acid amin 18-23) đuôi C chuỗi (acid amin 31-35, 39-41) (hình 6.5) Do cấu trúc C Aβ42 ổn định đầu N, kết phù hợp với nghiên cứu thực nghiệm Luhrs cộng C vùng có xu hướng tạo sợi nhiều Cũng tương tự Aβ42, cấu trúc β đột biến G37V chiếm tỉ lệ cao acid amin 18-21, 31-35 39-41 Thành phần α G37V tăng nhẹ so với Aβ42, chiếm tỉ lệ cao acid amin 10-21 (hình 6.5) G37V khơng làm 25 thay đổi tỉ lệ coil tồn chuỗi thay đổi phân bố acid amin Phân bố cấu trúc bậc hai G37V không khác biệt nhiều với Aβ42 cho thấy kết mơ có xu hướng với thực nghiệm Tuy nhiên, đột biến G37V làm tăng cấu trúc β-turn acid amin 36-37 β-hairpin đuôi C Aβ42 từ 42.9 ± 1.5 14.0 ± 1.8 lên 91.55 ± 4.95 34.5 ± 4.75% (Bảng 6.1) Điều cho thấy thay Gly Val làm biến đổi cấu trúc đầu C Aβ42 6.5.4 Phân bố khoảng cách cầu muối Hình 6.7 Phân bố khoảng cách cầu muối Asp23−Lys28 Aβ42 đột biến G37V Khoảng cách trung bình Aβ42 đột biến G37V 6.74, 7.07 Å Cầu muối Asp23−Lys28 tạo nên cấu trúc uốn mơ hình sợi Aβ40, Aβ42 với cấu trúc β, cầu muối có vai trị quan trọng việc tạo sợi Hình 6.7 cho thấy khoảng cách trung bình cầu muối Asp23−Lys28 6.74 Å Aβ42 tăng lên 7.07 Å có đột biến G37V Hơn nữa, xuất đỉnh thứ hai khoảng cách 8.8 Å phổ phân bố có đột biến G37V cho thấy tương tác Asp23−Lys28 yếu cấu hình uốn đột biến G37V linh hoạt so với Aβ42 Sự xuất đỉnh thứ hai cho có thay đổi khoảng cách đầu cuối peptide (de-e), thành phần β helix 26 CHƯƠNG HƯỞNG TỐC ĐỘ TÍCH TỤ CỦA AMYLOID BETA BỊ ẢNH BỞI THÀNH PHẦN BETA TRONG TRẠNG THÁI MONOMER Phương pháp mô giới thiệu phần 3.6 7.1 Khảo sát cân hệ mô Sự ổn định hệ q trình mơ REMD thể thơng qua việc phân tích q trình trao đổi khơng gian 12 Bên cạnh thay đổi độ dịch chuyển quân phương, tổng lượng, thành phần cấu trúc bậc hai theo thời gian khảo sát để đảm bảo q trình mơ đạt trạng thái ổn định Ngoài trùng khớp thành phần β nhiệt dung hai cửa sổ thời gian củng cố hội tụ liệu 20 hệ protein.Tất phân tích nhằm khảo sát cân hệ mơ trình bày chi tiết phụ lục chương 7, mục P7.2 7.2 Tốc độ tạo sợi amyloid beta bị ảnh hưởng thành phần beta trạng thái monomer Hình 7.3 Sự phụ thuộc hàm tuyến tính hàm ln vận tốc tạo sợi vào thành phần β (phía phía tương ứng) Chấm màu đỏ WT Hình 7.3 thể phụ thuộc vận tốc tạo sợi lên thành phần β trạng thái monomer hai trường hợp theo hàm mũ theo hàm tuyến tính Theo đó, ảnh hưởng thành phần β lên vận tốc tạo sợi có độ tương quan cao (R=0.85) mô tả theo hàm tuyến tính có dạng: κmut/κwt = -0.29 + 0.0635β Trong trường hợp biểu diễn 27 theo hàm mũ vận tốc tạo sợi, độ tương quan R=0.80 mô tả theo hàm: κ = κ0 exp(cβ), c = 0.071, κ0 số β tính theo % Hệ số tương quan cao cho phép thừa nhận đột biến có tốc độ tạo sợi nhanh có thành phần β cao trạng thái monomer ngược lại, đột biến có tốc