Xây dựng bộ thuốc thử pyrosequencing xác định đột biến gen EGFR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HUỲNH VIẾT LỘC XÂY DỰNG BỘ THUỐC THỬ PYROSEQUENCING XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN EGFR Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số: 12310738 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP.HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2014 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: Ts.Bs Phạm Hùng Vân Cán chấm nhận xét 1: PGS.Ts Bùi Văn Lệ Cán chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Tấn Trung Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách khoa, Đại học Quốc Gia TP.HCM ngày 15 tháng 08 năm 2014 Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn thạc sĩ gồm: PGS.Ts Nguyễn Đức Lượng PGS.Ts Lê Thị Thủy Tiên PGS.Ts Bùi Văn Lệ Ts Nguyễn Tấn Trung Ts Trần Trung Hiếu Xác nhận Chủ tịch hội đồng đánh giá luận văn Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS.Ts Nguyễn Đức Lượng TRƯỞNG KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Huỳnh Viết Lộc MSHV: 12310738 Ngày, tháng, năm sinh: 14/08/1985 Nơi sinh: Lâm Đồng Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 604280 1- TÊN ĐỀ TÀI: “Xây dựng thuốc thử pyrosequencing xác định đột biến gen EGFR” 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: - Xây dựng thuốc thử pyrosequencing phát đột biến gen EGFR có độ nhạy độ đặc hiệu cao đáp ứng yêu cầu thuốc thử chuẩn đoán đột biến gen ứng dụng điều trị đích 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 01/2014 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 08/2014 5- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS PHẠM HÙNG VÂN Tp.Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 CHỦ NHIỆM BỘ MƠN ĐÀO TẠO CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS.PHẠM HÙNG VÂN TRƯỞNG KHOA LỜI CÁM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô môn công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, người tận tình dìu dắt, truyền đạt cho kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian tơi học tập chương trình đào tạo sau đại học Con xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Hùng Vân, người thầy tận tụy dạy bảo hướng dẫn hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ Con xin chân thành ghi ơn cha mẹ, người nuôi nấng dạy bảo nên người Cha mẹ chỗ dựa vững cho suốt thời gian theo học khóa học Tp Hồ Chí Minh, 08/2014 Huỳnh Viết Lộc i TĨM TẮT Xác định kiểu gen thụ thể phát triển biểu mô (Epidermal growth factor receptor: EGFR) xét nghiệm quan trọng trước định điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ liệu pháp điều trị trúng đích Giải trình tự trực tiếp ln coi phương pháp tiêu chuẩn xác định đột biến gen EGFR, nhiên phương pháp có độ nhạy thấp Pyrosequencing kỹ thuật giải trình tự khơng cần điện di với nhiều ưu điểm so với giải trình tự trực tiếp: độ nhạy cao, tự động, cho kết qủa nhanh có độ đặc hiệu cao Do chúng tơi tiến hành nghiên cứu “xây dựng thuốc pyrosequencing xác định đột biến gen EGFR” Bằng công cụ pyrosequencing, xét nghiệm đột biến EGFR tiến hành 100 mẫu FFPE Các mẫu FFPE lấy từ bệnh viện địa bàn TP Hồ Chí Minh, mẫu xác định ung thư phổi không tế bào nhỏ phân tích hình dạng tế bào thông qua nhuộm Hematoxylin-Eosin (HE) lame Tỷ lệ đột biến EGFR 67% (67/100), đột biến deletions chiếm tỷ lệ cao 76% (51/67) L858R 25% (17/67) đột biến giúp tăng hoạt hóa EGFR Trong nghiên cứu tỷ lệ đột biến EGFR nữ giới cao nam giới (84% so với 57%) Đồng thời mối liên hệ độ tuổi tỷ lệ đột biến ghi nhận, độ tuổi cao tỷ lệ đột biến EGFR tăng Với ghi nhận nghiên cứu chứng tỏ đột biến EGFR Việt Nam phần lớn đột biến có lợi cho liệu pháp EGFR-TKI Nghiên cứu pyrosequencing kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao, cơng cụ hữu ích phân tích đột biến EGFR ii ABSTRACT Epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations analysis is a highly useful test before require targeted therapy in non small cell lung cancer Direct sequencing is a standard method to detect EGFR mutation, but low sensitivity is a weak point of the method Pyrosequencing is a non-electrophoretic DNA sequencing technique with number of advantages compared with direct sequencing: high sensitivity, speed, automation and specific 100 non small cell lung cancer FFPE samples was detected EGFR mutation by pyrosequencing, the samples were identified as non small cell lung cancer in cell shape determined by HematoxylinEosin(HE) staining, the samples was provided from the hospital in Ho Chi Minh city EGFR mutation positive rate is 67% (67/100), deletions in exon 19 is the most common mutation 76% (51/67), L858R 25% (17/67) EGFR mutations were more frequently in female than male (84% VS 57%) The present study shows the relation between age and mutations rate, the rate of mutations increasing proportional with the age The research demonstrates EGFR mutations in Vietnam largely beneficial mutations in EGFR-TKI therapy Research has also shown that the sensitivity and high specificity of pyrosequencing is an useful tool in analyzing EGFR mutations iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, Luận văn kết nghiên cứu riêng tôi, không chép Nội dung Luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang mạng ngồi nước theo danh