độ tạo sợi thấp có tỉ lệ cấu trúc β thấp trạng thái monomer Như vậy, lần đầu tiên, cách tường minh, nghiên cứu cho thấy tỉ lệ cấu trúc β trạng thái monomer kiểm soát xu hướng tạo sợi Aβ, quy luật với loại protein khác 7.3 Tốc tộ tạo sợi không tương quan với thành phần helix, turn coil Sự thay đổi không đáng kể cấu trúc α tập đột biến dẫn đến độ tương quan thành phần α vận tốc tạo sợi thấp, R=0.16 So với α, turn thay đổi khoảng rộng từ 31.81 (D23N) đến 73.54% (I41T-A42N), hệ số tương quan turn tốc độ tạo sợi lớn α, R=0.46% Với R=0.46 kết luận cấu trúc turn có tương quan với tốc độ tạo sợi protein, kết thể liên kết cầu muối Asp23-Lys28 đóng vai trị quan trọng q trình hình thành sợi Tương tự α, độ tương quan coil tốc độ tạo sợi thấp, R=0.15 Những kết tính tốn động học cho thấy tốc độ tạo sợi thực nghiệm tương quan tốt với hàm tuyến tính hàm mũ với cấu trúc β không tương quan với cấu trúc bậc hai lại (α, turn coil) Ảnh hưởng điện tích, độ kị nước lượng chuyển đổi từ cấu trúc α sang β lên tốc độ tạo sợi Aβ 7.4 7.4.1 Tốc độ tạo sợi tương quan với thay đổi lượng tự ΔΔG chuyển từ cấu trúc α sang β Năng lượng chuyển đổi từ cấu trúc α sang β tính theo cơng thức ΔΔG =ΔΔGβ-coil + ΔΔGcoil-α Sự thay đổi lượng tự từ trạng thái β sang cấu trúc ngẫu nhiên coil ΔΔGβ-coil, tính cơng thức: ΔΔGβ-coil = 13.64(Pβwt Pβmut), Pβwt Pβmut xu hướng tạo β acid amin thể tự nhiên đột biến tính điểm gây đột biến; 13.64 hệ số chuyển đổi đơn vị sang kJ/mol Giá trị Pβ 20 aa sử dụng từ nghiên cứu thực nghiệm trước 28 Mayo cộng Sự thay đổi lượng từ trạng thái coil sang xoắn α, ΔΔGcoil-α, tính cơng thức ΔΔGcoil-α = RTln(Pαwt/Pαmut), Pαwt Pαmut tỉ lệ xoắn α chuỗi peptide thể tự nhiên đột biến tính điểm gây đột biến, R=0.008314 kJmol-1K-1 số khí Tỉ lệ thành phần α tính phần mềm AGADIR Hệ số tương quan ΔΔG vận tốc tạo sợi không cao (R=0.40), điều củng cố thêm ảnh hưởng thành phần β đến tốc độ tạo sợi Hạn chế đột biến tập liệu tổng điện tích có đột biến không thay đổi so với thể tự nhiên, Chiti Dobson nghiên cứu chọn 15 chuỗi từ protein khác có điện tích thay đổi ảnh hưởng đột biến thu hệ số tương quan κ ΔΔG tương đối cao, R=0.71 Chúng tơi tính tốn lại tập liệu Chiti với toàn 27 protein bao gồm protein khơng thay đổi điện tích có đột biến Kết cho thấy khơng có tương quan ΔΔG vận tốc tạo sợi, hệ số tương quan R=0.41, kết tương đương sử dụng tập liệu nghiên cứu (R=0.40) Tương quan vận tốc tạo sợi thực nghiệm với thay đổi điện tích độ kị nước tồn chuỗi có đột biến Theo Chiti cộng sự, thay đổi độ kị nước chuỗi có đột biến 7.4.2 tính theo cơng thức ΔHydr = Hydrwt – Hydrmut, Hydrwt Hydrmut độ kị nước tương ứng thể tự nhiên đột biến Tương tự, thay đổi điện tích hệ có đột biến tính tốn theo cơng thức ΔCharge = |Charge mut| |Chargewt|, Chargemut Chargewt điện tích tương ứng đột biến thể tự nhiên ΔHydr Δcharge tính cho tất 19 chuỗi Các giá trị độ kị nước điện tích cho 20 aa tham khảo tài liệu Dobson Hệ số tương quan vận tốc tạo sợi thực nghiệm, ΔHydr ΔCharge R= -0.661 -0.683 ( Hình 7.9b, 7.9c) Những giá trị tương ứng 0.545 0.721 nghiên cứu Dobson Có thể thấy, mức tương quan điện tích độ kị nước với tốc độ cuộn chuỗi thấp so với thành phần β Một cách tổng quát, vận tốc tạo sợi ước tính theo công thức: ln( κmut/κwt) = A.ΔΔG + B.ΔHydr + C.ΔCharge 29 (7.3) Trong A, B, C hệ số độ dốc thu từ đường fit tuyến tính ln(κmut/κwt) ΔHydr, ΔΔG ΔCharge Theo hình 7.9, A, B C -0.081, 0.063 -0.304 Mặc dù tốc độ tạo sợi tương quan với ΔΔG, kết hợp với độ kị nước điện tích theo cơng thức (7.3), mức tương quan tăng lên R = 0.863 (hình 7.9d) Hệ số tương đương với mức tương quan vận tốc tạo sợi thành phần cấu trúc β Bên cạnh đó, hệ số độ dốc hình 7.9d 1.064 (gần 1), tốc độ tạo sợi theo tính tốn thực nghiệm gần trùng Hình 7.9 Sự phụ thuộc theo hàm ln tốc độ tạo sợi thực nghiệm lên lượng chuyển đổi từ trạng thái α sang β (a), độ kị nước (b), điện tích (c), tốc độ tạo sợi tính tốn theo cơng thức (7.3) 30 KẾT LUẬN Các kết luận án Q trình thực luận án giúp đưa số kết mà nghiên cứu trước chưa công bố, cụ thể sau: Bằng mô động lực học phân tử thực nghiệm ống nghiệm, nghiên cứu cho thấy Aβ41 có hành xử tích tụ độc tính giống Aβ40 Aβ42 từ cho thấy Ala42 acid amin có tính then chốt định đến tính chất khác biệt Aβ42 so với Aβ40 Kết nghiên cứu cho thấy Aβ42-WT giàu β-turn đầu C Aβ40-WT hoàn tồn phù hợp với kết thực nghiệm trước Cấu trúc β-hairpin vị trí 36-37 xuất Aβ42 không xuất Aβ40 Đột biến Aβ40(VPV) khơng hồn tồn bị “Aβ42-hóa” gia tăng cấu trúc β hairpin acid amin 36-37 mà gia tăng thành phần cấu trúc β toàn chuỗi Đột biến Aβ42(VPV) trở thành “siêu-Aβ42” dựa gia tăng cấu trúc β-turn β-hairpin acid amin 36-37 đầu C chuỗi tăng độ kị nước toàn phần Các kết tương tự với đột biến VNL Phá vỡ cấu trúc mô típ Glycine G25G29G33G37 thơng qua đột biến G37V hướng tiếp cận in vitro in silico cho thấy đột biến làm giảm mạnh độc tố Aβ42 Nguyên nhân yếu suy giảm độc tố khác biệt hình thái tích tụ Đột biến G37V tạo thành mảng tích tụ có hình dạng ê-lip thay sợi lưới Aβ-WT Kết mơ giải thích chế thay đổi hình thái tích tụ thơng qua việc tăng thành phần cấu trúc β-turn β-hairpin acid amin 36-37 cầu muối Asp23-Lys28 linh hoạt có đột biến Sử dụng giá trị vận tốc tạo sợi 19 đột biến Aβ42 phân tích thực nghiệm, mô tiến hành cho 19 đột biến để tìm thành phần cấu trúc bậc hai trạng thái monomer Kết mô cho thấy thành phần cấu trúc β trạng thái monomer Aβ42 kiểm soát 31 tốc độ tạo sợi loại protein Hàm phụ thuộc tốc độ tạo sợi vào thành phần β thể