mục tài liệu tham khảo Luận văn Tác giả Luận văn Huỳnh Viết Lộc iv MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i TÓM TẮT ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi I MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt Vấn Đề 1.2 Mục Tiêu Nghiên Cứu Của Đề Tài 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.4 Nội dung nghiên cứu 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vài nét ung thư ung thư phổi 2.1.1 Ung thư 2.1.2 Ung thư phổi 2.2 Tình hình ung thư phổi giới Việt Nam 2.2.1 Ung thư phổi giới .7 2.2.2 Ung thư phổi Việt Nam 2.3 Một số phương pháp điều trị ung thư phổi 10 2.3.1 Ung thư phổi tế bào nhỏ 10 2.3.2 Ung thư phổi không tế bào nhỏ .10 2.4 Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô EGFR 11 2.4.1 EGFR 11 2.4.2 EGFR điều trị đích ung thư phổi không tế bào nhỏ 13 2.5 Các phương pháp phát đột biến gen EGFR 13 v 2.5.1 Các phương pháp phát đột biến gen EGFR 14 2.5.2 Pyrosequencing .16 III Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu 19 3.1 Vật liệu .19 3.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 19 3.1.2 Thiết bị dụng cụ 19 3.1.3 Hóa chất 20 3.2 Phương pháp nghiên cứu 21 3.2.1 Thiết kế mồi 21 3.2.2 Kiểm tra primer sau thiết kế điều kiện thực tế 22 3.2.2.1 PCR khuếch đại exon 18, 19, 20 exon 21 gen EGFR 22 3.2.2.2 Thực pyrosequencing 24 3.2.3 So sánh thuốc thử pyrosequencing phát đột biến gen EGFR, NamKhoa-EGFRpyro Q24 EGFR pyro kit (24) 28 3.2.3.1 Ly trích DNA từ mẫu bệnh đóng paraffin FFPE 30 3.2.3.2 Xác định đột biến gen EGFR 10 mẫu kiểm chuẩn thuốc thử NamKhoa_EGFR pyro Q24 EGFR pyro kit (24) 32 3.2.3.3 Phân tích, so sánh kết thuốc thử trình lên EMQM 39 3.2.4 Xác định đột biến gen EGFR 100 mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ 40 IV KẾT QUẢ 42 4.1 Kết thiết kế mồi 42 4.1.1 Kết thiết kế mồi sử dụng phần mềm primer premier 5.0 .42 4.1.2 Kết kiểm tra độ đặc hiệu mồi trang mạng NCBI 43 4.1.3 Kết kiểm tra độ đặc hiệu mồi điều kiện thực tế 44 4.1.4 Kết xác định số LOD cho vị trí đột biến 719, 768, 790, 858, 861 deletions .43 4.2 Kết xác định đột biến EGFR thuốc thử NamKhoa_EGFR pyro Q24 EGFR pyro kit (24) 49 4.3 Kết xác định đột biến gen EGFR 100 bệnh nhân UTPKTBN 51 vi 4.3.1 Đột biến EGFR theo giới tính .54 4.3.2 Đột biến EGFR xét theo độ tuổi 55 V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Đề nghị .58 Tài Liệu Tham Khảo .59 Tài Liệu Tham Khảo internet 60 PHỤ LỤC 61 vii L2-096161675 HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 85 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học L3_086173702 HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 86 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học L4_076173376 HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 87 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 88 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học L5_ 066173117 HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 89 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học L6_ 016171710 HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 90 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học L7_ 026172076 HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 91 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 92 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học L8_ 036172426 HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 93 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học L9_ 046171814 HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 94 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học L10_ 056171854 HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 95 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 96 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học b Hình điện di kết mẫu bệnh nhân HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 97 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 98 Chuyên ngành: Cơng Nghệ Sinh Học LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Huỳnh Viết Lộc Ngày, tháng, năm sinh: 14-08-1985 Nơi sinh: Lâm Đồng Địa liên lac: Số 12, Thôn Suối Thông C, Xã Tu Tra, Huyện Đơn Dương, Tỉnh Lâm Đồng Điện thoại liên lạc: 0936.753.432 Quá trình đào tạo - Năm 2005-2009: Sinh viên hệ đại học quy, Ngành Cơng Nghệ Sinh Hoc, Đại học Nơng Lâm TP.HCM - Năm 2009: tốt nghiệp kỹ sư ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm TP.HCM - Năm 2012-2014: Học viên cao học hệ quy, Ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa TP.HCM Q trình cơng tác - Năm 2009 đến nay: Cơng tác công ty TNHH TMDV Nam Khoa HVTH: Huỳnh Viết Lộc-12310738 99 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học ... TÀI: ? ?Xây dựng thuốc thử pyrosequencing xác định đột biến gen EGFR? ?? 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: - Xây dựng thuốc thử pyrosequencing phát đột biến gen EGFR có độ nhạy độ đặc hiệu cao đáp ứng yêu cầu thuốc. .. thử pyrosequencing phát đột biến gen EGFR, NamKhoa _EGFR pyro Q24 EGFR pyro kit (24) EGFR pyro kit (24) thuốc thử xác định đột biến gen EGFR người, sử dụng kỹ thuật pyrosequencing công ty Qiagen... Sinh Học 3.2.3.2 Xác định đột biến gen EGFR 10 mẫu kiểm chuẩn thuốc thử NamKhoa _EGFR pyro Q24 EGFR pyro kit (24) a/ Xác định đột biến gen EGFR 10 mẫu kiểm chuẩn thuốc thử NamKhoa _EGFR pyro Q24 Chuẩn