dạng tuyến tính hàm mũ thể thành phần β lớn hơn, tốc độ tạo sợi nhanh Chúng đưa công thức cho phép xác định tốc độ tạo sợi protein thực nghiệm dựa thành phần β cấu trúc monomer, giá trị tính tốn mơ máy tính Nghiên cứu bước khởi đầu việc ước tính vận tốc tạo sợi chuỗi protein thực nghiệm dựa tính tốn máy tính Tuy nhiên hệ số mơ hình phụ thuộc cần điều chỉnh tập liệu lớn với nhiều loại protein khác Các đóng góp khoa học luận án Trong Ile41 Ala 42 Ala42 có vai trị chủ chốt việc định khác biệt Aβ40 Aβ42 Đột biến ba điểm G33V-V36P-G38V làm Aβ40 có cấu trúc động học tích tụ giống Aβ42 làm Aβ42 có cấu trúc trật tự hơn, tăng vận tốc tạo sợi độc tố Đột biến G37V phá vỡ cấu trúc mơ típ glycine đầu C chuỗi Aβ42, làm thay đổi hình thái tích tụ Aβ42 từ dạng lưới sang dạng ê-líp giảm khả gây độc tế bào Lần chứng minh cách tường minh phụ thuộc vận tốc tạo sợi lên thành phần β trạng thái monomer protein Dựa vào công thức phụ thuộc theo hàm mũ hàm tuyến tính, vận tốc tạo sợi protein suy luận từ công thức thông qua giá trị thành phần β tính từ mơ Hướng phát triển luận án - Từ nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng Ile 41 Ala42 lên khác biệt cấu trúc động học Aβ40 Aβ42, hướng đến ý tưởng thay đổi vị trí hai acid amin mô cấu trúc đảo ngược dạng đột biến 32 - Trong nghiên cứu phụ thuộc vận tốc tạo sợi lên thành phần β trạng thái monomer, tập liệu 20 protein gồm Aβ42 thể tự nhiên 19 đột biến Để tăng thêm tính tổng qt tốn, tập liệu lớn với nhiều protein khác cần thiết - Chuột nhắt với đột biến ba điểm Aβ42(Arg5Gly-His13Arg-Tyr10Phe) cho làm ngăn chặn tiến trình phát triển AD chuột cống với đột biến His13Arg lại đẩy nhanh trình phát triển bệnh AD Phát thú vị chưa khảo sát lý thuyết, tốn mà chúng tơi thực tương lai - Các đột biến vị trí số chuỗi Aβ40 cho có ảnh hưởng lớn đến cấu trúc động học Aβ40 Cụ thể đột biến A2V thay đổi hình thái tích tụ Aβ40 làm tăng độc tố đồng thời đẩy nhanh trình phát triển bệnh AD Ngược lại đột biến A2T làm chậm trình tạo Aβ giảm đám rối lắng đọng não Chúng dự định mô đột biến tương lai - Độ bền học cấu trúc sợi protein cho ảnh hưởng đến vận tốc tạo sợi protein Chúng dự định tính tốn tương quan độ bền học sợi vận tốc tạo sợi cho nhiều hệ so với kết công bố - Một số protein có cấu trúc IDP khác alpha synuclein, islet amyloid nguyên nhân bệnh Parkinson, tiểu đường tip Tìm hiểu chế gây bệnh protein thông qua cấu trúc động học protein hướng nghiên cứu thú vị tương lai 33 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Tạp chí quốc tế Nguyen Hoang Linh, Tran Thi Minh Thu, Phan Minh Truong, Pham Dang Lan, Man Hoang Viet, Phuong H Nguyen, T Ly Anh, Y-C Chen, and Mai Suan Li, Aβ41 Aggregates More Like Aβ40 Than Like Aβ42: In silico and in vitro Study, J Phys Chem B, 120, 7371-7379, 2016 Nguyen Hoang Linh*, Tran Thi Minh Thu*, Ly Anh Tu, C-K Hu, and Mai Suan Li, Impact of mutations at C-Terminus on structures and dynamics of Aβ40 and Aβ42: Molecular simulation study, J Phys Chem B, 121, 4341−4354, 2017 (*Contribute equally) Tran Thi Minh Thu, Nguyen Truong Co, Ly Anh Tu, and Mai Suan Li, Aggregation rate of amyloi beta peptide is controlled by beta-content in monomeric state, J Chem Phys 2019, 150, 225101 Tran Thi Minh Thu*, Shu-Hsiang Huang*, Ly Anh Tu, Shang-Ting Fang, Mai Suan Li, Yi-Cheng Chen, G37V mutation of Aβ42 induces a nontoxic ellipse-like aggregate: anin vitro and in silico study, Neurochemistry International 2019, 129, 104512.(*Contribute equally) Tran Thi Minh Thu, Huynh Phuoc Nguyen, Ly Anh Tu and Mai Suan Li, Structures of the C-terminally Truncated α-Synuclein: A Replica Exchange Molecular Dynamics Study, (Đang hoàn thiện thảo) Tạp chí nước 1.Tran Thi Minh Thu, Ly Anh Tu, and Mai Suan Li, Gly37Leu mutation reduces toxicity of amyloid beta 42 through enhanced the β-turn and β-hairpin structure at C-terminal, (Đang hoàn thiện thảo) Báo cáo Hội nghị quốc tế Nguyen Hoang Linh, Tran Thi Minh Thu, Phan Minh Truong, Pham Dang Lan, Man Hoang Viet, Phuong H Nguyen, T Ly Anh, Y-C Chen, and Mai Suan Li, Aβ41 Aggregates More Like Aβ40 Than Like Aβ42: In silico and in vitro Study, The Third International Conference On Computational Science and Engineering (ICCSE – 3), November 28-30, 2016, Poster presentation 34 2.Nguyen Hoang Linh, Tran Thi Minh Thu, Ly Anh Tu, C-K Hu, and Mai Suan Li, Impact of mutations at C-Terminus on structures and dynamics of Aβ40 and Aβ42: Molecular simulation study, The Third International Conference On Computational Science and Engineering (ICCSE – 3), November 28-30, 2016, Poster presentation (1st prize for best poster award) Huynh Phuoc Nguyen, Tran Thi Minh Thu and Mai Suan Li, Structures of the C-terminally Truncated α-Synuclein: A Replica Exchange Molecular Dynamics Study, 7th International Conference on the Development of Biomedical Engineering in Vietnam (BME7), International University VNUHCM, June 27-29, 2018, Poster presentation Nguyen Hoang Linh, Tran Thi Minh Thu, Ly Anh Tu, C-K Hu, and Mai Suan Li, Impact of mutations at C-Terminus on structures and dynamics of Aβ40 and Aβ42: Molecular simulation study, 7th International Conference on the Development of Biomedical Engineering in Vietnam (BME7), International University - VNUHCM, June 27-29, 2018, Poster presentation Tran Thi Minh Thu, Shu-Hsiang Huang, Ly Anh Tu, Shang-Ting Fang, Mai Suan Li, Yi-Cheng Chen, G37V mutation of Aβ42 induces a nontoxic ê-lip-like aggregate: anin vitro and in silico study, ICCSI, Quy Nhơn, October 27-31 November, 2018, Poster presentation Tran Thi Minh Thu, Nguyen Truong Co, Ly Anh Tu, and Mai Suan Li, Aggregation rate of amyloi beta peptide is controlled by beta-content in monomeric state, The Fourth International Conference On Computational Science and Engineering (ICCSE – 4), 2019, July 24-27, 2019, Oral presentation Tran Thi Minh Thu, Nguyen Truong Co, Ly Anh Tu, and Mai Suan Li, Aggregation rate of amyloi beta peptide is controlled by beta-content in monomeric state, International Symposium on Applied Science 2019 (ISAS – 2019), October 18-19, 2019, Poster presentation Báo cáo hội nghị nước 35 Tran Thi Minh Thu, Ly Anh Tu, and Mai Suan Li, Gly37Leu mutation reduces toxicity of amyloid beta 42 through enhanced the β-turn and βhairpin structure at C-termina, Hội nghị khoa học trường ĐHKHTN, ĐHQGHCM, 9-10 tháng 11 năm 2018, báo cáo oral Tran Thi Minh Thu, Ly Anh Tu, and Mai Suan Li, Gly37Leu mutation reduces toxicity of amyloid beta 42 through enhanced the β-turn and βhairpin structure at C-terminal, HỘI NGHỊ VẬT LÝ CHẤT RẮN VÀ KHOA HỌC VẬT LIỆU TOÀN QUỐC LẦN THỨ 11 (SPMS-2019), Trường Đại học Quy Nhơn, Bình Định, 2-4 tháng 11 năm 2019, báo cáo oral Đề tài nghiên cứu khoa học Sự phân rã sợi thăng giáng nhiệt Bexarotene, 66/2016/HĐKHCNTT, 2016-2017, Đề tài cấp Sở KH&CN TPHCM, Thành viên, nghiệm thu Ảnh hưởng macrolide lên trình cuộn protein từ ribosome, 179/2016/HĐ-KHCNTT, 2016-2018, Đề tài cấp Sở KH&CN TPHCM, Thành viên, nghiệm thu Tốc độ tích tụ Amyloid beta bị ảnh hưởng thành phần beta trạng thái monomer, 19/2017/HĐ-KHCNTT, 2017 – 2018, Đề tài thuộc chương trình vườn ươm, Viện Khoa học Cơng nghệ Tính tốn, Sở KH&CN TPHCM, Chủ nhiệm đề tài, Đã nghiệm thu Tương tác peptide amyloid beta với màng lipid ion đồng: Mô máy tính, 02/2018/Đ2/HĐ-KHCNTT, 2018-2020, Đề tài cấp Sở KH&CN TPHCM, Thành viên, thực Động học phân tử có định hướng: Kéo đa hướng tốc độ thấp, 07/2019/HĐKHCNTT, 2018-2020, Đề tài cấp Sở KH&CN TPHCM, Thành viên, thực Ảnh hưởng đầu C lên cấu trúc động học α-Synuclein: Hướng đến ức chế bệnh Parkinson, Đề tài loại C, cấp ĐHQG-HCM, Chủ nhiệm đề tài 36 ... triển luận án - Từ nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng Ile 41 Ala42 lên khác biệt cấu trúc động học Aβ40 Aβ42, hướng đến ý tưởng thay đổi vị trí hai acid amin mô cấu trúc đảo ngược dạng đột biến 32... cho thấy đột biến APP tạo nên mảng Aβ khơng hịa tan Các trường hợp mắc bệnh AD sớm chủ yếu di truyền chiếm 5% tổng số ca bệnh Nghiên cứu cấu trúc động học Aβ ảnh hưởng đột biến hướng đến giải... thẳng không phân nhánh cấu trúc bậc protein Cấu trúc bậc hai dạng cấu trúc cục phần chuỗi peptide Cấu trúc bậc hai gồm hai dạng chính: xoắn α, phiến β Cấu trúc bậc ba cấu trúc ba chiều thu gọn